張 潔， 鄭碧云， 陳治新， 李 丹， 王小眾

IL-10對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx基因的HL-7702細胞增殖的影響

張 潔， 鄭碧云， 陳治新， 李 丹， 王小眾

目的 探討白細胞介素-10(IL-10)在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乙型肝炎病毒X(HBx)基因的HL-7702肝細胞增殖的作用及機制。 方法 CCK-8法測定HBx基因?qū)L-7702細胞增殖的作用及IL-10對HL-7702/HBx細胞增殖的作用；流式細胞術(shù)測定IL-10對HL-7702/HBx細胞凋亡的影響；RT-PCR法測定HBx基因?qū)L-7702細胞表達CDKN1B蛋白質(zhì)mRNA的作用及IL-10對HL-7702/HBx表達CDKN1B mRNA的作用。 結(jié)果 CCK-8法顯示，HL-7702/HBx細胞比HL-7702細胞和HL-7702/MOCK細胞增殖速度明顯加快(P<0.05)；80 ng/mL的IL-10作用24 h可抑制HL-7702/HBx細胞增殖(P<0.05)；流式細胞術(shù)顯示，80 ng/mL的IL-10作用24 h對HL-7702細胞、HL-7702/HBx細胞及HL7702/MOCK細胞凋亡均無影響；RT-PCR法顯示，HL-7702/HBx細胞CDKN1B mRNA表達量較HL-7702細胞和HL-7702/MOCK細胞降低(P<0.05)，80 ng/mL的IL-10作用24 h后，HL-7702/HBx細胞較HL-7702/HBx空白組CDKN1B mRNA表達量上調(diào)(P<0.05)。 結(jié)論 HBx基因可促進HL-7702細胞增殖，IL-10可抑制HL-7702/HBx細胞增殖而對其凋亡無影響。HBx基因可能通過下調(diào)HL-7702/HBx細胞CDKN1B mRNA的表達量而促進細胞增殖，IL-10可能通過上調(diào)HL-7702/HBx細胞CDKN1B mRNA的表達量而抑制細胞增殖。

病毒蛋白質(zhì)類； 肝細胞； 肝炎病毒，乙型； 白細胞介素10； *細胞轉(zhuǎn)化，腫瘤； 細胞增殖

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)基因X區(qū)負責(zé)編碼乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)。HBx發(fā)揮生物學(xué)功能并不通過與HBV DNA的直接作用，而是通過和肝細胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)相互作用而調(diào)節(jié)肝細胞的生物學(xué)性質(zhì)[1]。HBx在調(diào)節(jié)肝細胞增殖和凋亡、細胞周期、基因轉(zhuǎn)錄和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面均可發(fā)揮作用[2]，在肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的發(fā)生及發(fā)展中起重要作用。白細胞介素-10(interleukin-10, IL-10)在多種肝病的預(yù)防和治療中具有一定的應(yīng)用前景，如IL-10水平的改變與肝臟損傷相關(guān)，水平降低時肝臟受損加重[3]；動物模型實驗也已證實，IL-10具有抑制肝纖維化的作用[4-5]。因此，本研究擬探討HBx基因在肝細胞增殖、惡性轉(zhuǎn)變中的作用，以及IL-10對HL-7702/HBx細胞增殖的作用及其可能的分子機制，為臨床預(yù)防和治療HBV相關(guān)性HCC提供一定的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 HL-7702/HBx細胞(轉(zhuǎn)染重組HBx慢病毒載體的HL-7702肝細胞)、HL-7702/MOCK細胞(轉(zhuǎn)染慢病毒空載體的HL-7702肝細胞)、HL-7702細胞均為本實驗室凍存。人IL-10(美國PeproTech公司)；Cell Counting Kit-8(CCK-8, 日本Dojindo公司)；Taq DNA聚合酶和MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑(美國Thermo公司);100 bp DNA Ladder(加拿大Fermentas公司);Annexin V-PE凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HL-7702、HL-7702/MOCK、HL-7702/HBx細胞加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d換液1次，待細胞融合至70%左右開始傳代，經(jīng)0.25%的胰酶消化并傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx基因?qū)L-7702細胞增殖的影響 取對數(shù)期生長的3組細胞，常規(guī)消化配成單細胞懸液，以每孔5 000個細胞接種于96孔板，設(shè)6個復(fù)孔，接3塊板，分別培養(yǎng)24，48，72 h后取出，棄去原有培養(yǎng)液，用PBS洗滌后，加入混合液(CCK-8∶培養(yǎng)基=10 μL∶100 μL)，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，于450 nm下檢測每孔吸光度(OD450 nm)。

