王文雪，牟艷玲，姚慶強(qiáng)#(1.濟(jì)南大學(xué)/山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250200;2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，濟(jì)南 250062;3.衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250062;4.山東省罕少見病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250062)

葫蘆素類化合物的抑瘤作用及其作用機(jī)制和聯(lián)合用藥研究進(jìn)展Δ

王文雪1，2，3，4＊，牟艷玲2，3，4，姚慶強(qiáng)2，3，4#(1.濟(jì)南大學(xué)/山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250200;2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，濟(jì)南 250062;3.衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250062;4.山東省罕少見病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250062)

目的:為發(fā)現(xiàn)新的抑瘤靶點(diǎn)、完善葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物的構(gòu)效關(guān)系以及開發(fā)四環(huán)三萜類抗腫瘤新藥提供參考。方法:以“葫蘆素”“腫瘤”“Cucurbitacin”“Tumour”等為關(guān)鍵詞，組合查詢2005-2016年在PubMed、Wiley-Blackwell、EBSCO、中國知網(wǎng)、萬方、維普等數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)葫蘆素類化合物中抑瘤效果最明顯的葫蘆素B、D、E、I及雪膽甲素的抑瘤作用及其作用機(jī)制和聯(lián)合用藥進(jìn)行綜述。結(jié)果與結(jié)論:共檢索到相關(guān)文獻(xiàn)237篇，其中有效文獻(xiàn)47篇。葫蘆素是從葫蘆科植物中分離出的葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物，其對(duì)乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等抑瘤效果顯著，可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、阻滯細(xì)胞周期、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、破壞細(xì)胞骨架以及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3、絲裂原激活的蛋白激酶等信號(hào)通路來發(fā)揮抑瘤作用。葫蘆素類藥物無論是與臨床上使用的藥物聯(lián)合還是自身聯(lián)合應(yīng)用，均有較好的協(xié)同作用;此外，葫蘆素類藥物還能提高放療的敏感性，逆轉(zhuǎn)卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞的多藥耐藥。目前，關(guān)于葫蘆素的抗腫瘤研究雖然很多，但大多集中于體外研究，體內(nèi)研究較少且未見臨床應(yīng)用。今后對(duì)含量豐富的葫蘆素類化合物開展抑瘤研究的同時(shí)，也應(yīng)對(duì)其他的葫蘆素及衍生物進(jìn)行研究對(duì)比。

葫蘆素;四環(huán)三萜類化合物;抗腫瘤藥;STAT3轉(zhuǎn)錄因子;肌動(dòng)蛋白

近年來，癌癥已成為人類最大致死原因，我國癌癥的發(fā)病率和病死率也在逐年增加[1]。葫蘆素是從葫蘆科植物中分離出的葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物，該類化合物在結(jié)構(gòu)上高度氧化，目前已經(jīng)分離出了200多種葫蘆素及其衍生物[2-3]。現(xiàn)代藥理研究表明，葫蘆素具有抗腫瘤、抗菌消炎、抗人類免疫缺陷病毒(HIV)、保肝、提高機(jī)體免疫力等藥理活性。筆者總結(jié)了具有抗腫瘤活性的葫蘆素類化合物結(jié)構(gòu)母核及結(jié)構(gòu)式，見圖1、表1[4-10]。筆者以“葫蘆素”“腫瘤”“Cucurbitacin”“Tumour”等為關(guān)鍵詞，組合查詢2005-2016年在PubMed、Wiley-Blackwell、EBSCO、中國知網(wǎng)、萬方、維普等數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)文獻(xiàn)。結(jié)果，共檢索到相關(guān)文獻(xiàn)237篇，其中有效文獻(xiàn)47篇?，F(xiàn)對(duì)葫蘆素類化合物中抑瘤效果最明顯的葫蘆素B (CuB)、葫蘆素D(CuD)、葫蘆素E(CuE)、葫蘆素I(CuI)、雪膽甲素(CuⅡa)的抑瘤作用及其作用機(jī)制和聯(lián)合用藥進(jìn)行綜述，以期為發(fā)現(xiàn)新的抑瘤靶點(diǎn)、完善葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物的構(gòu)效關(guān)系以及開發(fā)四環(huán)三萜類抗腫瘤新藥提供參考。

