沈偉鋒 邵平揚(yáng) 殷新光 姚明 鄒洪興 楊清萍

手足口病患者病原學(xué)快速診斷方法的比較研究

沈偉鋒 邵平揚(yáng) 殷新光 姚明 鄒洪興 楊清萍

目的 比較熒光RT-PCR法與膠體金免疫層析法（GICA）在手足口病（HFMD）患兒病原學(xué)快速診斷中的應(yīng)用價(jià)值，為實(shí)驗(yàn)室診斷提供參考。方法 選取HFMD患兒454例（其中重癥患兒190例，普通患兒264例）以及非腸道病毒感染、健康體檢兒童共117例。同時(shí)采集患兒急性期咽拭子和血清標(biāo)本各1份，分別進(jìn)行腸道病毒EV通用型、EV71型和CA16型病毒核酸以及血清EV71-IgM、CA16-IgM抗體檢測(cè)。比較兩種方法對(duì)EV71、CA16的檢測(cè)結(jié)果；并以RT-PCR法為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)GICA法檢測(cè)的診斷性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果 熒光RT-PCR法檢測(cè)重癥HFMD組EV71陽(yáng)性率72.6%（138/190），CA16陽(yáng)性率10.0%（19/190）；普通HFMD組EV71陽(yáng)性率28.0%（74/264），CA16陽(yáng)性率30.3%（80/264），兩組HFMD腸道病毒感染分布構(gòu)成比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=88.66，P=0.00）。454例HFMD患兒中，RT-PCR法與GICA法檢測(cè)EV71型，陽(yáng)性率分別為46.7%和58.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=39.01，P=0.00）；RT-PCR法與GICA法檢測(cè)CA16型，陽(yáng)性率分別為21.8%和30.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=22.74，P=0.00）。以RT-PCR法法為金標(biāo)準(zhǔn)，GICA法診斷EV71的靈敏度95.7%，特異度84.4%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值76.3%，陰性預(yù)測(cè)值95.2%，準(zhǔn)確度84.1%；診斷CA16的靈敏度89.9%，特異度86.7%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值65.4%，陰性預(yù)測(cè)值96.8%，準(zhǔn)確度87.4%。結(jié)論 GICA法是一種簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)方法，可用于HFMD病原體的快速篩查，與RT-PCR法具有較好的互補(bǔ)性；兩種方法聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HFMD的早期診斷與防控具有十分重要的意義。