1.2.3 IL-10對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx基因的HL-7702細胞增殖的影響 將備用的HL-7702/HBx細胞分成5組：對照組(不加IL-10)及加入20，40，60，80 ng/mL的IL-10組。常規(guī)消化配成單細胞懸液，以每孔5 000個細胞接種于96孔板，設(shè)6個復(fù)孔，接3塊板，各相應(yīng)濃度的藥物作用各組細胞，3塊板分別作用24，48，72 h后采用CCK-8法檢測，選擇最佳抑制濃度和時間。另將細胞分為6組：HL-7702空白組及干預(yù)組、HL-7702/MOCK空白組及干預(yù)組、HL-7702/HBx空白組及干預(yù)組。各空白組不加IL-10試劑，各干預(yù)組加入最佳抑制濃度的IL-10。取對數(shù)期生長的細胞，常規(guī)消化，按每孔5 000個細胞接種于96孔板，同步化后各空白組更換培養(yǎng)基，各干預(yù)組更換IL-10，作用時間為上述實驗得到的IL-10最佳抑制時間，CCK-8法檢測。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 實驗分為6組，具體分組同1.2.3。各空白組不加IL-10試劑，各干預(yù)組加入最佳抑制濃度的IL-10。取對數(shù)期生長的細胞，常規(guī)消化，單細胞懸液接種于6孔板，細胞密度為5×105mL-1，每孔2 mL。培養(yǎng)貼壁后，空白組更換培養(yǎng)基，干預(yù)組加入IL-10，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細胞，離心棄去上清，PBS洗滌，用100 μL Buffer將細胞濃度調(diào)整為1×105，分別加入5 μL Annexin V-PE和5 μL 7-AAD染液，混勻后避光作用，加入Buffer，流式細胞儀檢測細胞凋亡率(早期凋亡細胞與晚期凋亡細胞的總凋亡率之和)。

1.2.5 RT-PCR檢測CDKN1B mRNA的表達 實驗分為4組：HL-7702細胞空白組、HL-7702/MOCK細胞空白組、HL-7702/HBx細胞空白組、HL-7702/HBx細胞干預(yù)組。各空白組不加IL-10試劑，干預(yù)組加入最佳抑制濃度的IL-10。Trizol法提取各組細胞總RNA，用酶標(biāo)儀測RNA濃度，總RNA紫外分光光度計測OD260 nm及OD280 nm，標(biāo)本總RNA的OD260 nm/OD280 nm均在1.6～1.8。

CDKN1B基因(擴增產(chǎn)物為317 bp)：

上游：5’-GGTGCTTGGGAGTTTTGAATG-3’

下游：5’-TCCATACACAGGCAATGAAATAC-3’

人β-actin基因(擴增產(chǎn)物為600 bp)：

上游：5’-GCATCGTGATGGACTCCG-3’

下游：5’-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3’

