唐穎楠，彭穎，唐林，周莉莉，夏新華

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

清解顆粒揮發(fā)油提取及 Box-Behnken 優(yōu)化包合工藝研究

唐穎楠1，彭穎1，唐林2，周莉莉1，夏新華1

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

目的 優(yōu)選清解顆粒揮發(fā)油的提取和 β-環(huán)糊精包合工藝。方法 采用水蒸餾法進行提取，以提取時間、粉碎度、加水倍數(shù)為考察因素，揮發(fā)油體積為評價指標，考察清解顆粒揮發(fā)油的提取工藝；以包合率為評價指標，采用單因素試驗和 Box-Behnken 響應(yīng)面法結(jié)合，優(yōu)選最佳包合工藝。結(jié)果 優(yōu)選的提取工藝為荊芥、防風(fēng)、連翹藥材粗粉加 10 倍量水，提取 3 h。包合方法為飽和水溶液法，包合工藝為揮發(fā)油與 β-環(huán)糊精的投料比為 1∶12、包合溫度 40 ℃、包合時間 3.5 h。通過薄層色譜法、紫外光譜法和紅外光譜法初步證明了清解顆粒揮發(fā)油包合物的生成。結(jié)論 優(yōu)化的清解顆粒揮發(fā)油提取和包合工藝穩(wěn)定可行，可用于工業(yè)化大生產(chǎn)。

揮發(fā)油；Box-Behnken 設(shè)計；β-環(huán)糊精包合物；提取工藝；包合工藝

清解顆粒為湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院治療急、慢性支氣管炎的臨床經(jīng)驗方，由荊芥、防風(fēng)、連翹、苦杏仁、桔梗等 12味藥組成，其中荊芥、防風(fēng)、連翹（青翹）含有較多的揮發(fā)油，與其解熱抗炎、祛痰平喘的藥理作用關(guān)系密切[1]。為減少揮發(fā)油成分對胃腸道黏膜的刺激性，提高藥物的穩(wěn)定性，保證藥物質(zhì)量，我們選用 β-環(huán)糊精對清解顆粒中荊芥、防風(fēng)、連翹混合揮發(fā)油進行包合，以便開發(fā)為現(xiàn)代中成藥制劑。本試驗采用水蒸餾法考察清解顆粒揮發(fā)油提取工藝，并采用飽和水溶液法，單因素試驗結(jié)合Box-Behnken 響應(yīng)面法，考察影響包合工藝的主要因素，優(yōu)化清解顆粒揮發(fā)油包合工藝。

1 儀器與試藥

JY5002 型電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司），SXKW 數(shù)顯控溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器廠），JM-LB50C 型膠體磨（溫州市七星乳品場），C-MAG HS4 型磁力攪拌器（德國艾卡儀器設(shè)備有限公司），YZF-6030 型真空干燥箱（上海姚氏儀器設(shè)備廠），TW-2A 單級旋片式真空泵（溫嶺市挺威真空設(shè)備有限公司），101-3A 電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），Nicolet iS5紅外分光光度計（美國 Thermo 公司）。

荊芥（批號 160110311，產(chǎn)地河北）、連翹（批號160104791，產(chǎn)地山西）、防風(fēng)（批號 151209851，產(chǎn)地內(nèi)蒙古）飲片均購自康美藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉塔斯教授鑒定，符合2015 年版《中華人民共和國藥典》標準。β-環(huán)糊精，天津市光復(fù)精細化工研究所。其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提取工藝研究

2.1.1 單因素試驗優(yōu)選提取工藝 選取提取時間、粉碎度、加水倍數(shù)為考察因素，以揮發(fā)油體積為評價指標，優(yōu)選清解顆粒揮發(fā)油提取工藝。①稱取荊芥、防風(fēng)、連翹飲片各 80 g，3 份，加 10 倍水，提取 7 h；②稱取荊芥、防風(fēng)、連翹飲片及粗粉各 80 g，3 份，分別加入 10 倍水，提取 7 h；③稱取荊芥、防風(fēng)、連翹粗粉各 80 g，3 份，加 6、8、10、12 倍水，提取 3 h。按 2015 年版《中華人民共和國藥典》（四部）揮發(fā)油測定法甲法操作，收集揮發(fā)油，加入無水硫酸鈉脫水，讀取揮發(fā)油量。結(jié)果 7 h 的揮發(fā)油提取量為 1.20 m L，全飲片直接提取揮發(fā)油耗時長、提取量少。粗粉的揮發(fā)油提取量為 1.60 m L，明顯高于飲片；當粗粉提取3 h 后，揮發(fā)油基本提取完全；10 倍量水提取揮發(fā)油時，揮發(fā)油提取量達到最大，為 1.61 m L。最佳提取工藝為：荊芥、防風(fēng)、連翹粗粉加 10倍量水，加熱蒸餾提取 3 h，收集揮發(fā)油。