手足口病 腸道病毒屬 核酸 抗體 診斷

手足口?。℉FMD）是由腸道病毒引起的兒童傳染病，多發(fā)于5歲以下兒童。引起HFMD的腸道病毒種類多，目前以腸道病毒71型（EV71）和柯薩奇病毒A16型（CA16）為最主要流行毒株，對(duì)HFMD病原體快速檢測(cè)及分型有利于HFMD的早期診斷和治療，也是危重病例救治的關(guān)鍵[1-2]。目前，HFMD病原體的實(shí)驗(yàn)診斷方法以實(shí)時(shí)熒光RT-PCR病毒核酸檢測(cè)與腸道病毒特異性IgM抗體檢測(cè)應(yīng)用最為普遍[3]。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法因具有較高的靈敏度和檢測(cè)效率，已成為HFMD病原學(xué)分型診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但受實(shí)驗(yàn)室條件限制，僅在大中型醫(yī)療機(jī)構(gòu)開(kāi)展。HFMD病例一般為散在的急癥患兒，往往伴有發(fā)熱癥狀，病情比較緊急，需要早期快速檢測(cè)確認(rèn)。膠體金免疫層析（GICA）法是目前應(yīng)用最為廣泛的EV71-IgM、CA16-IgM即時(shí)篩查方法，其檢測(cè)過(guò)程僅需幾分鐘，特別適合在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)開(kāi)展[4]。為探討HFMD病原學(xué)快速診斷方法的臨床應(yīng)用價(jià)值，筆者分別采用RT-PCR法和GICA法分別對(duì)HFMD患兒進(jìn)行腸道病毒核酸檢測(cè)及特異性IgM抗體檢測(cè)，對(duì)兩種方法進(jìn)行比較分析，為臨床快速甄別HFMD病原體及早期診斷提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2016年3至11月嘉興市第一醫(yī)院感染科就診的HFMD患兒454例，其中男235例，女219例；年齡6個(gè)月～5歲6個(gè)月，中位年齡20個(gè)月，HFMD臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)衛(wèi)生部頒布的《手足口病診療指南》（2010年版）[5]。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床癥狀表現(xiàn)為手、足、口腔等部位的斑丘疹、皰疹，伴或不伴發(fā)熱；（2）病程1～5d初次就診，未經(jīng)抗病毒治療的急性期患兒；（3）腸道病毒通用型（EV）核酸檢測(cè)陽(yáng)性；（4）重癥患兒出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)受累癥狀，表現(xiàn)為精神差、嗜睡、易驚、頭痛、嘔吐、譫妄、昏迷、肢體抖動(dòng)、肌陣攣、眼球震顫、共濟(jì)失調(diào)、眼球運(yùn)動(dòng)障礙、無(wú)力或急性弛緩性麻痹、驚厥等，體格檢查可見(jiàn)腦膜刺激征、腱反射減弱或消失、巴賓斯征等病理征陽(yáng)性[5]。根據(jù)臨床表現(xiàn)將454例HFMD患兒分為重癥HFMD組190例和普通HFMD組264例。同期選取嘉興市第一醫(yī)院兒科就診或體檢兒童117例作為非腸道病毒感染對(duì)照組，均經(jīng)直接免疫熒光法和熒光RT-PCR法鑒定為非腸道病毒感染，其中呼吸道合胞病毒陽(yáng)性17例、輪狀病毒陽(yáng)性13例、腺病毒感染陽(yáng)性9例、EB病毒陽(yáng)性27例、巨細(xì)胞病毒陽(yáng)性31例，以及健康體檢兒童20例。HFMD組和對(duì)照組性別、年齡、體重差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），詳見(jiàn)表1。

表1 HFMD組和對(duì)照組性別、年齡、體重的比較

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集與處理 每例患兒均留取急性期咽拭子樣本1份，用病毒專用采樣管采集，-70℃低溫保存，用于腸道病毒核酸檢測(cè)。同時(shí)采集患兒靜脈血2ml于EDTA-K2抗凝管,標(biāo)本離心后隨即進(jìn)行GICA檢測(cè)腸道病毒EV71-IgM和CA16-IgM抗體。

1.2.2 腸道病毒核酸檢測(cè) 病毒RNA提取試劑QLAamp Viral RNA Mini Kit購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；使用一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒腸道病毒EV通用型、EV71型、CA16型病毒RNA，試劑盒購(gòu)置廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司,使用美國(guó)ABI7500熒光PCR儀進(jìn)行核酸擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：50℃20minRNA逆轉(zhuǎn)錄；95℃15min預(yù)變性；94℃15s變性，56℃45s退火，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。RNA核酸提取及結(jié)果分析按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.3 EV71-IgM和CA16-IgM抗體檢測(cè) 采用GICA即時(shí)檢測(cè)急性期HFMD患兒以及臨床診斷非HFMD患兒血清EV71-IgM和CA16-IgM抗體。GICA法EV71-IgM、CA16-IgM抗體檢測(cè)板購(gòu)自北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)有限公司，嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行目測(cè)并判斷結(jié)果，不論色帶顏色深淺均按陽(yáng)性記錄。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)；兩組獨(dú)立樣本間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以RT-PCR法為診斷金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)GICA法進(jìn)行診斷性能評(píng)價(jià)，統(tǒng)計(jì)指標(biāo)包括靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、準(zhǔn)確度。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)EV71和CA16病毒核酸結(jié)果 454例HFMD患兒中，共檢出EV71（+）212例（46.7%）, CA16（+）99例（21.8%），EV71（-）CA16（-）143例（31.5%）。重癥HFMD組與普通HFMD組腸道病毒檢出結(jié)果見(jiàn)表2，兩組患兒腸道病毒檢出構(gòu)成比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=88.66，P=0.00）。

表2 重癥HFMD與普通HFMD患者腸道病毒核酸檢測(cè)結(jié)果[例（%）]

