任小雙 張?zhí)m 張燕寧

摘要 介紹了哺乳動物和一些代表昆蟲的線粒體凋亡途徑研究進展，特別是與線粒體途徑密切相關的凋亡調控因子，如細胞色素C，caspases家族，Bcl-2家族等的功能作用，闡述了線粒體在昆蟲細胞凋亡中的作用，為進一步研究昆蟲細胞凋亡機制以及發(fā)展以昆蟲細胞凋亡因子為靶標的特異性殺蟲劑提供理論基礎。

關鍵詞 昆蟲；細胞凋亡；線粒體；細胞色素C；胱天蛋白酶；Bcl-2家族

中圖分類號 Q962 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）03-0167-04

Abstract We introduced the research progress of mitochondria apoptosis pathways in some representative insects and mammals， especially apoptosis regulatory factors closely related to mitochondrial pathway， such as cytochrome C， caspases family， Bcl2 family. The role of mitochondria in insects cell apoptosis was elaborated， so as to provide theoretical basis for studing apoptosis mechanism in insect cells and developing the apoptosis factor as the specific target of pesticides.

Key words Insects；Cell apoptosis；Mitochondria；Cytochrome C；Caspases；Bcl2 family

細胞凋亡（apoptosis）是受一系列基因嚴格調控、按照特定規(guī)律和程序進行的一種主動死亡方式，也可稱作細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD），Kerr等[1]于1972年首次提出這一概念。凋亡與增殖、分化共同調控機體的穩(wěn)定，除了維持自身代謝需要、主動去除多余的或不需要的細胞外，還在抑制和治療癌癥方面發(fā)揮著重要作用。細胞對外界刺激很敏感，如化學藥物、紫外線等都可誘導凋亡發(fā)生[2-3]，而凋亡途徑一旦紊亂，則會導致疾病發(fā)生，如癌癥等[4-5]。

細胞凋亡的信號轉導機制十分復雜，研究主要集中在哺乳動物、果蠅（Drosophila melanogaster）和線蟲（Caenorhabditis elegans）等中。線蟲細胞凋亡通路比較簡單，而在哺乳動物中至少存在3條信號轉導通路，即線粒體通路，也稱為線粒體內途徑（mitochondria mediated apoptosis pathway）、死亡受體通路（death receptor pathway，即外途徑）和內質網通路（endoplasmic reticulum associated death）[6]。線粒體通路是細胞凋亡最經典的通路。線粒體接收到凋亡信號后，跨膜電位下降，線粒體膜通透化，釋放膜間隙蛋白如線粒體促凋亡蛋白（second mitochondria-derived activator of caspases，Smac）、細胞色素C等到胞質中，激活胱天蛋白酶（caspases），或獨立破壞染色質，引發(fā)細胞凋亡[7]。該通路主要包括線粒體外膜通透性，線粒體膜電位的改變，B細胞淋巴瘤2家族蛋白（Bcell lymphoma 2 family proteins， Bcl2）的參與，ROS（reactive oxygen species）的產生，氧化磷酸化失偶聯，ATP合成減少等至關重要凋亡現象。

1 昆蟲細胞凋亡概述

昆蟲是生物界種類最多、數量最大的類群，但對其凋亡機理的研究還較少。近年來昆蟲細胞培養(yǎng)技術不斷發(fā)展，國內外陸續(xù)出現了一些關于昆蟲細胞凋亡通路的研究，研究結果表明昆蟲細胞凋亡途徑有3條：①與哺乳動物細胞凋亡途徑類似，即依賴細胞色素C的釋放和caspases活化的凋亡途徑；②與線蟲細胞的凋亡途徑類似，即細胞凋亡不依賴于細胞色素C的釋放；③不依賴于caspases的凋亡途徑[8]。在昆蟲中，關于雙翅目昆蟲果蠅凋亡機制的研究較多，對于細胞色素C是否從線粒體釋放到細胞質中這一過程和線粒體外膜通透化與否仍存在爭議[9]。其次，昆蟲中研究較多的是鱗翅目昆蟲，一些研究表明其細胞凋亡過程依賴于細胞色素C，凋亡中出現線粒體膜電位、線粒體結構及線粒體膜通透性的改變，即鱗翅目昆蟲細胞凋亡途徑更類似于哺乳動物細胞凋亡的線粒體通路[10]。