圖1 葫蘆素類化合物結(jié)構(gòu)母核

表1 具有抗腫瘤活性的葫蘆素類化合物結(jié)構(gòu)式

1 CuB

CuB是葫蘆素家族中含量最豐富的成員，對(duì)乳腺癌[11]、結(jié)腸癌[12]、喉癌[13]、肺癌[14]、黑色素瘤[15]、胰腺癌[16]、前列腺癌[17]等腫瘤細(xì)胞的增殖均有抑制作用，主要通過影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、破壞細(xì)胞骨架來發(fā)揮抗腫瘤活性。

1.1 CuB對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

CuB影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究多集中在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)和絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。但近幾年也有報(bào)道指出，葫蘆素抑瘤作用與STAT3無必然聯(lián)系。更值得關(guān)注的是，CuB對(duì)細(xì)胞形態(tài)及其他信號(hào)通路的影響早于STAT3信號(hào)通路的變化[18]。

1.1.1 STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 STAT3是一種致癌基因轉(zhuǎn)錄因子，通過與其他轉(zhuǎn)錄因子如β-連環(huán)素、缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)、核因子κB(NF-κB)和原癌基因c-myc、c-jun等相互作用控制基因的表達(dá)，而且STAT3參與細(xì)胞死亡一般認(rèn)為與細(xì)胞凋亡有關(guān)。阻斷STAT3信號(hào)通路中顯性失活的STAT3突變體或反義STAT3，可抑制與細(xì)胞凋亡相關(guān)的靶基因的表達(dá)，例如抗凋亡蛋白Bcl-xL、原癌基因c-myc、細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1等。Zhang M等[19]對(duì)CuB進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)CuB能阻滯人肺癌細(xì)胞A549于G2/M期，顯著抑制細(xì)胞增殖，并下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，通過STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞A549凋亡。Zheng Q等[20]研究CuB對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y的抑瘤作用中發(fā)現(xiàn)，CuB不僅阻滯細(xì)胞于G2/M期，而且可下調(diào)磷酸化蛋白酪氨酸激酶2(JAK2)、磷酸化STAT3的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而，也有報(bào)道指出，抑制STAT3的活化并不是CuB抑瘤的機(jī)制。Yasuda S等[12]在給予CuB 24 h后檢測(cè)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW 480的周期分布時(shí)發(fā)現(xiàn)，G2/M期的細(xì)胞比例顯著提高，細(xì)胞周期蛋白Cyclin B1和Cdc25C蛋白水平顯著下調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL并沒有明顯變化，提示在人結(jié)腸癌細(xì)胞SW 480中CuB并不能促進(jìn)STAT3脫磷酸化而發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用;另外，該研究還發(fā)現(xiàn)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW 480內(nèi)活性氧(ROS)含量升高，并以ROS依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Zhang T等[21]在研究葫蘆素化合物引發(fā)細(xì)胞死亡的作用機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，葫蘆素化合物CuB、CuD及CuI可過度促進(jìn)細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白LC3由可溶形式轉(zhuǎn)變?yōu)橹苄问?，也可促進(jìn)自噬體在多種細(xì)胞中積累;同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)由葫蘆素引起的細(xì)胞自噬及死亡與抑制STAT3無關(guān)，與線粒體釋放的ROS升高有關(guān)?？梢姡珻uB對(duì)STAT3信號(hào)通路的抑制存在爭(zhēng)議，這可能與腫瘤細(xì)胞種類及給藥濃度等有關(guān)，不能同一而論。

1.1.2 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 MAPK在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程中均起著十分重要的作用。在哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中，與細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被認(rèn)為是經(jīng)典的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。CuB抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞SH-SY5Y ERK1/2磷酸化，促進(jìn)c-jun氨基末端激酶(JNK)及絲裂原活化蛋白激酶p38 (p38MAPK)磷酸化[20]，并能在短時(shí)間內(nèi)顯著抑制人白血病細(xì)胞K562中c-Raf激酶、ERK1/2和絲裂原活化蛋白的磷酸化，該影響早于對(duì)STAT3信號(hào)通路的抑制[18]。然而，CuB并非能抑制所有腫瘤細(xì)胞ERK1/2的磷酸化。用CuB處理人肝癌細(xì)胞BEL-7402發(fā)現(xiàn)，CuB抑制c-Raf激酶激活的同時(shí)可促進(jìn)ERK1/2的磷酸化[22]，這種現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與信號(hào)通路之間的交聯(lián)有關(guān)。此外，Zhang T等[21]也發(fā)現(xiàn)CuB、CuD及CuI可激活ERK和JNK的磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞自噬，平衡調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡的水平，可更高效地促進(jìn)細(xì)胞死亡。可見，由于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的交聯(lián)及不同種類的細(xì)胞分子水平表達(dá)的差異，導(dǎo)致CuB對(duì)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響很復(fù)雜，仍需進(jìn)一步的研究。

