許啟榮，周 瓊，張紫萍，陳 糾(廣州市第十二人民醫(yī)院藥劑科，廣州 510620)

正交試驗優(yōu)化獨子藤果實中雷公藤紅素的醇提工藝Δ

許啟榮＊，周 瓊，張紫萍，陳 糾(廣州市第十二人民醫(yī)院藥劑科，廣州 510620)

目的:優(yōu)選獨子藤果實中雷公藤紅素的醇提工藝。方法:采用高效液相色譜法測定雷公藤紅素的含量。以提取時間、提取次數、料液比為考察因素，以雷公藤紅素的提取率為考察指標設計正交試驗，并進行驗證試驗。結果:最優(yōu)醇提工藝為45%甲醇提取3次、每次2 h、料液比1∶8;驗證試驗中，雷公藤紅素的平均提取率為0.917mg/g(RSD=2.85%，n=3)。結論:本研究優(yōu)化的醇提工藝穩(wěn)定可行、提取率較高，適用于獨子藤果實中雷公藤紅素的提取。

獨子藤;雷公藤紅素;單因素;正交試驗;高效液相色譜法

獨子藤(Celastrusmonospermus Roxb.)為衛(wèi)矛科南蛇屬植物，分布于越南、印度及我國福建、廣東、云南、貴州、廣西等省區(qū)的林帶中[1]。研究表明，獨子藤含有一定量的生物堿和三萜類成分，其中木栓烷型三萜類化合物具有顯著的抗癌活性[2]。

雷公藤紅素又名南蛇藤醇/素，外觀呈紅色針狀結晶，不溶于水，易溶于有機溶劑，分子式為C29H38O4，分子量為450，能與半胱氨酸的巰基發(fā)生邁克爾加成反應[3]，具有抗炎、免疫抑制及抗腫瘤等多種藥理活性[4]。目前，對獨子藤中雷公藤紅素的提取報道較少，其優(yōu)化提取工藝報道更少。本文對獨子藤果實中雷公藤紅素提取工藝的主要影響因素進行單因素和正交試驗研究，為更合理有效地提取藤果實中的雷公藤紅素提供參考。

1 材料

1.1 儀器

SartoriusBP211D電子天平(德國賽多利斯公司); 1100高效液相色譜(HPLC)儀，包括G1315B二極管陣列檢測器(DAD)、1100色譜工作站(美國安捷倫公司)。

1.2 藥材、對照品與試劑

雷公藤于2008年10月采自廣東陽春地區(qū)，由廣東藥學院中藥學院李書淵教授鑒定為獨子藤(Celastrus monospermus Roxb.)的果實;雷公藤紅素對照品(上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號:P0259，純度:≥98%);甲醇、磷酸均為色譜純。

2 獨子藤果實中雷公藤紅素醇提液的制備和含量測定

2.1 雷公藤紅素醇提液的制備

稱取獨子藤果實約15.0 g，粉碎，精密稱定，甲醇回流提取3次，提取液過濾后合并，回收甲醇，干燥至無醇味。將樣品用三氯甲烷超聲溶解，在硅膠柱上用三氯甲烷洗脫，回收洗脫液，殘渣用甲醇溶解并定容于100m L量瓶中，用0.45μm微孔濾膜過濾，取濾液，即得。

2.2 雷公藤紅素的含量測定

2.2.1 對照品貯備液的制備 稱取雷公藤紅素對照品5.03mg，精密稱定，甲醇溶解，定容至25m L量瓶中，即得質量濃度為0.201 2mg/m L的對照品貯備液。

2.2.2 色譜條件與系統適應性試驗 色譜柱:Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm);流動相:甲醇-5%磷酸(80∶20，V/V);流速:1.0m L/m in;檢測波長:426 nm;柱溫:25℃;進樣量:20μL。在此色譜條件下，取“2.1”和“2.2.1”項下溶液進樣測定，結果，理論板數以雷公藤紅素計不低于18 076，分離度＞1.5。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram s

2.2.3 線性關系考察 分別精密吸取“2.2.1”項下的對照品貯備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0m L于5m L量瓶中，甲醇定容，搖勻，制得系列對照品工作液。依次吸取對照品工作液各20μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定。以雷公藤紅素質量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)進行線性回歸，得回歸方程為y=3.377 8×103x-1.852 3×104(r=0.999 3)。結果表明雷公藤紅素在40.24～200.12μg/m L范圍內線性關系良好。

2.2.4 精密度試驗 精密吸取雷公藤紅素對照品貯備液，按“2.2.2”項下色譜條件進樣，同日內連續(xù)測定6次，結果峰面積的RSD=3.03%(n=6);連續(xù)6 d分別進樣1次測定，結果峰面積的RSD=4.38%(n=6)。結果表明日內、日間精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一批次的雷公藤果實，按“2.1”項方法處理后，分別于室溫放置0、1、2、4、6 h后按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定。結果，峰面積的RSD= 3.37%(n=5)，表明樣品于室溫環(huán)境下6 h穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復性試驗 取同一批次的雷公藤果實，共5份，按“2.1”項下方法處理后，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，結果峰面積的RSD=4.46%(n=5)，表明重復性良好。