線粒體在昆蟲細胞凋亡中扮演著至關重要的作用[11]。通過比較哺乳動物和昆蟲細胞在凋亡過程中的幾個重要節(jié)點，并總結昆蟲線粒體通路的一些研究進展，有助于闡釋線粒體在昆蟲細胞凋亡中的作用，以期為深入研究一些殺蟲藥劑的殺蟲機理和抗癌藥物的開發(fā)提供依據。

2 線粒體與昆蟲細胞凋亡

線粒體作為細胞的能量工廠，是真核細胞生存所必需的。在凋亡發(fā)生過程中，線粒體不僅是促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白相互作用決定細胞命運的位點，還是激活caspases的起源[12]。線粒體是一個由雙層膜組成的囊狀結構，內外膜通透性不同，內膜上存在一些載體蛋白或通道，可以選擇性地通過一些物質。細胞接收到凋亡信號后刺激多種促凋亡蛋白轉移至線粒體，繼而破壞線粒體膜的通透性和完整性，Bcl-2家族蛋白調節(jié)此過程[13]。線粒體膜通透化導致多種凋亡誘導因子或蛋白從線粒體釋放到胞質，如細胞色素C、內切核酸酶（EndoG），繼而引起典型的凋亡變化[14]。同時，線粒體腫脹突起、線粒體脊消失等形態(tài)動力學改變是細胞凋亡的重要特征。在哺乳動物、果蠅及一些鱗翅目昆蟲細胞凋亡的過程中都可以觀察到線粒體形態(tài)的動態(tài)變化[15，16] 。

2.1 細胞色素C

細胞色素C存在于線粒體內膜上，作為呼吸鏈的重要一員，影響ATP的產生。在哺乳動物細胞中，細胞色素C從線粒體釋放到胞質中是起始凋亡途徑的關鍵一步，被認為是線粒體凋亡途徑的重要標志[17]。細胞色素C從線粒體釋放到胞質后可以與凋亡蛋白酶激活因子結合，形成凋亡小體，促進caspases-9前體的自身活化，活化的caspases-9前體激活caspases-3效應蛋白，導致細胞凋亡[8]。

早期的研究顯示果蠅細胞凋亡途徑缺乏線粒體因子的參與，在大多數果蠅細胞系如S2和BG2的凋亡過程中沒有檢測到細胞色素C的釋放[18]。但在果蠅視黃醛細胞和分化的精細胞凋亡過程中有細胞色素C的參與，在果蠅的SL-2細胞凋亡過程中也檢測到細胞色素C的釋放[18]。在果蠅中目前發(fā)現了2個高度同源的細胞色素C基因：Cyt c-p和Cyt c-d，二者均編碼產生15 ku左右的水溶性蛋白（DC-4和DC-3），正常狀態(tài)下位于線粒體內膜上并參與電子傳遞[19]。因此，在果蠅中，細胞色素C并不參與所有細胞的凋亡過程，具有細胞類型依賴性。一些學者認為果蠅細胞凋亡中caspases 的活化在進化上是一種更為原始的機制[9，20]。

在鱗翅目昆蟲中，目前研究表明細胞色素C在線粒體途徑中的作用和功能與哺乳動物相似。研究者鑒定了細胞色素C在鱗翅目草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）Sf9細胞凋亡中的重要作用并證實了細胞色素C釋放依賴于線粒體通透性轉運孔（mitochondria permeability transition pore，MPTP）[21]。王文祥等[22]研究結果顯示喜樹堿（CPT）誘導Sf9細胞凋亡后，線粒體膜上的細胞色素C向細胞質中釋放，同時胞內Sf-caspase-1被激活。Pan等[23]證實線粒體參與羥基喜樹堿誘導的家蠶（Bombyx mori Linnaeus）BmN-SWU1細胞凋亡，線粒體通透性轉換孔被開放，釋放細胞色素C，繼而激活caspase-9和caspase-3，具有時間和濃度依賴性。Zhang等[24]在研究喜樹堿的殺蟲活性機制中發(fā)現其可以誘導甜菜夜蛾（Spodoptera exigua Hiibner）中腸脂肪體細胞凋亡，且凋亡過程中伴隨有細胞色素C的釋放和caspases的激活，證實了喜樹堿誘導的凋亡可能依賴于細胞色素C介導的線粒體內途徑。