1.1.3 其他作用靶點(diǎn) 除上述兩條研究較多的信號(hào)通路外，也發(fā)現(xiàn)了新的作用靶點(diǎn)。Gao Y等[17]體外研究發(fā)現(xiàn)，CuB低濃度下就能顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的生長，同時(shí)激活細(xì)胞凋亡蛋白酶Caspase-3、Caspase-7，增加二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)的剪切激活，阻滯細(xì)胞于G0/G1期，顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，CuB能顯著降低體內(nèi)腫瘤形成的速率，且三磷酸腺苷檸檬酸裂解酶(ACLY)為CuB的體內(nèi)外作用的靶點(diǎn)，CuB呈劑量依賴性地抑制ACLY的磷酸化。BRCA1蛋白是一個(gè)與遺傳性乳腺癌和卵巢癌相關(guān)的腫瘤抑制因子。Promkan M等[23]用CuB給藥處理4種乳腺癌細(xì)胞并分析抑癌基因p21、p27和存活蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CuB能明顯抑制BRCA1突變組和BRCA1敲除組乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)p21Waf1和p27Kip1的表達(dá)，抑制存活蛋白的表達(dá)，提示存活蛋白可能是CuB抑制BRCA1缺失的乳腺癌細(xì)胞增殖的重要作用靶點(diǎn)。Shang Y等[24]在研究CuB對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的抑制作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，抑癌基因p21及p27的表達(dá)顯著增加，細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1及Cyclin E的表達(dá)顯著降低(P＜0.01);隨后的分子水平研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB、一磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)和p38信號(hào)通路均不是CuB發(fā)揮抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤作用的通路，蛋白激酶B(Akt)的過度表達(dá)會(huì)減弱CuB體外對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y增殖的抑制作用，表明CuB是通過上調(diào)抑癌基因PTEN的表達(dá)、抑制Akt信號(hào)通路的激活來發(fā)揮抗神經(jīng)母細(xì)胞瘤作用。

1.2 CuB對(duì)細(xì)胞骨架的影響

肌動(dòng)蛋白微絲的主要生物學(xué)功能是構(gòu)成細(xì)胞骨架，其對(duì)細(xì)胞形態(tài)的維持具有重要意義。構(gòu)成微絲的主要成分為肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白。在完成對(duì)細(xì)胞形態(tài)的維持、運(yùn)動(dòng)、分裂等各種功能時(shí)，肌動(dòng)蛋白需要通過多種方式錨定在質(zhì)膜上，與質(zhì)膜蛋白如整合素發(fā)生連接。Gupta P等[11]經(jīng)體外試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，CuB能抑制多種乳腺癌細(xì)胞的生長，主要通過顯著抑制整合素A6、整合素B4的表達(dá)及誘導(dǎo)整合素B1、整合素B3的表達(dá)來發(fā)揮作用。雖然已有眾多研究表明葫蘆素類藥物破壞了肌動(dòng)蛋白的聚合/解聚合動(dòng)力學(xué)平衡，誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白的異常聚集，從而引起細(xì)胞形態(tài)的迅速改變，但具體是影響了哪些肌動(dòng)蛋白調(diào)控因子，現(xiàn)在還沒有統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。Zhang Y等[15]研究顯示，小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10經(jīng)CuB處理后能快速引起細(xì)胞膜出泡和變形，阻滯細(xì)胞于G2/M期，并促使多倍體細(xì)胞的形成;此外，球型肌動(dòng)蛋白(G-actin)迅速殆盡，肌動(dòng)蛋白快速聚集。降低ROS的含量，能顯著減少G-actin的損耗，同時(shí)抑制CuB的抗腫瘤活性，推測(cè)CuB通過ROS依賴的方式誘導(dǎo)G-actin迅速殆盡從而發(fā)揮抗黑素瘤的效果。Kausar H等[14]對(duì)4種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞進(jìn)行體外研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，CuB能顯著改變細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白聚集，阻滯細(xì)胞于G2/M期，并調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑中的幾個(gè)關(guān)鍵的分子靶點(diǎn)促進(jìn)細(xì)胞凋亡;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CuB通過p38MAPK/熱休克蛋白27信號(hào)通路誘發(fā)細(xì)胞形態(tài)變化及骨架重塑，并非由三磷酸鳥苷蛋白酶和ROS的表達(dá)變化引起。