2.2 RT-PCR與GICA法檢測(cè)EV71結(jié)果比較 RTPCR法與GICA法檢測(cè)454例HFMD患者EV71陽(yáng)性率分為46.7%和58.6%，兩者陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=39.01,P=0.00），詳見(jiàn)表3。

表3 RT-PCR與GICA法檢測(cè)EV71結(jié)果比較[例（%）]

2.3 RT-PCR與GICA法檢測(cè)CA16結(jié)果比較 RTPCR法與GICA法檢測(cè)454例HFMD患者CA16陽(yáng)性率分為21.8%和30.0%，兩者陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=22.74，P=0.00），詳見(jiàn)表4。

表4 RT-PCR與GICA法檢測(cè)CA16結(jié)果比較[例（%）]

2.4 GICA法檢測(cè)非腸通病毒感染患兒血清EV71-IgM和CA16-IgM抗體結(jié)果 對(duì)97例非腸道病毒感染患兒血清EV71-IgM和CA16-IgM抗體結(jié)果檢測(cè)，共檢出EV71-IgM抗體陽(yáng)性3例，CA16-IgM抗體陽(yáng)性1例。對(duì)上述4例GICA法檢測(cè)EV71-IgM和CA16-IgM抗體陽(yáng)性患兒重新采集咽拭子，進(jìn)行腸道病毒EV、EV71、CA16核酸RNA確認(rèn)，均為病毒核酸陰性；采用ELISA法進(jìn)行特異性抗體EV71-IgM和CA16-IgM檢測(cè)，2例患兒EV71-IgM仍為陽(yáng)性，但追蹤檢測(cè)，EV71-IgM抗體滴度未升高。20例健康體檢兒童GICA法未檢出EV71-IgM和CA16-IgM陽(yáng)性結(jié)果。

2.5 GICA法診斷HFMD性能評(píng)價(jià) 以RT-PCR法為金標(biāo)準(zhǔn)，GICA法檢測(cè)HFMD患者EV71的靈敏度95.7%，特異度84.4%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值76.3%，陰性預(yù)測(cè)值95.2%,準(zhǔn)確度84.1%。GICA法檢測(cè)HFMD患者CA16的靈敏度89.9%，特異度86.7%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值65.4%，陰性預(yù)測(cè)值96.8%,準(zhǔn)確度87.4%，見(jiàn)表5～6。

表5 RT-PCR法與GICA法檢測(cè)HFMD患兒EV71的結(jié)果（例）

表6 RT-PCR法與GICA法檢測(cè)HFMD患兒CA16的結(jié)果（例）

3 討論

HFMD已成為兒童常發(fā)生的傳染病之一，每年5～7月份是高發(fā)期，5歲以下兒童是主要患兒[1]。2015年12月，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)了首個(gè)腸道病毒71型滅活疫苗的生產(chǎn)注冊(cè)申請(qǐng)，并于2016年3月18日正式上市[6]，臨床試驗(yàn)顯示，EV71疫苗對(duì)EV71感染HFMD的保護(hù)效力在90%以上，但受樣本數(shù)量限制，對(duì)EV71感染所致重癥病例的保護(hù)效力以及免疫的持久性等缺乏準(zhǔn)確評(píng)估，對(duì)CA16感染和其他腸道病毒感染的HFMD無(wú)保護(hù)作用[6-8]。因此，HFMD疫情的防控任務(wù)依然嚴(yán)峻。