逆轉(zhuǎn)錄體系反應(yīng)條件為42 ℃ 60 min→99 ℃5 min，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20 ℃保存。PCR反應(yīng)體系反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min→95 ℃變性45 s→55 ℃退火30 s→72 ℃延伸1 min，共進行30個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。取PCR擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并拍照記錄。用Image J軟件分析各條帶的灰度值，以CDKN1B與β-actin灰度值比值作為CDKN1B mRNA的相對表達水平，并比較分析各組間的表達量差異。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx基因?qū)L-7702細胞增殖的作用 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，各時間段(24，48，72 h)HL-7702/HBx細胞組的OD值均高于HL-7702及HL-7702/MOCK細胞組(P<0.05，圖1)，而HL-7702和HL-7702/MOCK細胞組間差別無統(tǒng)計學(xué)意義。HL-7702/HBx細胞組的生長曲線較另外2組細胞明顯向左偏移，細胞生長速度明顯加快(圖2)。

與HL-7702/HBx比較，☆：P<0.05.圖1 CCK-8法檢測3組細胞增殖Fig 1 Proliferation of three groups of cells detected by CCK-8 assay

圖2 細胞生長曲線Fig 2 Cell growth curve

2.2 IL-10對HL-7702/HBx細胞增殖抑制最佳濃度和時間 作用24 h后，隨著藥物濃度的增加，細胞增殖抑制傾向逐漸加大，在80 ng/mL時有顯著差異(P<0.05，表1)。在作用48和72 h后，各濃度均無明顯變化(P>0.05)。故以80 ng/mL、作用24 h作為本實驗IL-10對HL-7702/HBx細胞增殖抑制的最佳濃度和時間。

表1 不同濃度的IL-10在不同作用時間下對HL-7702/HBx細胞增殖的影響

Tab 1 Effects of IL-10 on the proliferation of HL-7702/HBx cells

ρIL?10(ng·mL-1)t培養(yǎng)/h24487201．023±0．0452．429±0．0493．067±0．046201．02±0．0322．392±0．0812．98±0．102401．009±0．0252．372±0．0392．995±0．08600．98±0．0382．419±0．0513．105±0．053800．892±0．047☆2．383±0．0673．029±0．125

n=6. 表中數(shù)據(jù)為OD值. IL-10：白細胞介素10. 與0 ng/mL比較，☆：P<0.05.

2.3 IL-10對HL-7702,HL-7702/MOCK,HL-7702/HBx細胞增殖的作用 用CCK-8法檢測80 ng/mL的IL-10作用24 h后6組細胞的活力，HL-7702及HL-7702/MOCK細胞的空白組與干預(yù)組的OD值差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖3)，而HL-7702/HBx細胞的干預(yù)組比空白組的OD值明顯減小(P<0.05，圖3)，說明IL-10對HL-7702/HBx細胞增殖具有抑制作用，而對HL-7702和HL-7702/MOCK細胞增殖無影響。

HL-7702/HBx空白組與干預(yù)組比較，☆：P<0.05.圖3 IL-10對HL-7702，HL-7702/Mock及HL-7702/HBx 3組細胞增殖的影響Fig 3 Effects of IL-10 on the proliferation of the 3 groups of cells

2.4 IL-10對HL-7702,HL-7702/MOCK,HL-7702/HBx細胞凋亡的影響 對于HL-7702,HL-7702/MOCK及HL-7702/HBx 3組細胞，各細胞空白組和干預(yù)組間的比較差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表2，圖4)，說明IL-10對HL-7702，HL-7702/MOCK及HL-7702/HBx細胞凋亡均無影響。

2.5 IL-10對CDKN1B mRNA相對表達水平的影響 4組細胞均在317 bp處出現(xiàn)CDKN1B的陽性條帶(圖5)。與HL-7702空白組比較，HL-7702/MOCK空白組的CDKN1B mRNA相對表達量并無明顯變化(P>0.05)；與HL-7702空白組及HL-7702/MOCK空白組比較，HL-7702/HBx空白組的CDKN1B mRNA相對表達量明顯下降(P<0.05)，且HL-7702/HBx干預(yù)組較HL-7702/HBx空白組明顯升高(P<0.05，圖6)。

表2 6組細胞凋亡率比較

Tab 2 Compared the apoptosis rates of the six groups of cells

分 組凋亡率/%空白組干預(yù)組HL?77027．02±4．814．13±1．25HL?7702/MOCK2．43±1．711．16±0．33HL?7702/HBx4．34±0．255．91±2．11

n=3.