以上研究表明，CuB對(duì)各種癌細(xì)胞形態(tài)的影響是快速而顯著的，但影響細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的方式因細(xì)胞而異。鑒于目前對(duì)CuB影響的肌動(dòng)蛋白調(diào)控因子尚不明確，將肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架作為靶標(biāo)依然是葫蘆素化合物抑瘤研究的熱點(diǎn)。

2 CuD

CuD對(duì)肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌及乳腺癌等腫瘤細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒活性，其抗癌機(jī)制包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及阻滯細(xì)胞周期等。

Kim SR等[25]研究瓜蔞乙醇提取物及CuD抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩者均可通過抑制STAT3磷酸化，引起細(xì)胞凋亡及G2/M期細(xì)胞阻滯。IshiiT等[26]體外研究多個(gè)濃度的CuD對(duì)多種人子宮內(nèi)膜及卵巢癌細(xì)胞的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，CuD能促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白酶Caspase-3、Caspase-9的剪切激活，增加PARP的分裂和p21Waf1、p27Kip1的表達(dá)，減少Cyclin A及Cyclin B的聚集。此外，Spear SA等[27]用CuD處理2型神經(jīng)纖維瘤細(xì)胞Sch10545和人腦膜瘤細(xì)胞Ben-Men-1時(shí)發(fā)現(xiàn)，CuD通過抑制結(jié)合蛋白PRAS40和Akt的磷酸化狀態(tài)發(fā)揮凋亡前分子效應(yīng)，同時(shí)降低Cyclin A、Cyclin B和Cyclin E的表達(dá)。因此，CuD也被認(rèn)為是治療2型神經(jīng)纖維瘤及腦膜瘤的候選藥物。

以上研究表明，CuD與CuB在抑瘤方面有很多相似之處，它也能通過抑制STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡。但CuD在抑瘤方面的研究明顯少于CuB，可能與其在天然藥物中的含量稍低有關(guān)。

鉆孔灌注樁施工中大部分施工內(nèi)容都是在水下環(huán)境開展的，施工過程不能得到全面觀察，并且施工活動(dòng)需要在最短時(shí)間內(nèi)完成，實(shí)際施工難度較大，對(duì)施工人員施工經(jīng)驗(yàn)以及施工專業(yè)性要求較大。鉆孔灌注樁的施工主要有成孔與成樁兩個(gè)部分構(gòu)成，實(shí)際操作程序就是放線定位、埋設(shè)護(hù)筒、成孔、鋼筋籠綁扎、混凝土灌注等，在各個(gè)施工環(huán)節(jié)需要對(duì)技術(shù)合理應(yīng)用，強(qiáng)化施工質(zhì)量控制。

3 CuE

CuE在葫蘆素家族中的含量豐富，在早期研究中發(fā)現(xiàn)，CuE具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎及保護(hù)神經(jīng)等藥理活性，最近幾年對(duì)CuE的研究集中在抗腫瘤活性方向。CuE抗腫瘤機(jī)制包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[28]、引發(fā)細(xì)胞自噬[29]、破壞細(xì)胞骨架[30]、阻滯細(xì)胞周期[28]等。

除CuB之外，CuE是另外一個(gè)在細(xì)胞骨架方面研究較多的葫蘆素化合物。整體上，CuE也是通過影響細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白調(diào)控因子、打破肌動(dòng)蛋白聚合/去聚合狀態(tài)的平衡，來誘發(fā)肌動(dòng)蛋白的異常聚集。Zhang T等[30]在研究CuE對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，腹腔注射CuE能明顯抑制乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移至肺;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CuE能損壞肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合物依賴性的肌動(dòng)蛋白聚集，并經(jīng)肉瘤/局部黏著斑激酶/Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1/基質(zhì)金屬蛋白酶通路抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移。Cofilin是常見的一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，能在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合和解聚纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)，同時(shí)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白骨架的重組，對(duì)維持細(xì)胞形態(tài)有重要意義。LIM激酶是一類具有絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸雙重活性的激酶。LIM激酶作為Cofilin的上游信號(hào)分子，可調(diào)控Cofilin自身N末端第3位點(diǎn)絲氨酸(Ser3)的磷酸化狀態(tài)，LIM激酶磷酸化后被激活，而后引起Cofilin的 Ser3磷酸化而失活，提高F-actin的穩(wěn)定性。李麗等[31]研究CuE對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2增殖與遷移的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，CuE可能通過抑制LIM激酶/Cofilin信號(hào)通路而損害細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白，從而導(dǎo)致人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2的增殖與遷移受到抑制。