由于HFMD早期癥狀不典型，臨床診斷易與咽峽炎等其他感染性疾病相混淆，臨床誤診、漏診現(xiàn)象較為多見(jiàn)，因此HFMD的早期快速確診以及EV71型與CA16型等腸道病毒鑒別仍需通過(guò)實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)的檢測(cè)確認(rèn)。目前，HFMD實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)確診主要依據(jù)[5]：（1）腸道病毒特異性核酸檢測(cè)陽(yáng)性；（2）分離出腸道病毒，并鑒定為EV71、CA16或其他可引起HFMD的腸道病毒；（3）急性期與恢復(fù)期雙份血清EV71、CA16或其他可引起HFMD的腸道病毒抗體4倍以上升高。因病毒分離法與雙份血清抗體檢測(cè)法臨床早期診斷應(yīng)用的局限性，且RT-PCR檢測(cè)病毒核酸其靈敏度和檢測(cè)效率較細(xì)胞培養(yǎng)法雙份血清抗體檢測(cè)法存在明顯優(yōu)勢(shì)，已成為HFMD病原學(xué)診斷及分型的金標(biāo)準(zhǔn)。但核酸檢測(cè)技術(shù)受實(shí)驗(yàn)室條件限制，不易在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)開(kāi)展。GICA法可即時(shí)檢測(cè)急性期患兒血清EV71-IgM、CA16-IgM，檢測(cè)耗時(shí)僅需幾分鐘，已成為HFMD早期病原學(xué)快速檢測(cè)的篩查方法。

本研究中，對(duì)454例HFMD急性期咽拭子標(biāo)本進(jìn)行熒光RT-PCR法檢測(cè)腸道病毒核酸檢測(cè)，EV71型、CA16型和非EV71非CA16的腸道病毒在HFMD重癥病例中所占比例分別是72.6%，10.0%和17.4%；在HFMD普通患兒中所占比例分別是28.0%，30.3%和41.7%?？梢?jiàn)EV71型腸道病毒在HFMD重癥病例中占主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[9-10]；同時(shí)非EV71非CA16型腸道病毒在HFMD患病原體中也占有一定比例，臨床亦不可忽視非EV71非CA16的其他腸道病毒在HFMD患兒，特別是重癥患兒中的檢出情況。熒光RT-PCR方法可同時(shí)檢測(cè)腸道病毒通用型、EV71型和CA16型，因此可區(qū)分EV71、CA16和非EV71非CA16腸道病毒，為臨床快速甄別HFMD病原體提供及時(shí)、可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

目前，GICA法檢測(cè)EV71-IgM、CA16-IgM抗體已在臨床普遍使用，檢測(cè)時(shí)間短，特別適合在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)以及急癥患者HFMD病原體的早期診斷。有文獻(xiàn)報(bào)道，EV71-IgM、CA16-IgM特異性抗體在患兒發(fā)病首日即可檢出，病程第5～8天達(dá)到峰值[2]，因此EV71-IgM、CA16-IgM抗體檢測(cè)可用于HFMD的早期實(shí)驗(yàn)室診斷。本研究對(duì)RT-PCR法與GICA法檢測(cè)454例HFMD急性期標(biāo)本結(jié)果進(jìn)行比較，兩種方法對(duì)EV71型、CA16型腸道病毒的陽(yáng)性檢出率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，GICA法對(duì)EV71型、CA16型腸道病毒的陽(yáng)性檢出率明顯高于RT-PCR法。對(duì)97例非腸道病毒感染患兒血清EV71-IgM和CA16-IgM抗體結(jié)果檢測(cè)，共檢出EV71-IgM抗體陽(yáng)性3例，CA16-IgM抗體陽(yáng)性1例，經(jīng)RT-PCR法檢測(cè)腸道病毒EV、EV71、CA16核酸RNA確認(rèn)，均為病毒核酸陰性；雙份標(biāo)本特異性抗體滴度確認(rèn)也排除HFMD可能，考慮是非特異性干擾引起的假陽(yáng)性結(jié)果。以RT-PCR法作為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)GICA法進(jìn)行方法性能評(píng)價(jià)，GICA法檢測(cè)EV71-IgM的靈敏度95.7%，特異度84.4%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值76.3%，陰性預(yù)測(cè)值95.2%,準(zhǔn)確度84.1%；GICA法檢測(cè)CA16-IgM的靈敏度89.9%，特異度86.7%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值65.4%，陰性預(yù)測(cè)值96.8%,準(zhǔn)確度87.4%。結(jié)果顯示，GICA法具有很高的靈敏度和陰性預(yù)測(cè)值，比較適用于HFMD病原體的早期篩查。但由于其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較低，提示方法存在較高的假陽(yáng)性率，對(duì)陽(yáng)性結(jié)果有必要作進(jìn)一步病原學(xué)的核酸確診；其次，GICA方法目前只能對(duì)EV71-IgM和CA16-IgM等少數(shù)腸道病毒特異性抗體進(jìn)行篩查，因此無(wú)法對(duì)非EV71非CA16型腸道病毒進(jìn)行鑒別，易造成臨床對(duì)非EV71非CA16型腸道病毒感染HFMD患兒的漏診，因此臨床對(duì)可疑HFMD患兒，特別是重癥患兒，需進(jìn)一步采用RT-PCR方法進(jìn)行腸道病毒通用型核酸檢測(cè)，以明確診斷。