2.2.7 準確度試驗 取同一批次的雷公藤果實，按“2.1”項方法處理后，分別按高、中、低質量(1.0、0.5、0.1mg)加入雷公藤紅素對照品，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結果，平均加樣回收為95.38% (RSD=4.26%，n=9)，表明該方法準確度良好。

3 單因素考察及正交試驗

3.1 單因素考察

3.1.1 甲醇體積分數 固定提取時間為2 h、提取1次、料液比為1∶10，分別考察甲醇體積分數為25%、35%、45%、55%、65%、75%時雷公藤紅素的提取率(提取到的雷公藤紅素的質量/處理前雷公藤果實的質量)。結果，甲醇體積分數在25%～45%之間雷公藤紅素提取率呈上升趨勢，45%之后開始下降，45%時提取率最高。故本試驗確定45%甲醇為固定的提取溶劑。

3.1.2 提取時間 固定提取次數為1次、料液比為1∶10，分別考察提取時間為1、1.5、2、2.5、3 h條件下雷公藤紅素的提取率。結果，提取時間在1～2 h內雷公藤紅素提取率呈明顯上升趨勢，2.5 h之后基本趨于平穩(wěn)并幾乎沒有增加。故確定以提取時間1.5～2.5 h為正交試驗的考察水平。

3.1.3 提取次數 固定料液比為1∶10、提取時間為2 h，分別考察提取次數為1、2、3、4、5次時雷公藤紅素的提取率。結果，提取1～3次時雷公藤紅素提取率明顯增加，提取4～5次時提取率增加甚微?？紤]到提取3次可能已經將雷公藤紅素基本提取完全，故確定以提取1～3次為正交試驗的考察水平。

3.1.4 料液比 固定提取時間為2 h、提取1次，分別考察料液比為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12時雷公藤紅素的提取率。結果，隨著料液比的增加，雷公藤紅素提取率有所增加，而料液比為1∶8～1∶12時提取率增加趨勢不明顯?？紤]到今后的生產成本，故確定以料液比1∶8～1∶10為正交試驗的考察水平。

3.2 正交試驗

以提取時間(A)、提取次數(B)、料液比(C)為考察因素，以雷公藤紅素提取率為考察指標設計3因素3水平正交試驗。正交試驗因素與水平見表1，設計安排與結果見表2，方差分析結果見表3。

表1 因素與水平表Tab 1 Factorsand levels

由表2可知，極差R值顯示因素作用主次為B＞A＞C，即提取次數是重要影響因素。方差分析結果表明，提取次數對提取率的影響達到顯著水平(P＜0.05)。結合環(huán)境保護與經濟考量，確定最優(yōu)提取工藝組合為A3B3C1，即提取2 h、提取3次、料液比為1∶8。此條件下雷公藤紅素的提取率為0.995mg/g。

表2 正交試驗設計與結果Tab 2 Design and resultoforthogonal test

表3 方差分析結果Tab 3 Resultof varianceanalysis

3.3 驗證試驗

按照最優(yōu)提取工藝，稱取適量的獨子藤果實共3份，按“2.1”項下方法處理后，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定。結果，平均提取率為0.917mg/g(RSD=2.85%，n= 3)，表明此條件具有良好的重復性、工藝穩(wěn)定，可用于雷公藤紅素的提取。

4 討論

近年來，雷公藤紅素的多種藥理活性不斷被發(fā)現，如抗炎及免疫抑制、抗纖維化、抗腫瘤血管生成、增強瘦素敏感性等[5]，有望用于治療類風濕性關節(jié)炎[6]、糖尿病[7]、阿爾茨海默病[8]、肥胖癥[9]和多種癌癥[10]。雷公藤紅素的抗腫瘤機制一直不明確，直至2006年中美科學家聯合發(fā)現雷公藤紅素的抗癌新機制后，其抗白血病作用得到越來越多的重視[11]。

本試驗在文獻[12-13]的基礎上，比較了兩種流動相[乙腈-5%磷酸(80∶20)、甲醇-5%磷酸(80∶20)]，結果發(fā)現第2種流動相下對照品的峰形更好。比較了3種檢測波長(425、426、544 nm)，結果發(fā)現426 nm波長處有較好的吸收，干擾少;篩選了3種流速(0.8、1.0、1.2m L/m in)，結果發(fā)現流速為1.0m L/m in時分離效果較好，流速低時有拖尾現象，流速高時分離不完全。

目前，對雷公藤中活性成分的提取溶劑主要有水、甲醇、乙醇、二氯乙烷，本試驗在文獻[14-16]的基礎上，選擇了甲醇提取;因素與水平的設計參考文獻[17]，并對甲醇體積分數對提取效率的影響進行了單因素考察，最終確定45%甲醇作為提取溶劑。比較了直接進樣和經硅膠柱層析純化再進樣的色譜圖。結果顯示，前者雜質峰較多，對色譜柱的污染較大;而后者能有效去除其他極性雜質，雷公藤紅素分離較好，可有效排除其他干擾。

本試驗優(yōu)選得到的獨子藤果實中雷公藤紅素的最佳提取工藝為45%甲醇回流提取3次，每次2 h，料液比為1∶8。該法簡便易行、工藝穩(wěn)定，可用于獨子藤中雷公藤紅素的提取。

[1]中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒:第二冊[M].北京:科學出版社，1980:661.

