靳馥宇， 張 惠， 李 倩， 徐 洪， 楊 方， 張麗娟

抗纖維化短肽Ac-SDKP對Ang Ⅱ誘導肺泡Ⅱ型上皮細胞向肌成纖維細胞分化的調(diào)控作用與機制

靳馥宇， 張 惠， 李 倩， 徐 洪， 楊 方， 張麗娟

目的 探討抗纖維化短肽N-乙?；?絲氨酰-天門冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)對血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)誘導肺泡Ⅱ型上皮細胞向肌成纖維細胞分化的調(diào)控作用與機制。 方法 采用AngⅡ誘導肺泡Ⅱ型上皮細胞向肌成纖維細胞分化，并予以纈沙坦、Ac-SDKP和PD98059預處理。免疫組織化學染色法檢測E-鈣黏蛋白(E-cad)的表達，激光共聚焦掃描顯微鏡檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(P-ERK)1/2的共定位表達。Western-blot法檢測E-cad、α-SMA、Ⅰ型膠原、血管緊張素受體1(AT1)、P-ERK1/2及ERK1/2的定量表達。 結(jié)果 與對照組比較，Ang Ⅱ刺激組細胞E-cad表達下降，α-SMA、Ⅰ型膠原、AT1和P-ERK1/2的表達增高；而纈沙坦、Ac-SDKP、PD98059預處理后，均降低Ang Ⅱ誘導的A549細胞α-SMA、Ⅰ型膠原、AT1的表達升高及E-cad表達下降(P<0.05)。 結(jié)論 AngⅡ-AT1-ERK1/2通路介導肺泡Ⅱ型上皮細胞向肌成纖維細胞分化，而Ac-SDKP可通過AngⅡ-AT1-ERK1/2通路介導抑制肺泡Ⅱ型上皮細胞向肌成纖維細胞分化。

脯氨酸； 氨； 肺泡/細胞學； 成纖維細胞； 腎素-血管緊張素系統(tǒng)； 血管緊張素Ⅱ； 矽肺； 纖維化

近年來研究發(fā)現(xiàn)，在長期受到致纖維化因素的刺激時，上皮細胞和成纖維細胞將會發(fā)生表型轉(zhuǎn)變并分化為肌成纖維細胞，其收縮、遷移和合成細胞外基質(zhì)的能力遠遠大于成纖維細胞，被認為是器官纖維化形成過程中的主要效應細胞[1-3]。而腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin systems, RAS)穩(wěn)態(tài)失衡可能與矽肺的發(fā)生、發(fā)展有關，其關鍵調(diào)節(jié)肽，即血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)在矽肺患者血清中表達上調(diào)，但其機制有待進一步探討[4-5]。N-乙?；?絲氨酰-天門冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartly-lysyl-proline，Ac-SDKP)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有抗器官纖維化作用的短肽，在體內(nèi)可被ACE的N端所清除，其含量下降與纖維化形成有關[6]。因此，本研究擬以人肺泡Ⅱ型上皮細胞株A549為研究對象，觀察Ac-SDKP能否通過對ACE-血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)-血管緊張素受體1(AT1)軸的調(diào)控，抑制人肺泡Ⅱ型上皮細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化及膠原蛋白的合成，探討Ac-SDKP抗矽肺纖維化的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 人肺泡Ⅱ型上皮細胞株A549(中科院上海細胞庫)；Ham’s-F12培養(yǎng)基，胎牛血清(美國Gibco公司)；AngⅡ,PD98059(美國Sigma公司)；纈沙坦(日本東京化成株式會社)；兔抗Ⅰ型膠原(武漢博士德公司)；兔抗E-鈣黏蛋白(E-cad，美國Abcam公司)；兔抗α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)，鼠抗ERK1/2及鼠抗磷酸化-ERK1/2(美國BD公司)；兔抗GAPDH(美國Santa Cruz公司)；二步法通用型免疫組織化學試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，PV6000)；ECL顯色試劑盒(美國GE公司)；Rhodamine-山羊抗兔IgG/FITC-山羊抗小鼠IgG(03-1506/02-1806，美國KPL公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與實驗分組 人肺泡Ⅱ型上皮細胞株A549用含10%胎牛血清的Ham’s-F12培養(yǎng)基在37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2孵育箱中培養(yǎng)，待細胞生長達次融合狀態(tài)時，以無血清培養(yǎng)基同步化24 h后進行誘導分組：(1)對照組：無血清Ham’s-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；(2)AngⅡ刺激組：無血清培養(yǎng)條件下，給予AngⅡ(10-7mol/L)誘導刺激48 h；(3)AngⅡ+AT1抑制劑(纈沙坦)處理組：無血清培養(yǎng)條件下，先給予纈沙坦(10-6mol/L)作用1 h后，再給予AngⅡ(10-7mol/L)共同孵育48 h；(4)AngⅡ+Ac-SDKP處理組：無血清培養(yǎng)條件下，先給予Ac-SDKP(10-8mol/L)作用1 h后，再給予AngⅡ(10-7mol/L)共同孵育48 h；(5)AngⅡ+ERK1/2通路Ⅰ抑制劑(PD98059)處理組：無血清培養(yǎng)條件下，先給予PD98059(10-5mol/L)作用1 h后，再給予AngⅡ(10-7mol/L)共同孵育48 h。