圖4 各組細胞即刻凋亡流式細胞圖Fig 4 Flow cytometry about apoptosis rates of cells in each group

3 討 論

HBx可顯著加快正常肝細胞的增殖速度，促進肝細胞向惡性增殖細胞發(fā)展[6-7]，還可通過抑制細胞凋亡途徑導(dǎo)致肝細胞凋亡受阻而誘發(fā)其惡性轉(zhuǎn)化[8]。表明HBx可能通過介導(dǎo)肝細胞的增殖和凋亡，調(diào)節(jié)失衡，誘導(dǎo)肝細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，在HCC的起病和形成中扮演重要角色。本研究發(fā)現(xiàn)，HL-7702/HBx細胞增殖速度明顯快于HL-7702細胞和HL-7702/MOCK細胞，進一步支持上述觀點。

M：marker； 1，5：HL-7702空白組； 2，6：HL-7702/MOCK空白組； 3，7：HL-7702/HBx空白組； 4，8：HL-7702/HBx干預(yù)組.圖5 RT-PCR法檢測4組細胞CDKN1B mRNA的表達Fig 5 Expression of CDKN1B mRNA in 4 groups of cells as analyzed by RT-PCR

1：HL-7702空白組；2：HL-7702/MOCK空白組；3：HL-7702/HBx空白組；4：HL-7702/HBx干預(yù)組. 與HL-7702/HBx空白組比較，☆：P<0.05.圖6 RT-PCR檢測CDKN1B mRNA相對表達量Fig 6 Relative expression of CDKN1B mRNA analyzed by RT-PCR

IL-10作為一種已知的抑制性細胞因子，廣泛參與炎癥過程與免疫病理過程的負性調(diào)節(jié)。近年發(fā)現(xiàn)，IL-10的免疫活化功能亦可對腫瘤起到抑制作用[9-10]，如在卵巢癌、乳腺癌等腫瘤中表達的IL-10，有利于抗腫瘤效應(yīng)，表現(xiàn)為抑制腫瘤的生長及侵犯。研究表明，IL-10在肝病的治療方面有一定的應(yīng)用前景，如機體可通過刺激枯否氏細胞和肝星狀細胞分泌IL-10減輕酒精性肝損害[11]；IL-10可通過抑制肝星狀細胞活化從而減輕肝纖維化[12]。值得注意的是，在抗HBx抗體陽性的慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化及HCC患者體內(nèi)，IL-10水平均明顯升高，提示二者間存在關(guān)聯(lián)，但具體關(guān)系尚不明確[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在使用20～80 ng/mL的IL-10干預(yù)的24 h內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，IL-10對HL-7702/HBx細胞增殖的抑制作用有加大的傾向，當(dāng)濃度為80 ng/mL時，與空白組比較差別具有統(tǒng)計學(xué)意義，故選擇80 ng/mL作用24 h為最佳實驗條件。繼續(xù)測定IL-10對HL-7702細胞和HL-7702/MOCK細胞增殖的影響，結(jié)果顯示，2種細胞的干預(yù)組和空白組的細胞增殖速度并無差別，推測IL-10對HL-7702細胞和HL-7702/MOCK細胞的增殖并無影響。流式細胞術(shù)檢測則發(fā)現(xiàn)，IL-10對HL-7702，HL-7702/HBx及HL-7702/MOCK細胞的凋亡均無明顯影響。推測IL-10能抑制穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx基因的HL-7702細胞的增殖而無促其凋亡的作用，說明IL-10對阻止HBx基因所致肝細胞增殖失控和惡性轉(zhuǎn)化可能具有一定作用，預(yù)示IL-10在防治HBV相關(guān)性HCC可能具有潛在臨床應(yīng)用價值。

