謝華夏 徐志遠 鄭國淀 黃挺 鄭國威 滕飛 呂航 程向東

槐耳清膏聯(lián)合順鉑改變胃癌SGC7901細胞周期分布的實驗研究

謝華夏 徐志遠 鄭國淀 黃挺 鄭國威 滕飛 呂航 程向東

目的 觀察槐耳清膏聯(lián)合順鉑（DDP）作用于人胃腺癌SGC7901細胞后細胞周期的變化，并探討其可能的作用機制。方法 通過細胞流式實驗，觀察不同濃度槐耳清膏、DDP及兩藥聯(lián)合作用于胃癌SGC7901細胞24h后細胞周期的變化情況，并通過Western blot檢測不同濃度的槐耳清膏、DDP及兩藥聯(lián)合作用于胃癌SGC7901細胞后，細胞周期相關(guān)蛋白ATM、H2AX、cdc-2、CyclinB1等的表達情況。結(jié)果 細胞流式實驗結(jié)果顯示，槐耳清膏能夠阻滯SGC7901細胞于G2/M期，DDP能夠阻滯SGC7901細胞于S期，而兩藥聯(lián)用后S期和G2/M期都有阻滯。Western blot實驗結(jié)果顯示，槐耳清膏、DDP均可上調(diào)p-ATM、γ-H2AX蛋白表達，同時下調(diào)CyclinB1蛋白表達，且兩藥聯(lián)用后效果更加明顯。結(jié)論 槐耳清膏、DDP能夠通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白的表達改變細胞周期，抑制細胞增殖，與槐耳清膏聯(lián)用可提高DDP對胃癌的療效。

胃癌 槐耳 DDP 細胞周期

槐耳清膏是由槐耳菌質(zhì)經(jīng)熱水抽提后得到的，含有豐富有機成分和10多種礦物質(zhì)元素，主要活性成是單糖和氨基酸組成的結(jié)合蛋白[1]。研究表明其具有抑制腫瘤血管生成[2]、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[3]、增加化療敏感性及逆轉(zhuǎn)耐藥的功效[4-5]。筆者團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，槐耳清膏對人胃癌細胞具有抑制生長、誘導(dǎo)凋亡、增加化療敏感性的作用[4，6]?；诖耍狙芯繉⒉煌瑵舛鹊幕倍甯?、順鉑（DDP）及兩藥聯(lián)合作用于胃癌細胞SGC7901，觀察細胞周期改變，并探計其作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人胃腺癌細胞株SGC7901購自南京凱基生物科技有限公司；FBS、RPMI 1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；RNA酶、PI染液購自美國Sig－ma公司；槐耳清膏由啟東蓋天力藥業(yè)有限公司提供，配制方法：2g槐耳清膏溶于20ml RPMI1640培養(yǎng)基中，用0.22 μm微孔濾膜過濾后得到100mg/ml儲備液，于-20℃長期儲存，臨用前解凍，用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋到所需濃度；抗-p-ATM抗體（美國Abcam公司，ab81292，GR27461-26），抗-ATM抗體（美國Abcam公司，ab32420，GR165725-2），抗-γ-H2AX抗體（美國Abcam公司，ab32505，GR106629-16），抗-H2AX抗體（美國Abcam公司，ab31343，GR115423-4），抗-cdc-2抗體（美國Epitomics公司，3787-S，YH120302C），抗-p-cdc-2抗體（美國Epitomics公司，5757-S，YI102703CS），抗-Cyclin B1抗體（美國 Epitomics公司，1495-S，YJ022411P），抗-β-actin抗體（美國Proteintech公司，66009-1-1g，10002260）；CLASS100型細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，流式細胞儀購自美國BD CantoⅡ公司，電泳儀、蛋白印記檢測系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) SGC7901細胞在含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)傳代。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞周期改變 取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板，每孔含2×105個細胞，常規(guī)條件下培養(yǎng)24h后去上清液?；倍M細胞加入含有不同濃度（0、1.5、3mg/ml）槐耳清膏的培養(yǎng)液2ml，DDP組細胞加入含有不同濃度（0、2.5、5μg/ml）DDP的培養(yǎng)液2ml，槐耳+DDP組細胞加入含有不同濃度兩藥（槐耳清膏0mg/ml+DDP 0μg/ml、槐耳清膏1.5mg/ml+DDP 2.5μg/ ml、槐耳清膏3mg/ml+DDP 5μg/ml）的培養(yǎng)液2ml。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后，常規(guī)消化、離心，收集細胞，制成單細胞懸液；4℃PBS洗2次，用70%冰乙醇4℃固定1h，4℃PBS洗2次，用3ml PBS重懸細胞，加入RNA酶至終濃度為100μg/L，37℃水浴30min，加入PI染液至終濃度為50μg/L，4℃避光 30min，流式細胞儀上機，488nm波長激發(fā)檢測細胞周期并分析。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 Western blot檢測細胞周期相關(guān)蛋白（ATM、H2AX、cdc-2、CyclinB1等）的表達 槐耳組（槐耳清膏1.5mg/ml）、DDP組（DDP 2.5μg/ml）、槐耳+DDP組（槐耳清膏1.5mg/ml+DDP 2.5μg/ml）細胞培養(yǎng)24h后，收集2×106/ml細胞，加入300μl細胞裂解混合液（PMSF：裂解液=1∶99，使PMSF最濃度為1mmol/L），冰上裂解30min，且用BCA方法定量蛋白質(zhì)。上樣前取30～40μg等量蛋白質(zhì)加上等體積5×上樣緩沖液，于100℃變性10min后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。電