[2]陳銘詳，李國成，魏佳純，等.獨子藤化學成分研究[J].中成藥，2011，33(4):651-655.

[3]Salm inen A，Lehtonen M，Paimela T，etal.Celastrol:molecular targets of thunder god vine[J].Biochem Biophys ResCommun，2010，394(3):439-442.

[4]夏玲紅，崔嵐.雷公藤紅素的藥理作用研究進展[J].醫(yī)藥導報，2009，28(6):730-732.

[5]Greenhill C.Obesity:celastrol identified as a leptinsensitizer and potential novel treatment for obesity[J].Nat Rev Endocrinol，2015，11(8):444.

[6]Cascao R，Vidal B，Raquel H，etal.Effective treatmentof rat adjuvant-induced arthritis by celastrol[J].Autoimmun Rev，2012，11(12):856-862.

[7]Grant CW，M oran-Paul CM，Duclos SK，et al.Testingagents for prevention or reversal of type 1 diabetes in rodents[J].PLoSOne，2013，8(8):e72989.

[8]Paris D，Ganey NJ，Laporte V，etal.Reduction ofβ-amyloid pathology by celastrol in a transgenicmousemodel of Alzheimer’s disease[J].JNeuroinflammation，2010，doi: 10.1186/1742-2094-3-17.

[9]Liu J，Lee J，Hernandez MAS，etal.Treatmentof obesity w ith celastrol[J].Cell，2015，161(5):999-1011.

[10]Liu Z，Ma L，Zhou GB.Themain anticancer bulletsof the Chinesemedicinal herb，thunder god vine[J].Molecules，2011，16(6):5283-5297.

[11]Uttarkar S，DasséE，Coulibaly A，et al.Targeting acute myeloid leukem ia w ith a smallmolecule inhibitor of the Myb/p300 interaction[J].Blood，2016，127(9):1173-1182.

[12]劉慧瓊，李國成，盧綺雯，等.HPLC法測定獨子藤中雷公藤紅素的含量[J].廣東藥學院學報，2010，26(5):489-491.

[13]劉法千，金芳，俞曉蘭，等.高效液相色譜法測定雷公藤多苷片中雷公藤紅素的含量[J].醫(yī)藥導報，2016，35(s1) 117-118.

[14]何昱，石森林，張茹萍，等.雷公藤多苷提取物中主要有效部位的含量比較[J].中國中醫(yī)急診，2014，23(5):812-815.

[15]周瓊，王定勇，張彥，等.獨子藤葉的二氯甲烷部位化學成分分析[J].中國實驗方劑學雜志，2016，22(14):64-69.

[16]張賀，江瑩，孟楣，等.HPLC法測定不同產地雷公藤藥材中雷公藤類脂甲的含量[J].中藥分析與鑒定，2014，25 (31):2916-2918.

[17]趙之麗，趙平，鄧光銳，等.多指標正交試驗優(yōu)化復方江南卷柏散提取工藝[J].中國藥房，2016，27(28):3996-3998.

Optim ization of M ethanol Extraction Technology for Trip terine in the Fruit of Celastrus monospermus by Orthogonal Design

XU Qirong，ZHOU Qiong，ZHANG Zhiping，CHEN Jiu(Dept.of Pharmacy，Guangzhou 12th Hospital，Guangzhou 510620，China)

OBJECTIVE:To optim ize the methanol extraction technology of tripterine in the fruit of Celastrus monospermus. METHODS:HPLC was adopted to determ ine the content of tripterine.Using extraction time，extraction times，solid-liquid ratio as investigation factors，extraction rate of tripterine as investigation index，orthogonal testwas designed，and verification testwas conducted.RESULTS:The optimalmethanol extraction technology was as follow as 45%methanol extracting 2 h each time w ith solid-liquid ratio of 1∶8 for 3 times.In the verification test，the average extraction rate of tripterine was 0.917 mg/g(RSD=2.85%，n=3).CONCLUSIONS:The optim ized methanol extraction technology is stable and feasible w ith high extraction rate，and is suitable for the extraction of tripterine in the fruit of C.monospermus.

Celastrusmonospermus;Tripterine;Single factor;Orthogonal test;HPLC

R932

A

1001-0408(2017)19-2677-03

2017-01-12

2017-05-01)

(編輯:劉明偉)

廣東省自籌經費類科技計劃項目(No.粵科規(guī)財字〔2015〕110號)

＊主管藥師。研究方向:臨床藥學。電話:020-38981270。E-mail:x82521326@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.24