目前，對細胞色素C的釋放機制還不清楚。在哺乳動物中，細胞色素C 被釋放的途徑可能有3 種：①借助線粒體膜通透性轉運孔釋放到胞漿，并受Ca2+濃度的調節(jié)[25]；②線粒體外膜存在細胞色素C 的特定通道，待信號刺激時會開放；③K+的堆積可能引起線粒體的腫脹甚至外膜破裂，最終導致細胞色素C的釋放[26]。家蠶細胞色素C依賴的凋亡途徑中，Bmp53的表達升高可能有助于細胞色素C的釋放，但家蠶細胞色素C是如何釋放的還不清楚[27]。

2.2 胱天蛋白酶（caspases）家族

胱天蛋白酶是細胞凋亡的中樞效應器，在細胞凋亡的啟動及進程中發(fā)揮著關鍵的作用。胱天蛋白酶家族成員通過對凋亡信號的募集、傳遞和執(zhí)行，完成胱天蛋白酶成員之間的級聯反應，推動細胞凋亡進程[28]。胱天蛋白酶酶原由1個大亞基（p20），小亞基（p10）和N端前域組成。通常，胱天蛋白酶以無活性的酶原形式存在，在凋亡過程中通過大、小亞基和N端前域的斷裂，形成具有2個大亞基和2個小亞基的四聚體——具有2個活性中心的成熟的胱天蛋白酶。 胱天蛋白酶活性中心由1個保守的組氨酸-半胱氨酸組件和1個大的能夠容納底物P4-P1殘基的具有延展性構象的口袋組成。胱天蛋白酶酶原的激活是凋亡過程的關鍵步驟，無論何種凋亡途徑，最后都有caspases 的激活，但在沒有caspases的情況下凋亡仍可以發(fā)生[29]。

在哺乳動物中，目前已鑒定出18種caspases 家族成員[30]，參與凋亡的有caspase-2、caspase-3、caspase-4、caspase-6、caspase-7、caspase-8、caspase-9和caspase-10。其中可以分為上游的啟動caspases，包括caspase-8、9和10，以及下游的執(zhí)行caspases，包括caspase-3 和7，除此之外，caspase-6具有起始胱天蛋白酶的長N端前域，而在序列和功能上更接近于執(zhí)行胱天蛋白酶[31]。caspases 家族作為線粒體內途徑的核心組分，凋亡發(fā)生時，細胞色素C一旦釋放到胞質，與Apaf-1結合形成復合體，隨后誘導構象變化，促進這個復合體與caspase-9 前體procaspases-9和dATP的結合，繼而導致一系列的胱天蛋白酶激活[32]，caspases 被激活以后可以降解細胞骨架蛋白actin等，最終導致細胞死亡。

目前在果蠅中已經鑒定出7 種caspases成員[33]，包括含長結構域的Dronc，Dredd，strica和短結構域的Decay，Damm，Drice 和Dcp-1。Drice，Dcp-1 和 Decay 與哺乳動物的caspases-3有高度的同源性[34]。而Dronc是一個與線蟲CED-3或人類caspases-9類似的caspases，Dronc結合 Apaf-1/CED-4類似蛋白Dark，Dark被激活后反過來激活效應caspases[27]。果蠅細胞凋亡過程中存在依賴胱天蛋白酶活化（內途徑）或不依賴胱天蛋白酶活化（外途徑）2種凋亡形式。2006年研究人員發(fā)現Dronc和Drice是果蠅細胞凋亡所必需的胱天蛋白酶[35-36]。果蠅細胞接收到凋亡刺激信號后，起始胱天蛋白酶Dronc酶原可以自身活化，接著激活效應胱天蛋白酶Drice，這個過程沒有細胞色素C的釋放?；罨腄ronc和Drice 形成類似于凋亡小體的聚合物[19]。但在某些細胞類型中，缺乏Dronc和Drice時，細胞凋亡也可發(fā)生，表明在昆蟲細胞死亡系統(tǒng)中已建立多條凋亡通路[37]。