泳結(jié)束后，恒流260mA，90～120min將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到PVDF膜上，然后用含5%牛血清白蛋白的TBST室溫封閉90min，再進行一抗孵育，將一抗按照抗體說明書推薦比例溶于抗體封閉液中，與對應(yīng)PVDF膜共同封閉，4℃下過夜。然后，用TBST（TBS＋0.1%Tween 20）于搖床上漂洗膜，10min/次，共4次；再使用對應(yīng)的二抗孵育，同樣按照相應(yīng)比例稀釋（1∶2 000），室溫孵育1～ 2h，再用TBST漂洗膜，10min/次，共4次。顯色并用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集和分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組SGC7901細胞的細胞周期改變 見表1。

表1 3組SGC7901細胞的細胞周期改變（%）

由表1可見，1.5、3mg/ml濃度的槐耳清膏可阻滯SGC7901細胞周期于G2/M期，G2/M期細胞比例分別為13.22%、30.64%；2.5、5μg/ml濃度的DDP可阻滯SGC7901細胞周期于 S期，S期細胞比例分別為 39.94%、52.78%；槐耳清膏1.5mg/ml+DDP 2.5μg/ml、槐耳清膏3mg/ml+DDP 5μg/ml兩藥聯(lián)用可阻滯SGC7901細胞周期于G2/M期、S期，G2/M期細胞比例分別為14.84%、13.64%，S期細胞比例分別為43.54%、56.65%。

2.2 3組SGC7901細胞的細胞周期相關(guān)蛋白表達情況 見圖1。

由圖1可見，槐耳清膏（1.5mg/ml）、DDP（2.5μg/ml）單藥及兩藥聯(lián)用（槐耳清膏1.5mg/ml+DDP 2.5μg/ml）后，SGC7901細胞p-ATM、γ-H2AX蛋白表達水平均上調(diào)，CyclinB1蛋白表達水平下調(diào)，兩藥聯(lián)用后表達水平變化更明顯，而ATM、cdc-2、p-cdc-2蛋白表達水平無明顯變化。

圖1 3組SGC7901細胞的細胞周期相關(guān)蛋白表達電泳圖

3 討論

近年來，中藥因其獨特的低毒、抗腫瘤功效，在臨床上已廣泛用于治療腫瘤?；倍甯嘧鳛榛倍婢臒崴崛∥铮驯蛔C實具有抑制腫瘤細胞生長、轉(zhuǎn)移及提高人體免疫力的功效。研究發(fā)現(xiàn)，槐耳清膏對肺癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移有抑制作用，筆者團隊在前期研究中也發(fā)現(xiàn)槐耳清膏能夠通過誘導(dǎo)胃癌細胞MKN45、SGC7901凋亡抑制其細胞增殖的效應(yīng)，并且能夠增加DDP對胃癌細胞MKN45的化療敏感性。通過細胞流式實驗發(fā)現(xiàn)槐耳清膏單藥能改變?nèi)宋赴㏒GC7901細胞的細胞周期分布情況，阻滯細胞周期于G2/M期，而槐耳清膏聯(lián)合DDP共同作用時，在增加G2/ M期阻滯的同時，還能夠顯著增加DDP對S期的阻滯效應(yīng)；進一步通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn)槐耳清膏能夠調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白，與DDP聯(lián)合作用能夠促進對DDP對周期相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)。