1.2.2 免疫細胞化學染色法檢測E-cad的表達 對數(shù)生長期的細胞爬片培養(yǎng)至次融合狀態(tài)時進行同步化處理，按照實驗分組分別加入相應試劑(n=3)，培養(yǎng)48 h后收集細胞，以4%多聚甲醛固定。染色步驟按免疫細胞化學試劑說明書進行，DAB顯色，其中E-cad抗體稀釋度為1∶100。采用顯微數(shù)碼相機(DP80，奧林巴斯有限公司)進行圖像采集。

1.2.3 免疫熒光化學染色法檢測α-SMA和P-ERK1/2的共表達 各組細胞按實驗分組進行給藥刺激后，以4%多聚甲醛固定。染色前細胞水化10 min，高壓修復20 s，PBS洗3次后，正常山羊血清封閉20 min，滴加α-SMA(1∶200)和P-ERK1/2(1∶300)混合一抗，4 ℃過夜，洗去一抗后，滴加熒光二抗(1∶200)，37 ℃孵育1 h，DAPI復染，采用顯微數(shù)碼相機進行圖像采集。

1.2.4 Western-blot法檢測E-cad、α-SMA、Ⅰ型膠原、AT1、P-ERK1/2及ERK1/2的定量表達 按照文獻[6]方法提取并測定蛋白濃度，每孔90 μg上樣，SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜。一抗(E-cad抗體1∶300稀釋；α-SMA、Ⅰ型膠原、AT1、GAPDH抗體1∶500稀釋；P-ERK1/2及ERK1/2 按1∶800稀釋)4 ℃孵育過夜；二抗(1∶5 000稀釋)37 ℃孵育30 min；ECL顯色。圖像掃描后，以Image J軟件對蛋白表達條帶進行吸光度(OD)值的定量分析，目的蛋白條帶OD值經(jīng)內(nèi)參平衡后進行組間比較。

2 結(jié) 果

2.1 免疫細胞化學染色法檢測各組細胞E-cad的表達 AngⅡ刺激后，部分細胞體積增大，由原來的鋪路石狀變?yōu)殚L梭形或者紡錘形，細胞E-cad表達較對照組顯著減弱或缺失。予以纈沙坦、Ac-SDKP、PD98059預處理后，均明顯減弱了AngⅡ?qū)-cad表達的抑制作用(圖1)。

A：對照組細胞呈鋪路石狀，E-cad陽性表達；B：AngⅡ刺激組細胞變?yōu)殚L梭形或者紡錘形，E-cad陰性或弱陽性表達；C(AngⅡ+纈沙坦處理組)、D(AngⅡ+Ac-SDKP處理組)和E(AngⅡ+PD98059處理組)：細胞形態(tài)較對照組變化不明顯，偶見長梭形或者紡錘形細胞，細胞E-cad表達呈弱陽性. A2～E2為A1～E1的局部放大.圖1 人肺泡Ⅱ型上皮細胞E-cad的表達Fig 1 The expression of E-cad in human type Ⅱ alveolar epithelial cells

2.2 免疫熒光細胞化學染色法檢測各組細胞α-SMA及P-ERK1/2的共定位表達 AngⅡ刺激后，大部分細胞P-ERK1/2表達呈陽性，同時細胞胞體內(nèi)出現(xiàn)了平行或交叉排列的肌絲樣微結(jié)構(gòu)，即α-SMA表達顯著增強。予以纈沙坦、Ac-SDKP或PD98059的預處理明顯抑制了AngⅡ誘導的A549細胞P-ERK1/2和α-SMA表達(圖2)。