家蠶作為研究細胞凋亡機制的模式昆蟲，與棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）、草地貪夜蛾等鱗翅目昆蟲的caspases家族序列之間具有高度的保守性。2011年，研究人員克隆出家蠶的起始caspases（BmDronc）序列，它具有募集結構域（CARD），其功能與哺乳動物的caspases-9類似，具有促凋亡作用[38]。家蠶的caspases家族成員BmlCE，BmlCE-2和BmlCE-5陸續(xù)被鑒定出來，但功能尚不清楚[39]。2014年，Yi 等[11]報道BmICE-2可能具有caspases-9的活性并可以促進家蠶BmN-SWU1細胞凋亡。

2.3 Bcl-2家族

B細胞淋巴瘤2蛋白（B-cell lymphoma 2 family proteins，Bcl-2）家族是細胞凋亡過程中一類關鍵的蛋白，調控線粒體膜通透性和細胞色素C釋放等。Bcl-2家族蛋白可以分為促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白，大多數細胞同時表達多種Bcl-2家族蛋白[40]。促凋亡蛋白可分為效應蛋白（effector protein）和BH3 蛋白-only（BH3-only protein）。效應蛋白包括BAX 和BAK，一旦被激活，二者就在線粒體外膜（mitochondrial outer membrane，MOM）內寡聚體化形成蛋白脂小孔，從而促進線粒體外膜小孔（mitochondrial outer membrane pore，MOMP）的形成。BH3-only 蛋白（BID 和BIM）可促進BAK 和BAX 寡聚體化及細胞色素C 的釋放[41]。抑凋亡BcL-2 蛋白含有4 個同源結構域（BH1、BH2、BH3、BH4），主要成員包括A1、Bcl-2、Bcl-w、Bcl-xL、MCL-1，它們主要通過直接抑制促凋亡Bcl-2 蛋白（Bak和Bax）來保持線粒體外膜的完整性。

在哺乳動物中，Bcl-2家族蛋白調控線粒體的動態(tài)變化和凋亡的起始過程[42]。許多研究表明，細胞接收到凋亡信號后，Bcl-2蛋白家族的某些蛋白從胞質轉移到線粒體外膜，進而產生線粒體跨膜電位。Bcl-2 家族蛋白能與其他孔蛋白相互作用，在線粒體膜上形成一個高運輸無選擇性的、跨線粒體外膜和內膜的通道-線粒體通透性轉換孔（permeability transition pore，PTP）[21]。PTP 形成以后，大量Ca2+涌入到胞質中，胞質和線粒體基質間的化學平衡被打破，引發(fā)線粒體內膜膨脹，反過來引起更多PTP 的開放，最終導致線粒體內膜的破裂，凋亡誘導因子（AIF）、細胞色素C和胱冬肽酶原等釋放到胞液中。

目前在果蠅體內鑒定出2個Bcl-2 家族蛋白，分別是促凋亡蛋白Debcl和抑凋亡蛋白Buffy，其中Debcl與哺乳動物促凋亡蛋白Bok/Mtd同源性最高。 Buffy和Debcl都包含BH1、BH2、BH3結構域和Bcl-2家族蛋白的碳端跨膜結構域，Debcl 定位于線粒體，而Buffy定位于內質網[43]。在外部環(huán)境的刺激下，Debcl和Buffy的突變體都參與調控細胞凋亡，Debcl具有促凋亡作用，而Buffy是表現促凋亡還是抑凋亡活性視具體情況而定[15]。Richardson等[34]證實Buffy在體內是1個抗凋亡Bcl-2家族成員，且與哺乳動物Bcl-2在抑制細胞周期上高度保守。之后報道表明Buffy可以啟動Grim依賴的細胞死亡，首次證實Buffy參與調控發(fā)育性PCD過程，且起促凋亡作用。因此Bcl-2家族中的促凋亡或抑凋亡成員是否具有雙重作用，還需要進一步確定[44]。

在家蠶中，目前只有2個Bcl-2家族基因被克隆和鑒定，即Bm109和BmBuffy。 BmBuffy全長1 632 bp，編碼292個氨基酸，含有BH1、BH2、BH3結構域。系統(tǒng)進化樹分析結果顯示，BmBuffy與昆蟲中意蜂（Apis mellifera）和果蠅的Buffy親緣關系最近，與哺乳動物Bok基因聚為一類，并證實了Bmbuffy是Bcl-2家族蛋白Bak的同系物，且其可抑制羥基喜樹堿誘導的家蠶細胞凋亡[45]。BmBuffy的過表達抑制了細胞色素C的釋放和caspases-3的活化，從而抑制凋亡，沉默BmBuffy的RNA反而促進凋亡[46]。