惡性腫瘤最基本的生物學特征是腫瘤細胞失控性增殖，而細胞失控性增殖的生物學基礎(chǔ)是細胞周期調(diào)控紊亂[7]。本研究結(jié)果顯示，槐耳清膏、DDP單藥作用于SGC7901細胞后，能夠分別阻滯細胞周期于G2/M期、S期，而G2/M期DNA損傷檢驗點是細胞周期至有絲分裂前細胞自我修復(fù)的最后階段[8]。進一步Western blot實驗，結(jié)果顯示槐耳清膏、DDP單藥及兩藥聯(lián)用能夠上調(diào)SGC7901細胞γ-H2AX、p-ATM蛋白的表達，而γ-H2AX是判斷早期DNA雙鍵斷裂的金標準[8]。由此可見，槐耳清膏和DDP是通過誘發(fā)DNA雙鍵斷裂來改變細胞周期的，進而誘導(dǎo)細胞凋亡，兩藥共同作用后表現(xiàn)出聯(lián)合效應(yīng)。

細胞周期中如果出現(xiàn)DNA損傷，將激活A(yù)TM和Rad-3相關(guān)蛋白（ART）激酶，并將DNA損傷信號傳導(dǎo)到下游靶蛋白，啟動應(yīng)激系統(tǒng)，產(chǎn)生細胞周期阻滯，為DNA修復(fù)或啟動細胞凋亡程序提供時間[9-10]。本研究中經(jīng)槐耳清膏、DDP單藥和兩藥聯(lián)用后的SGC7901細胞的ATM基因被激活，即p-ATM的表達增加。這說明槐耳清膏、DDP都誘發(fā)了DNA的損傷，進而出現(xiàn)細胞周期被阻滯于G2期，且兩藥聯(lián)合作用后，對ATM的激活效應(yīng)增加。

此外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)槐耳清膏、DDP均能下調(diào)CyclinB1蛋白表達水平，兩藥聯(lián)用后效應(yīng)更加明顯。CDK1-CyclinB1復(fù)合物已被證實是細胞由G2期進入M期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白[10]，CDK1-CyclinB1復(fù)合物合成減少引起了細胞周期阻滯于G2期，這也可能是槐耳清膏誘導(dǎo)SGC7901細胞凋亡又一個作用機制，同時說明了槐耳清膏、DDP對DNA的損傷作用可能發(fā)生在G2/M期。

綜上所述，槐耳清膏通過誘發(fā)DNA損傷，激活A(yù)TM細胞信號通路，誘導(dǎo)人胃癌SGC7901細胞的細胞周期阻滯于G2/M期，而DDP阻滯SGC7901細胞的細胞周期于S期，兩者共同作用可提高胃癌SGC7901細胞對DDP的化療敏感性，即與槐耳清膏聯(lián)用可能提高DDP對胃癌的療效。

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Combined effects of fungi Huaier extracts and cis-platin on cell cycle of human gastric cancer cell line SGC7901

XIE Huaxia，XU Zhiyuan，ZHENG Guodian,et al.Department of General Surgery,The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310018,China

Gastric cancer Huaier DDP Cell cycle

2016-03-28）

（本文編輯：李媚）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.14.2016-2035

浙江省重大科技專項計劃項目（2013C03044-4）

310018 杭州，浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院下沙院區(qū)普外科（謝華夏）；浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院湖濱院區(qū)胃腸外科（徐志遠、程向東），中心實驗室（呂航）；浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院（鄭國淀、黃挺、鄭國威、滕飛）

程向東，E-mail：chengxd@126.com

【 Abstract】 Objective To investigate the combined effects of fungi Trametes robiniophila murr(Huaier)extracts and cis-platin(DDP)on cell cycle of gastric cancer cell line SGC7901in vitro and the underline mechanism. Methods Human gastric cancer SGC7901 cells were treated with Huaier and/or DDP in vitro.The cell cycle was examined by flow cytometry;and the expression of cell cycle-related proteins was detected by Western blot. Results The ratio of cells in G2/M phase of SGC7901 cells treated with Huaier were increased in a dose-dependent manner compared with control group;and the ratio of cells in S phase in DDP-treated groups were increased also in a dose-dependent manner.The cells arrested at G2/M and S phases were markedly increased in Huaier and DDP combined treatment groups.The expression of CyclinB1 was down-regulated and expression of p-ATM，γ-H2AX was up-regulated in Huaier and/or DDP treatment groups. Conclusion Huaier and DDP can change cell cycle through up-regulation of p-ATM,γ-H2AXexpression and down-regulation of CyclineB1 expression in human gastric cancer SGC7901 cells.