除破壞細(xì)胞骨架外，MaG等[32]研究CuE對(duì)肺癌細(xì)胞95D的抗癌效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，CuE能降低細(xì)胞的生存能力，抑制集落形成，同時(shí)以濃度依賴性的方式增加ROS水平，該水平可由抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸逆轉(zhuǎn);CuE通過影響B(tài)cl-2和Caspase的表達(dá)誘導(dǎo)ROS依賴性的細(xì)胞凋亡，而且能誘導(dǎo)防護(hù)性的細(xì)胞自噬，由經(jīng)Akt/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)(mTOR)信號(hào)通路的ROS水平調(diào)節(jié)，在細(xì)胞凋亡和自噬間達(dá)到一種動(dòng)態(tài)平衡。在人類膀胱癌及乳腺癌細(xì)胞中觀察到CuE將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，同時(shí)檢測(cè)到p27、p21、p53的表達(dá)顯著升高，STAT3、CDK1、Cyclin B的表達(dá)降低[33-34]。此外，CuE抑制Cyclin B1/CDC2復(fù)合體的形成，誘導(dǎo)GADD45在結(jié)直腸癌及腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，提示CuE抑制有絲分裂的進(jìn)程可能是由GADD45基因家族的超表達(dá)所調(diào)控[35-36]。

以上研究表明，CuE發(fā)揮抑瘤作用所涉及的信號(hào)通路也非常廣泛，同時(shí)對(duì)細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的破壞也是快速而顯著的。綜合CuE與CuB的抑瘤情況及結(jié)構(gòu)差異，可推測(cè)葫蘆烷型四環(huán)三萜結(jié)構(gòu)母核中Δ1，2雙鍵并不是抗腫瘤活性所必需，但該雙鍵是否與抑瘤強(qiáng)度相關(guān)還未可知，仍需進(jìn)一步的研究對(duì)比。

4 Cu I

CuI可從多種植物中分離得到，多項(xiàng)研究證明CuI也具有良好的抗腫瘤效果。CuI抗腫瘤機(jī)制包括阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、引發(fā)細(xì)胞自噬及抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等。

Kim HJ等[8]將CuI作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞SW 480，發(fā)現(xiàn)CuI呈濃度依賴性地降低細(xì)胞活力、抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)CuI還能降低細(xì)胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin A、CDK1、Cdc25C的表達(dá)，阻滯細(xì)胞于G2/M期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白酶Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9和PARP的剪切激活，加強(qiáng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Chang CJ等[37]研究發(fā)現(xiàn)，CuI作用于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞，能有效抑制STAT3通路，抑制抗凋亡基因Bcl-2和存活蛋白的表達(dá)。除上述促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑瘤效果外，CuI還可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。Yuan G等[38]從體內(nèi)、體外兩個(gè)方面研究CuI對(duì)惡性膠質(zhì)瘤的抑瘤效果，發(fā)現(xiàn)CuI經(jīng)AMPK/ m TOR/人p70核糖體蛋白S6激酶(p70S6K)通路誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自噬，并不經(jīng)磷酸肌醇3激酶(PI3K)/Akt通路;同時(shí)CuI可降低HIF-1α的表達(dá)，減少Bcl-2和自噬基因Beclin1/PI3K家族Ⅲ聯(lián)合，引發(fā)自噬。除上述通路的研究外，有報(bào)道指出CuI也可導(dǎo)致細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的改變，從而發(fā)揮抑瘤效果，與JAK2/STAT3信號(hào)通路無關(guān)[39]。另外，Lopez-Haber C等[40]發(fā)現(xiàn)，CuI能抑制乳腺癌細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1的激活，且不依賴于JAK2的表達(dá)，由ROS的水平調(diào)節(jié)Rho和Rac之間的平衡，從而抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