2.3 Western-blot法檢測各組細胞E-cad、α-SMA、Ⅰ型膠原、AT1、P-ERK1/2及ERK1/2的定量表達 AngⅡ刺激48 h后，上皮標志物E-cad蛋白表達下調(diào)，是對照組的39.4%；而AngⅡ刺激下α-SMA、Ⅰ型膠原、AT1和P-ERK1/2的表達顯著增高，分別是對照組的19.04，8.67，1.76及5.39倍，差別具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而纈沙坦、Ac-SDKP、PD98059均能夠顯著降低AngⅡ誘導的A549細胞α-SMA、Ⅰ型膠原、AT1的表達升高，降低AngⅡ誘導的E-cad表達下降。其中，纈沙坦、Ac-SDKP、PD98059預處理組的α-SMA蛋白表達分別為AngⅡ誘導組的16.2%，15.1%及51.1%；Ⅰ型膠原分別為AngⅡ誘導組的52.0%，27.6%及62.2%；AT1蛋白表達分別為AngⅡ誘導組的65.2%，33.6%及33.4%；P-ERK1/2蛋白表達分別為AngⅡ誘導組的41.3%，58.2%及19.7%；E-cad蛋白表達分別為AngⅡ誘導組的2.37，1.63及1.96倍，差別具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1，圖3)。

A：對照組細胞內(nèi)α-SMA、P-ERK1/2表達陰性；B：AngⅡ刺激組大部分細胞胞體內(nèi)出現(xiàn)了平行或交叉排列的肌絲樣微結(jié)構(gòu)，P-ERK1/2陽性表達；C(AngⅡ+纈沙坦處理組)、D(AngⅡ+Ac-SDKP處理組)和E(AngⅡ+PD98059處理組)：3組少數(shù)細胞α-SMA、P-ERK1/2共陽性表達.圖2 人肺泡Ⅱ型上皮細胞α-SMA及P-ERK1/2的共定位表達Fig 2 The co-expression of α-SMA and P-ERK1/2 in human type Ⅱ alveolar epithelial cells

3 討 論

矽肺是常見的、危害嚴重的職業(yè)性塵肺病。盡管國內(nèi)外在矽肺的防治方面做了大量工作，但是由于矽肺發(fā)病的具體機制尚不十分明確，所以目前控制或減少矽肺病發(fā)生的工作重點仍放在如何采取有效的防護措施上，而針對矽肺患者仍缺乏有效的治療手段和藥物來阻抑矽肺纖維化帶來的肺部病變和損傷。因此，探討矽肺的發(fā)病機制和尋求有效的抑制矽肺纖維化治療措施一直是職業(yè)病防治研究領域中的重要課題。

表1 人肺泡Ⅱ型上皮細胞E-cad、α-SMA、Ⅰ型膠原、AT1、P-ERK1/2及ERK1/2的定量表達

AngⅡ：血管緊張素Ⅱ； E-cad：E-鈣黏蛋白； α-SMA：α-平滑肌肌動蛋白； AT1：血管緊張素受體1； P-ERK：磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶. 與對照組比較，☆：P<0.05；與AngⅡ刺激組比較，Δ：P<0.05.

AngⅡ：血管緊張素Ⅱ； E-cad：E-鈣黏蛋白； α-SMA：α-平滑肌肌動蛋白； AT1：血管緊張素受體1； P-ERK：磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶. 1：對照組；2：AngⅡ刺激組；3：AngⅡ+纈沙坦處理組；4：AngⅡ+Ac-SDKP處理組；5：AngⅡ+PD98059處理組.圖3 人肺泡Ⅱ型上皮細胞E-cad、Ⅰ型膠原、α-SMA、AT1、P-ERK1/2及ERK1/2的定量表達Fig 3 The expressions of E-cad, collagen typeⅠ, α-SMA, AT1, P-ERK1/2 and P-ERK1/2 in human type Ⅱ alveolar epithelial cells

Ac-SDKP是1989年首次從胎牛骨髓中提取的四肽，它廣泛存在于人體的血液和組織中，近年來的研究證實，Ac-SDKP具有抗器官纖維化作用，能夠通過抑制靶器官膠原的沉積，減輕致病因素導致的器官纖維化的程度，具有潛在的藥用開發(fā)價值[7-10]。本課題組首次報道了Ac-SDKP具有抗矽肺纖維化的作用，證實矽肺纖維化發(fā)生過程中，存在上皮細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化，Ac-SDKP能夠通過抑制上皮細胞向肌成纖維細胞分化而發(fā)揮其抗矽肺纖維化的作用，然而其具體機制仍需進一步研究探討[11-13]。