2.1.2 提取工藝驗證試驗 稱取荊芥、防風(fēng)、連翹粗粉各 80 g，共 3 份，按上述優(yōu)選的工藝進行提取，并記錄揮發(fā)油提取量。結(jié)果顯示，3批飲片揮發(fā)油平均提取量為 1.62 m L，RSD＝1.79%，表明揮發(fā)油提取工藝穩(wěn)定可行。

2.2 揮發(fā)油包合方法選擇和包合工藝評價指標測定

2.2.1 包合方法比較

2.2.1.1 飽和水溶液法 精密稱定 β-環(huán)糊精 10 g，置于錐形瓶中，加水 150 m L，并于溫度設(shè)為 40 ℃的磁力攪拌器上攪拌均勻，緩緩加入 1 m L 揮發(fā)油（預(yù)先配成 50%無水乙醇溶液），恒溫攪拌 3 h，放冷至室溫，置冰箱冷藏 24 h，抽濾，包合物用少量水洗滌，45 ℃真空干燥 5 h，稱定質(zhì)量，計算包合物收率[包合物質(zhì)量÷（β-環(huán)糊精投入量＋揮發(fā)油投入量）× 100%]。

2.2.1.2 膠體磨法 精密稱定 β-環(huán)糊精 30 g，置于燒杯中，加8倍量水，使其混勻后倒入膠體磨中進行擠壓包合。5 min 后緩緩加入揮發(fā)油 3 m L（預(yù)先配成50%無水乙醇溶液），研磨 30 m in，置冰箱冷藏 24 h，抽濾，包合物用少量水洗滌，45 ℃真空干燥 5 h，稱定質(zhì)量，計算包合物收率。

2.2.2 包合工藝評價指標測定 取清解顆粒揮發(fā)油包合物置于圓底燒瓶中，加水適量，連接揮發(fā)油提取器，按 2015 年版《中華人民共和國藥典》（四部）附錄揮發(fā)油測定法項甲法讀取揮發(fā)油提取量。另精密量取清解顆粒揮發(fā)油 1 m L，同法操作，讀取清解顆粒揮發(fā)油回收量。計算空白回收率（揮發(fā)油回收量÷?lián)]發(fā)油加入量×100%）和揮發(fā)油包合率（包合物實際收油量÷?lián)]發(fā)油加入量÷空白回收率×100%），平行3 份。結(jié)果顯示，揮發(fā)油空白回收率為 90%，采用飽和水溶液法和膠體磨法所得的揮發(fā)油平均包合率分別為 88.89%和 54.94%?？梢?，飽和水溶液法的揮發(fā)油包合率高于膠體磨法，故選擇飽和水溶液法用于包合揮發(fā)油。

2.3 揮發(fā)油包合工藝單因素試驗考察

2.3.1 揮發(fā)油與 β-環(huán)糊精投料比 按“2.2.1.1”項下方法制備包合物，固定包合溫度為 40 ℃、包合時間為 3 h、乙醇用量為 1 m L、冷藏時間為 24 h，考察清解顆粒揮發(fā)油與 β-環(huán)糊精的投料比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12，m L∶g），重復(fù) 3 次，取平均值。結(jié)果顯示，β-環(huán)糊精用量對包合物收率影響不明顯，但對揮發(fā)油包合率影響顯著。清解顆粒揮發(fā)油與 β-環(huán)糊精投料比在 1∶6～1∶12 時，隨著 β-環(huán)糊精投料量增加，揮發(fā)油包合率也逐漸增加（見圖 1）。因此，選擇清解顆粒揮發(fā)油與 β-環(huán)糊精投料比為 1∶10～1∶14進行 Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化，以確定最優(yōu)的清解顆粒揮發(fā)油與 β-環(huán)糊精比例。

圖 1 β-環(huán)糊精用量對包合工藝的影響

2.3.2 包合溫度 按“2.2.1.1”項下方法制備包合物，固定荊清解顆粒揮發(fā)油與 β-環(huán)糊精投料比為 1∶10、包合時間為 3 h、乙醇用量為 1 m L、冷藏時間為 24 h，考察包合溫度（30、40、50、60 ℃），重復(fù) 3 次，取平均值。結(jié)果顯示，包合溫度對包合物收率影響不大，但對揮發(fā)油包合率影響顯著。隨著包合時間增加，揮發(fā)油包合率先逐漸增大后減小，包合溫度為 40 ℃時揮發(fā)油包合率較大（見圖 2），可能由于隨著包合溫度的升高，部分揮發(fā)油揮發(fā)，導(dǎo)致包合率下降。因此，選擇包合溫度為 30～50 ℃進行 Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化，以確定最優(yōu)的清解顆粒揮發(fā)油包合溫度。