可見，CuI能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，對(duì)JAK2/ STAT3信號(hào)通路抑制方面也存在爭(zhēng)議。CuI與CuE的結(jié)構(gòu)非常相似，對(duì)比兩者抑瘤方面的研究，推測(cè)葫蘆烷型四環(huán)三萜結(jié)構(gòu)母核中25位碳上的乙酰基也不是抗腫瘤活性所必需。

CuⅡa是雪膽屬植物的主要活性成分，最早用于治療桿菌痢疾和腸胃炎[9]。隨著人們研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)，CuⅡa不僅具有清熱解毒、抗菌消炎、抗HIV及健胃止疼等功效，還具有抗腫瘤活性。

高申等[41]對(duì)人肺癌細(xì)胞A549及小鼠原代培養(yǎng)的脾細(xì)胞給予不同濃度的CuⅡa，觀察了CuⅡa對(duì)人肺癌細(xì)胞A549增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用。MTT結(jié)果顯示，CuⅡa對(duì)人肺癌細(xì)胞A549和脾細(xì)胞的增殖抑制作用呈濃度依賴性，且隨濃度的增大，CuⅡa對(duì)人肺癌細(xì)胞A549增殖的抑制作用顯著高于脾細(xì)胞，說明CuⅡa抑制細(xì)胞增殖有一定的傾向性;流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，隨著CuⅡa濃度升高，處于G2/M期細(xì)胞的比例逐漸下降，并隨時(shí)間延長，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，推測(cè)阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是CuⅡa抑制人肺癌細(xì)胞A 549增殖的機(jī)制之一。Boykin C等[42]研究發(fā)現(xiàn)，CuⅡa可誘導(dǎo)F-actin不可逆聚集，阻滯細(xì)胞周期于G2/M期。此外，CuⅡa能降低磷酸化組蛋白H3的表達(dá)，顯著增加PARP的分裂，因此喪失DNA修復(fù)功能，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。該研究還發(fā)現(xiàn)，CuⅡa并不能抑制JAK2/STAT3磷酸化，也不能改變促細(xì)胞分裂相關(guān)的蛋白激酶磷酸化狀態(tài)，但可降低與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)的細(xì)胞凋亡蛋白抑制劑(IAP)存活蛋白的表達(dá)。因此，CuⅡa的抗癌機(jī)制可能是通過破壞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架抑制癌細(xì)胞擴(kuò)散，同時(shí)通過抑制下游存活蛋白的表達(dá)，促使細(xì)胞發(fā)生PARP介導(dǎo)下的細(xì)胞凋亡。

與高度氧化的葫蘆素類化合物比較，CuⅡa結(jié)構(gòu)中不含Δ23，24雙鍵及3位羰基，并且其在抗腫瘤方面的報(bào)道較少，但上述研究中所發(fā)現(xiàn)的其對(duì)細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的破壞與CuB在這方面的報(bào)道有很大的相似性。因此，可通過CuB的已知報(bào)道為CuⅡa的進(jìn)一步研究提供思路。

6 其他葫蘆素

Abdelwahab SI等[43]報(bào)道了葫蘆素L 2-O-β-D-葡萄糖苷(CLG)的抗腫瘤活性。結(jié)果提示，CLG對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的促凋亡作用有一定的選擇性，推測(cè)CLG促凋亡的機(jī)制是對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氮和ROS的抑制，基于研究，將CLG的抗炎和抗氧化活性視為預(yù)防結(jié)腸癌發(fā)生的重要特性。此外，LiY等[10]從金佛山雪膽中分離出了16，25-二乙?；J素F等5種新的化合物，并分別進(jìn)行了人肺腺癌細(xì)胞H460、人結(jié)腸癌細(xì)胞SW 620、人前列腺癌細(xì)胞DU145的細(xì)胞毒試驗(yàn)，其中16，25-乙酰基葫蘆素F對(duì)3種細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度分別為0.046、0.18、0.87 μg/m L。可見，該化合物有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，且該化合物結(jié)構(gòu)與CuB有較大的相似性，在后期研究中若對(duì)比CuB、CuⅡa進(jìn)行抗腫瘤研究，有望明確3位羰基及16位碳上乙?；臉?gòu)效關(guān)系。