已有研究表明，RAS在多種器官(如肝、腎、肺等)的纖維化形成過程中具有重要作用[14-16]。Ac-SDKP是RAS重要的生理性調(diào)節(jié)肽，在體內(nèi)可被ACE的N端清除，而肺又是RAS的靶器官之一。基于以上研究，推測RAS系統(tǒng)在Ac-SDKP抗矽肺纖維化作用中可能發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ刺激后，A549細胞形態(tài)由原來的鋪路石狀變?yōu)殚L梭形或者紡錘形，上皮細胞標記蛋白E-cad表達下調(diào)，同時出現(xiàn)Ⅰ型膠原以及肌成纖維細胞標記物α-SMA的表達，提示在AngⅡ刺激下，Ⅱ型肺泡上皮細胞發(fā)生了向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化。此外，在AngⅡ誘導上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生的同時，A549細胞AT1以及P-ERK1/2的表達出現(xiàn)上調(diào)，而采用AT1抑制劑(纈沙坦)和ERK1/2信號阻斷劑(PD980589)預處理后再給予AngⅡ刺激，則AngⅡ的上述作用減弱，提示AngⅡ能夠通過其受體AT1蛋白活化ERK1/2通路，從而誘導上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。另一方面，采用Ac-SDKP對A549細胞進行預處理后再給予AngⅡ刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ac-SDKP具有類似纈沙坦和ERK1/2信號阻斷劑的作用，即Ac-SDKP抑制AngⅡ誘導的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的同時，抑制了AT1蛋白的表達以及ERK1/2通路的活化。本研究結(jié)果提示，Ac-SDKP可通過對AngⅡ-AT1-ERK1/2通路的調(diào)控而抑制肺泡Ⅱ型上皮細胞向肌成纖維細胞的分化，進而抑制膠原的合成而發(fā)揮抗矽肺纖維化作用。這為將Ac-SDKP開發(fā)為一種有效的抗矽肺纖維化藥物提供了進一步的理論與實驗依據(jù)。

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(編輯：何佳鳳)

Effect and Mechanism of the Anti-fibrotic Tetrapeptide Ac-SDKP on the Differentiation of Human Type Ⅱ Alveolar Epithelial Cell into Myofibroblasts Induced by AngⅡ

JIN Fuyu, ZHANG Hui, LI Qian, XU Hong, YANG Fang, ZHANG Lijuan

Medical Experiment Research Center, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China

Objective To investigate the regulation effect and mechanism of the anti-fibrotic tetrapeptide (N-acetyl-seryl-aspartly-lysyl-proline, Ac-SDKP) on the differentiation of human type Ⅱ alveolar epithelial cell into myofibroblasts induced by angiotensin(Ang Ⅱ). Methods Expressions of E-cad and α-SMA cells were detected by immunohistochemistry. Coexpression of SMA and P-ERK1/2 was detected by confocal laser scanning microscopy. Expressions of E-cad, α-SMA, collagen type Ⅰ, AT1, P-ERK1/2 and ERK1/2 were quantitatively analyzed by Western-blot method. Results Compared with the control group, the expression of E-cad in Ang Ⅱ induced cells decreased. At the same time, expressions of α-SMA, type Ⅰ collagen, AT1 and P-ERK1/2 were increased compared with that in control group. However, Ac-SDKP, Valsartan and PD98059 reduced expressions of α-SMA, type Ⅰ collagen, AT1 and P-ERK1/2 which were induced by Ang Ⅱ, while increased the expression of E-cad expression. Conclusion Ang Ⅱ -AT1-ERK1/2 pathway mediates the differentiation of alveolar type Ⅱ epithelial cells into myofibroblasts, and Ac-SDKP can inhibit the differentiation of alveolar type Ⅱ epithelial cells into myofibroblasts by Ang Ⅱ -AT1-ERK1/2 pathway.

proline; ammonia; pulmonary alveoli/cytology; fibroblasts; renin-angiotensin system; angiotensin Ⅱ; silicosis; fibrosis

2016-11-02

國家自然科學基金(81472953)；河北省自然科學基金(H201609170)；河北省教育廳課題(ZC2016002)；華北理工大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201414850126)

華北理工大學 醫(yī)學實驗研究中心，唐山 063000

靳馥宇，男，華北理工大學醫(yī)學實驗技術專業(yè)2014級本科在讀

張麗娟. Email: 664382330@qq.com

R135.2； R329.24； R341.6； R341.7； R916.3

A

1672-4194(2017)02-0092-05