圖 2 包合溫度對包合工藝的影響

2.3.3 包合時間 按“2.2.1.1”項下方法制備包合物，固定清解顆粒揮發(fā)油與 β-環(huán)糊精投料比為 1∶10、包合溫度為 40 ℃、乙醇用量為 1 m L、冷藏時間為 24 h，考察包合時間（1、2、3、4 h），重復(fù) 3 次，取平均值。結(jié)果顯示，包合時間對包合物收率影響不大，但對揮發(fā)油包合率影響顯著。隨著包合時間的增加，揮發(fā)油包合率均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢；包合時間為 3 h時，揮發(fā)油包合率高于其他 3 個試驗水平（見圖 3）。因此，選擇包合時間為 2～4 h 進行 Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化，以確定最優(yōu)的包合時間。

圖 3 包合時間對包合工藝的影響

2.3.4 乙醇用量 按“2.2.1.1”項下方法制備包合物，固定清解顆粒揮發(fā)油與 β-環(huán)糊精投料比為 1∶10、包合溫度為 40 ℃、包合時間 3 h、冷藏時間為 24 h，考察乙醇用量（1、2、3、4 m L），重復(fù) 3 次，取平均值。結(jié)果顯示，隨著乙醇用量的增加，包合物收率和揮發(fā)油包合率均無明顯變化的趨勢（見圖 4）?；诠?jié)約溶劑的考慮，選擇乙醇用量為 1 m L。

圖 4 乙醇用量對包合工藝的影響

2.3.5 冷藏時間 按“2.2.1.1”項下方法制備包合物，固定清解顆粒揮發(fā)油與 β-環(huán)糊精投料比為 1∶10、包合溫度為 40 ℃、包合時間 3 h、乙醇用量為 1 m L，考察冷藏時間（3、6、12、24 h），重復(fù) 3 次，取平均值。結(jié)果顯示，隨著包合時間的增加，包合物收率緩慢增加，揮發(fā)油包合率先增加，6 h 后趨于穩(wěn)定（見圖 5）?；诠?jié)約時間考慮，選擇冷藏時間為 6 h。

圖 5 冷藏時間對包合工藝的影響

2.4 Box-Behnken 設(shè)計-效應(yīng)面分析法優(yōu)選包合物制備工藝

根據(jù) Box-Behnken 設(shè)計原理，在單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計 15個試驗點（3個零點）的響應(yīng)面分析試驗。以清解顆粒揮發(fā)油與 β-環(huán)糊精投料比（A）、包合溫度（B）、包合時間（C）為考察因素，揮發(fā)油包合率為響應(yīng)值，優(yōu)化清解顆粒揮發(fā)油的包合工藝。Box-Behnken 響應(yīng)面的因素水平設(shè)計和結(jié)果見表 1。2.4.1 包合物的制備及包合率測定 按 Box-Behnken設(shè)計安排進行試驗，取一定量 β-環(huán)糊精，置于錐形瓶中，加水 150 m L，并于相應(yīng)溫度的磁力攪拌器上攪拌均勻，緩緩加入 1 m L 揮發(fā)油（預(yù)先配成 50%無水乙醇溶液），恒溫攪拌至規(guī)定時間，放冷至室溫，置冰箱冷藏 6 h，抽濾，包合物用少量水洗滌，45 ℃真空干燥 5 h。取包合物置于圓底燒瓶中，加水適量，連接揮發(fā)油提取器，按 2015 年版《中華人民共和國藥典》（四部）附錄揮發(fā)油測定法甲法讀取揮發(fā)油提取量，并計算揮發(fā)油包合率。

表 1 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

2.4.2 模型擬合與方差分析 利用 Design-Expert10.0.3統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)分別進行多元線性回歸和二項式擬合，并獲得揮發(fā)油包合率對自變量 A、B、C 的多元線性回歸方程、二項式擬合方程。多元線性回歸方程：Y＝85.19＋2.92A＋1.11B＋4.30C，P＝0.122 5，r＝0.627 6。二項式擬合方程：Y＝93.70＋2.92A＋1.11B＋4.30C＋1.67AB－1.39AC＋0.55BC－6.15A2－5.88B2－3.93C2，P＝0.025 4，r＝0.960 6。