7 聯(lián)合用藥

葫蘆素類化合物不僅在單一用藥方面表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性，而且在藥物聯(lián)合應(yīng)用方面也發(fā)揮了很好的協(xié)同作用。CuB與吉西他濱、多西他賽、甲氨蝶呤、順鉑等聯(lián)合用于治療胰腺癌、骨肉瘤、喉癌等腫瘤，能提高單一藥物的抗腫瘤增殖作用[13，44]。Liu T等[13]體外研究發(fā)現(xiàn)，與單一用藥及溶劑對(duì)照組比較，CuB與順鉑聯(lián)合用于治療喉癌能更顯著地降低磷酸化STAT3、細(xì)胞周期蛋白Cyclin B1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生;另外，體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥組對(duì)小鼠移植瘤的抑制作用更明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Lan T等[34]在研究CuE對(duì)化療藥物的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，低劑量的CuE可進(jìn)一步加強(qiáng)順鉑對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用，但高劑量的CuE并沒有這樣的效果，提示在藥物的聯(lián)合應(yīng)用研究中，必須考察劑量因素。

葫蘆素類藥物不僅可與臨床上使用的藥物聯(lián)合應(yīng)用發(fā)揮抗腫瘤協(xié)同作用，還可自身聯(lián)合增強(qiáng)抗腫瘤作用。Tannin-Spitz T等[45]研究發(fā)現(xiàn)，與單一用藥比較，CuB和CuE糖苷聯(lián)合應(yīng)用可明顯阻滯人乳腺癌細(xì)胞于G2/M期，并引起纖維組織的損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

聯(lián)合用藥除了能提高單一藥物的抗腫瘤增殖作用外，還可提高放射治療的敏感性，逆轉(zhuǎn)卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞的多藥耐藥。Chang CJ等[37]以CuI作為STAT3信號(hào)通路的抑制劑，處理成神經(jīng)管細(xì)胞瘤(MB)派生的CD133陽性細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CuI可改善其對(duì)MB放療的敏感性。Duangmano S等[46]研究發(fā)現(xiàn)，CuB可改善人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF7的放療敏感性，但是對(duì)人乳腺癌細(xì)胞SKBR-3的放療增敏不明顯;并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CuB僅將人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF7阻滯于G2/M期，提示將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期可能是葫蘆素對(duì)某些乳腺癌細(xì)胞放療增敏的重要機(jī)制。曲迎春[47]研究發(fā)現(xiàn)，CuB對(duì)卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞的多藥耐藥有逆轉(zhuǎn)作用，提示CuB可作為紫杉醇的互補(bǔ)藥物。

8 結(jié)語

葫蘆素類化合物對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用是廣泛的，并不局限于一種癌細(xì)胞，其通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)自噬、阻滯細(xì)胞周期、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、破壞細(xì)胞骨架等多種途徑發(fā)揮抑癌作用;同時(shí)，葫蘆素也調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的多條信號(hào)通路。鑒于葫蘆素類化合物對(duì)STAT3信號(hào)通路的影響晚于細(xì)胞形態(tài)和其他一些信號(hào)通路的變化，推測(cè)其抗腫瘤活性可能涉及更為上游的靶點(diǎn)，且大多葫蘆素類化合物能破壞細(xì)胞骨架，顯著引起細(xì)胞形態(tài)的改變，通過相應(yīng)的因子將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。考慮到已知的影響微絲骨架的藥物都會(huì)引起不同程度的細(xì)胞周期阻滯，推測(cè)葫蘆素類化合物引起細(xì)胞周期阻滯也可能與微絲骨架受損相關(guān)。目前，關(guān)于葫蘆素抗腫瘤的研究雖多，但大多集中于體外，體內(nèi)研究較少且臨床未見應(yīng)用。今后對(duì)含量豐富的葫蘆素類化合物開展抑瘤研究的同時(shí)，也應(yīng)對(duì)其他的葫蘆素及其衍生物進(jìn)行研究對(duì)比。

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R961;R966

A

1001-0408(2017)19-2712-06

2016-10-29

2017-01-05)

(編輯:余慶華)

山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)項(xiàng)目(No.2014 ZZCX02105)

＊碩士研究生。研究方向:天然藥物化學(xué)。電話:0531-82919960。E-mail:407785182@qq.com

#通信作者:研究員，碩士生導(dǎo)師，博士。研究方向:天然藥物化學(xué)。電話:0531-82919960。E-mail:yao_imm@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.33