因GICA法具有較高的檢測(cè)假陽(yáng)性率，而RT-PCR法亦可能存在一定的假陰性率，對(duì)臨床診斷疑似HFMD，而腸道病毒通用型EV核酸檢測(cè)陰性的患者，臨床診斷及GICA篩查結(jié)果具有一定的不確定性，本研究未將這類患兒納入研究。臨床實(shí)際工作中，對(duì)GICA法檢測(cè)EV71-IgM和CA16-IgM結(jié)果陽(yáng)性而RT-PCR法核酸陰性患兒，建議進(jìn)行RT-PCR復(fù)查，必要時(shí)重新留取咽拭子標(biāo)本，以避免因核酸提取或標(biāo)本污染造成RTPCR結(jié)果的假陰性影響。

綜上所述，RT-PCR法可區(qū)分EV71、CA16和非EV71非CA16腸道病毒感染HFMD，對(duì)HFMD腸道病毒病原體檢測(cè)實(shí)現(xiàn)全覆蓋，但受實(shí)驗(yàn)室條件限制，基層醫(yī)院不易開(kāi)展；GICA法是一種簡(jiǎn)便、敏感的檢測(cè)方法，具有較高的陰性預(yù)測(cè)值，可用于HFMD病原體的快速篩查。兩種方法在HFMD病原學(xué)早期診斷中具有重要的實(shí)驗(yàn)室診斷價(jià)值。

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（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.14.2017-624

浙江省科技廳公益技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目（2015C33279）；嘉興市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013AY21042-7）

314001 嘉興市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科（沈偉鋒、邵平揚(yáng)、姚明、鄒洪興、楊清萍）；嘉興市婦幼保健院消化科（殷新光）

沈偉鋒，E-mail：jxshwf@qq.com

【 Abstract】 Objective To compare the application of colloidal gold immunochromatography assay(GICA)to fluorescence RT-PCR in rapid pathogenic diagnosis of hand,foot and mouth disease(HFMD). Methods Four hundred and fifty four children with HFMD diagnosed in our hospital from March to November 2016 were enrolled,including 190 severe cases and 264 mild case;and 117 healthy children served as controls.The throat swabs and serum samples were collected.The nucleic acids of enterovirus,enterovirus type 71(EV71),Coxsackievirus A16(CA16)were determined by RT-PCR and GICA,the serum antibody tests for EV71-IgM and CA16-IgM were also performed．The test results of EV71 and CA16 by using two methods were compared;and RT-PCR was taken as gold standard to evaluate the diagnostic capacity of GICA. Results The positive rates of EV71 and CA16 by RT-PCR method in severe patients were 72.6%(138/190)and 10.0% (19/190),in mild patients were 28% (74/264)and 30.3%(80/264),respectively(χ2=88.66,P=0.01).The positive rates of EV71 in all 454 cases by RT-PCR and GICA were 46.7%and 58.6%,respectively(χ2=39.01,P=0.01),the positive rates of CA16 by RT-PCR and GICA were 21.8%and 30.0%, respectively(χ2=22.74,P=0.01).With RT-PCR results as gold standard,the sensitivity,specificity,positive predictive value, negative predictive value and the accuracy of GICA in detection of EV71 were 95.7%,84.4%,76.3%,95.2%and 84.1%,those for CA16 were 89.9%,86.7%65.4%,96.8%and 87.4%,respectively. Conclusion GICA is a simple,sensitive method in rapid screening pathogens of hand,foot and mouth disease,which can be used as a complementary method to RT-PCR.