通過 P 值及相關(guān)系數(shù)（r）判定以上回歸方程的擬合情況。多元線性回歸方程 P＞0.05，表明建立的模型不具顯著性；r較低，可知自變量與因變量之間的線性相關(guān)性較差，多元線性回歸擬合度不佳、預(yù)測性較差，因此多元線性回歸擬合模型不適合。二項式擬合方程 P＜0.05，r＝0.960 6，表明該模型擬合度高、預(yù)測性較好，故選擇二項式擬合模型為最佳模型。由二項式擬合方程可知，影響揮發(fā)油包合率的因素順序為包合時間＞揮發(fā)油與 β-環(huán)糊精投料比＞包合溫度。采用ANOVA方差分析分析響應(yīng)面的回歸參數(shù)，結(jié)果見表2。

方差分析結(jié)果顯示，該二項式擬合模型 F＝6.64，P＜0.05，表明模型具有顯著性；決定系數(shù) R2＝0.922 7，表明方程的因變量與全體自變量之間的線性關(guān)系是顯著的。模型的變異系數(shù)為 3.50%，說明該模型的精密度良好。同時，方程的失擬項 F＝8.33，P＞0.05，表示失擬項不顯著，說明回歸方程在整個回歸區(qū)域內(nèi)的擬合情況良好，可用該回歸模型代替真實試驗點對結(jié)果進行分析。

表 2 方差分析結(jié)果

2.4.3 響應(yīng)面圖分析 各因素對揮發(fā)油包合率影響的三維響應(yīng)面圖見圖6。

圖 6 因素 A、B、C 對揮發(fā)油包合率影響的響應(yīng)面圖

根據(jù) Design-Expert10.0.3 軟件對試驗結(jié)果進行系統(tǒng)分析，得出清解顆粒揮發(fā)油-β-環(huán)糊精的最佳包合工藝參數(shù)：清解顆粒揮發(fā)油與 β-環(huán)糊精投料比為 1∶12.396、包合時間 3.522 h、包合溫度 41.467 ℃。對此工藝下清解顆粒揮發(fā)油-β-環(huán)糊精包合物的揮發(fā)油包合率進行預(yù)測，理論值為 95.195%。根據(jù)實際生產(chǎn)條件對工藝參數(shù)進行修正，最終得到清解顆粒揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合工藝條件為：清解顆粒揮發(fā)油與 β-環(huán)糊精投料比為 1∶12、包合時間 3.5 h、包合溫度 40 ℃。

2.4.4 包合工藝驗證試驗 按優(yōu)化后的最終包合工藝條件和“2.4.1”項下包合物的制備方法對清解顆粒揮發(fā)油進行包合，平行操作3次，結(jié)果揮發(fā)油包合率依次為 95.56%、92.22%、97.78%，均值為 95.19%，RSD＝2.94%。驗證試驗結(jié)果表明，揮發(fā)油包合率基本穩(wěn)定，其均值與理論預(yù)測值的相對誤差很小，證明了包合工藝的合理性和可行性。

2.5 揮發(fā)油包合物的鑒別

2.5.1 薄層色譜鑒別 取未包合的揮發(fā)油 5 滴，加入 1 m L 無水乙醇中，制成樣品 1；取 β-環(huán)糊精 0.1 g，加入 1 m L 無水乙醇中，振搖 5 min，過濾，制成樣品 2；取揮發(fā)油 β-環(huán)糊精包合物 0.1 g，加入 1 m L 無水乙醇，振搖 5 min，過濾，制成樣品 3；取從包合物中回收的揮發(fā)油 5 滴，加入 1 m L 無水乙醇中，制成樣品 4。吸取樣品 1～4，分別點樣于硅膠薄層板（105 ℃活化30 m in），以醋酸乙酯-正己烷-氯仿（1∶11∶3）為展開劑展開，待展開劑上行 12 cm 后，取出，晾干，噴5%香草醛-硫酸乙醇溶液，于 105 ℃加熱至斑點清晰可見。結(jié)果顯示，樣品 1、4的斑點完全一致，說明包合前后揮發(fā)油的主要成分無明顯差異；同時，在揮發(fā)油的斑點對應(yīng)處，樣品 2、3未見斑點，說明包合物已將揮發(fā)油包合。

2.5.2 紫外光譜鑒別 分別取少量未包合的揮發(fā)油、包合物回收揮發(fā)油、揮發(fā)油包合物和 β-環(huán)糊精，以無水乙醇溶解，置于紫外可見分光光度計上，于200～600 nm 波長范圍內(nèi)掃描，測定吸光度。結(jié)果揮發(fā)油和包合物回收揮發(fā)油的紫外可見吸收圖譜無明顯差異，而包合物與揮發(fā)油和 β-環(huán)糊精的紫外可見吸收圖譜有顯著差異，說明包合物已將揮發(fā)油包合，而且包合前后其理化性質(zhì)沒有發(fā)生變化，見圖7。