2.4 凋亡抑制因子（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）

凋亡抑制因子廣泛存在于線蟲、昆蟲及哺乳動物中，在進化上具有保守性。目前，在哺乳動物中已發(fā)現8個IAPs家族成員，包括細胞凋亡抑制因子1和2（cellular IAP1 和cellular IAP2，cIAP1和cIAP2），神經元凋亡抑制因子（neuronal apoptosis inhibitor protein，NAIP），Survivin，黑色素瘤凋亡抑制蛋白（melanoma-IAP，ML-IAP/Livin）、睪丸特異凋亡抑制蛋白（hILP）、X染色體連鎖凋亡抑制因子（X-linked IAP，XIAP）以及含泛素連接酶的桿狀病毒IAP重復序列（分別由BIRC1-8基因編碼），每個IAPs家族成員在結構上至少含有1個桿狀病毒IAP重復（baculovirus IAP repeat，BIR）結構域，一些家族成員含有多個BIR結構域[47]。目前對細胞凋亡因子cIAP1、cIAP2以及X染色體連鎖凋亡抑制因子XIAP研究比較多，其在結構上除了每個IAP都含有3個BIR結構域外，還包括RING結構域，具有E3泛素連接酶活性。XIAP是典型的IAP蛋白，通過直接與caspases結合從而抑制其活性，比如caspase-3，-7和-9，因此，IAP蛋白也被認為是細胞凋亡的直接抑制劑。事實上，IAP蛋白主要通過阻止胱天蛋白酶活化或者與促凋亡信號中間產物相互作用而對凋亡過程進行調控[48]。

在果蠅中，其凋亡抑制蛋白（drosophila apoptosis inhibiting Protein，DIAP1）包含2個BIR結構域，用以結合caspase或促凋亡因子，結構域RING能夠對DIAP1本身或者通過BIR結構域結合的caspase或促凋亡因子進行泛素化修飾[49]。如Steller[50]研究證實果蠅DIAP1對胱天蛋白酶Dronc進行泛素化修飾，阻止Dronc激活下游的效應胱天蛋白酶，阻止細胞凋亡的發(fā)生。

在其他昆蟲中，Huang等[51]從家蠶BmN細胞中克隆了IAP的同源物BmIAP，其在結構上包括2個BIR結構域和1個RING結構域，并證實草地貪夜蛾Sf-21細胞的凋亡同時需要BIR和RING結構域，BmIAP能夠抑制Bax誘導的哺乳動物HEK293細胞凋亡，但對Fas誘導的凋亡沒有作用。表1為不同物種線粒體凋亡途徑的一些重要調控因子的比較[50，52]。

3 展望

關于細胞凋亡機制的研究大多是以哺乳動物為載體，而對昆蟲凋亡的研究較少。通過對哺乳動物、果蠅和家蠶等鱗翅目昆蟲凋亡途徑的比較，可以發(fā)現凋亡機制在不同的生物種類中具有一定的保守性。線粒體凋亡途徑存在于哺乳動物和大部分昆蟲中，在哺乳動物和昆蟲等細胞凋亡的過程中都發(fā)揮著重要作用。大量研究表明，線粒體途徑是細胞凋亡信號轉導的核心途徑。但其調控機制在昆蟲與哺乳動物之間，甚至在不同類屬昆蟲之間都存在差異。目前昆蟲細胞凋亡的信號傳導通路研究還不是很深入，尤其是在分子水平層面的研究匱乏，為了更好地闡釋這一復雜的凋亡機制以及線粒體途徑對昆蟲細胞的調控機理，還需要進行更多生物化學和基因水平的研究分析，進而明確線粒體在昆蟲細胞凋亡中的作用，了解線粒體的昆蟲毒理學意義，也為進一步進行殺蟲劑誘導昆蟲死亡的機理研究，開發(fā)新的有活性的藥劑提供理論指導。

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