細胞周期調(diào)節(jié)失控是導(dǎo)致細胞惡性轉(zhuǎn)變致腫瘤發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。CDKN1B是細胞周期中一個重要的負性調(diào)控因子，許多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與其表達下調(diào)相關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，HL-7702/HBx細胞的CDNK1B mRNA的表達量較HL-7702細胞和HL-7702/MOCK細胞均下調(diào)，說明CDKN1B表達量的減少可能是HBx基因致HL-7702細胞惡性轉(zhuǎn)化的機制之一。有報道指出，IL-10可通過上調(diào)細胞周期負調(diào)控蛋白P27的水平從而抑制心肌成纖維細胞增殖[15]。本研究結(jié)果與之相似，在使用80 ng/mL的IL-10作用24 h后，HL-7702/HBx干預(yù)組的CDKN1B mRNA表達量較空白組明顯增高，提示IL-10抑制HL-7702/HBx細胞增殖的機制可能與其上調(diào)CDKN1B mRNA的表達有關(guān)，而具體機制還需運用更為精確的實驗方法進一步驗證與探討。

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(編輯：何佳鳳)

The Effect of IL-10 on the Proliferation of HL-7702 Cells Stably Expressing HBx Gene

ZHANG Jie, ZHENG Biyun, CHEN Zhixin, LI Dan, WANG Xiaozhong

Department of Gastroenterology, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China

Objective To investigate the effect of interleukin-10(IL-10) on the proliferation of HL-7702 cells stably expressing hepatitis B virus X protein(HBx) gene. Methods Cell-counting Kit-8(CCK-8) assay were explored to detect the effect of HBx gene on the proliferation of HL-7702 cells and the effect of IL-10 on the proliferation of HL-7702 cells stably expressing HBx gene. Flow cytometry was used to analyze the effect of IL-10 on the apoptosis of HL-7702/HBx cells. RT-PCR was used to detect the effect of HBx gene on the expression of CDKN1B mRNA in HL-7702 cells and the effect of IL-10 on the expression of CDKN1B mRNA in HL-7702/HBx cells. Result The data of CCK-8 assay showed that the proliferation rate of HL-7702/HBx cells was significantly faster than HL-7702 and HL-7702/MOCK cells(P<0.05). The proliferation of the HL-7702/HBx cells was significantly inhibited after being treated with 80 ng/mL IL-10 for 24 hours(P<0.05). In addition, treatment of IL-10 of 80 ng/mL for 24 hours had no effects on the apoptosis of HL-7702, HL-7702/MOCK and HL-7702/HBx cells. Compared with HL-7702 and HL-7702/MOCK cells, the expression of CDKN1B mRNA level in HL-7702/HBx cells was decreased(P<0.05). After the treatment of 80 ng/mL IL-10 for 24 hours, the expression of CDKN1B mRNA level in HL-7702/HBx cells had increased(P<0.05). Conclusions HBx gene can promote the proliferation of HL-7702 cells. IL-10 can inhibit the proliferation of HL-7702/HBx cells but has no effect on the apoptosis. HBx gene probably enhances the proliferation of HL-7702/HBx cells by down-regulating the expression of CDKN1B mRNA. IL-10 can inhibit the proliferation of HL-7702/HBx cells which was probably related to the up-regulation of the expression of CDKN1B mRNA.

viral proteins; hepatocytes; hepatitis B virus; interleukin-10; cell transformation, neoplastic; cell proliferation

2016-08-01

福建省臨床醫(yī)學(xué)重點?？瀑Y助項目(閩衛(wèi)科教[2012]149號)；福建省自然科學(xué)基金青年項目(2016J05189)；福建省衛(wèi)生和計劃生育委員會中青年骨干重點項目(2014-ZQN-ZD-9)

福建醫(yī)科大學(xué) 附屬協(xié)和醫(yī)院消化科，福州 350001

張 潔，女，住院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士

王小眾. Email: drwangxz@163.com

R341；R394；R73-37；R735.7；R977.6

A

1672-4194(2017)02-0077-05