2.5.3 紅外光譜鑒別 將 β-環(huán)糊精、揮發(fā)油和揮發(fā)油包合物（經(jīng)石油醚洗滌）樣品分別采用 KBr壓片法制備供試品，對3個供試品分別進行紅外光譜掃描。測定條件：掃描范圍 4 000～570 cm-1，分辨率 4 cm-1，掃描次數(shù) 30 次。測定結(jié)果見圖 8?？梢?，在 1500～ 800 cm-1，β-環(huán)糊精和包合物均出現(xiàn) 1 個吸收峰，但包合物吸收程度弱于 β-環(huán)糊精；在 800～570 cm-1，揮發(fā)油有多個吸收峰，β-環(huán)糊精和包合物吸收峰均不明顯，說明包合物已將揮發(fā)油包合。

圖 7 清解顆粒揮發(fā)油紫外光譜掃描圖

圖 8 清解顆粒揮發(fā)油紅外光譜掃描圖

3 討論

在單因素試驗考察中，本研究不僅考察了常見影響揮發(fā)油包合的因素（揮發(fā)油與 β-環(huán)糊精投料比、包合溫度、包合時間），還考察了乙醇用量和冷藏時間，結(jié)果表明乙醇用量和冷藏時間對揮發(fā)油包合率影響不大。

在揮發(fā)油包合工藝中，揮發(fā)油包合率、包合物收率、含油率通常作為工藝的評價指標，其中揮發(fā)油包合率是其中最直接也是最準確的評價方法[2-5]。在單因素考察中可以明顯看出，包合物收率隨各因素水平變化較小，故包合物收率不列為評價指標。

Box-Behnken 中心組合設(shè)計是響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計法中的一種，適合于用非線性模型擬合[6-7]。與正交試驗設(shè)計相比，此方法增加了考察水平，使結(jié)果更加直觀，且具有精確分析出因素區(qū)域內(nèi)最佳點的優(yōu)勢。本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選用 Box-Behnken 響應(yīng)面法，考察清解顆粒揮發(fā)油與 β-環(huán)糊精投料比、包合溫度、包合時間對清解顆粒揮發(fā)油包合率的影響，最終得到揮發(fā)油最佳包合工藝條件為：荊芥、連翹、防風(fēng)混合揮發(fā)油與 β-環(huán)糊精投料比為 1∶12，包合溫度為 40 ℃，包合時間為 3 h。同時，本試驗選用薄層色譜法、紫外光譜法和紅外光譜法對清解顆粒揮發(fā)油包合物進行鑒別，初步驗證了清解顆粒揮發(fā)油包合物的形成。

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Extraction Technology of Volatile Oil from Qingjie Granules and Optim ization of Inclusion Technology by Box-Behnken

TANG Ying-nan1, PENG Ying1, TANG Lin2, ZHOU Li-li1, XIA Xin-hua1(1. School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China; 2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China)

Objective To optimize the extraction of volatile oil from Qingjie Granules and process of inclusion compound of beta-cyclodextrin. Methods Water Distillation was used for extraction. Extraction time, grinding degree, and the amount of water were set as inspection factors, and volatile oil volume was set as the evaluation index to inspect extraction process of volatile oil from Qingjie Granules. With inclusion rate as the evaluation index, the single factor test and the Box-Behnken combined With the response surface method were used to choose the optimum inclusion process. Results The optimum extraction process for Schizonepetae Herba, Saposhnikoviae Radix and Forsythiae Fructus coarse powder should be With 10 times amount of water, extracting 3 h. Inclusion method should be saturated water solution method, and the inclusion process of volatile oil as feed and beta-cyclodextrin inclusion ratio was 1∶12; the temperature was 40 ℃; inclusion time was 3.5 h. By means of TLC, UV and IR spectra, the formation of the inclusion compound of volatile oil in clear solution particles was prelim inarily proved. Conclusion The optimum extraction and inclusion process of volatile oil from Qingjie Granules are stable and feasible, which can be used in industrial production.

volatile oil; Box-Behnken design; beta-cyclodextrin inclusion compound; extraction process; inclusion process

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.016

R283.5

A

1005-5304(2017)08-0070-06

2016-11-21）

（

2016-12-06；編輯：陳靜）

夏新華，E-mai l：xiaxinhua001@163.com