李澎，王建農(nóng)，許勇剛，付建華，劉建勛

中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院，北京 100091

山楂葉原花青素對腫瘤壞死因子-α誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞細胞間黏附分子-1 和 E-選擇素過表達的影響

李澎，王建農(nóng)，許勇剛，付建華，劉建勛

中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院，北京 100091

目的 觀察山楂葉原花青素對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞細胞間黏附分子-1（ICAM-1）和 E-選擇素過表達的影響，探討其抗炎作用的機制。方法 體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞。MTT法檢測細胞活力，流式細胞術(shù)檢測 ICAM-1 和 E-選擇素的表達。結(jié)果 山楂葉原花青素濃度≤200 mg/L 時，對細胞活力無明顯影響；模型組人臍靜脈內(nèi)皮細胞 ICAM-1 和 E-選擇素表達較正常組顯著升高，10、20、30、40、50 mg/L 山楂葉原花青素濃度依賴地抑制 ICAM-1 和 E-選擇素的表達升高，其中 40、50 mg/L 組較模型組差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)論 山楂葉原花青素能夠抑制 TNF-α 誘導的血管內(nèi)皮細胞 ICAM-1 和 E-選擇素的過表達，這可能與其抗炎作用相關(guān)。

山楂葉；原花青素；血管內(nèi)皮細胞；腫瘤壞死因子-α；細胞間黏附分子-1；E-選擇素

過度的炎癥反應是動脈粥樣硬化、缺血性心臟病、中風、感染性休克等疾病發(fā)展、惡化乃至造成死亡的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)。因此，抑制炎癥發(fā)生、阻斷炎癥反應過程，對于這些重大難治疾病的治療具有重要意義。山楂葉具有活血化瘀、降脂消濁的功效。原花青素是山楂葉的重要活性成分，約占山楂葉黃酮類物質(zhì)總量的 20%。有研究顯示，原花青素可抑制炎癥細胞的激活、降低炎癥因子的釋放，還可以直接對抗氧自由基、氮過氧化物等炎癥毒素對細胞的殺傷[1-2]。我們前期研究顯示，富含原花青素的山楂葉提取物能抑制缺氧復氧誘導的白細胞與內(nèi)皮細胞的黏附，降低白細胞黏附分子的表達[3]。但是，山楂葉原花青素對炎性反應中血管內(nèi)皮細胞黏附分子表達的影響尚缺乏研究。本實驗以腫瘤壞死因子-α（TNF-α）刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞，觀察山楂葉原花青素對內(nèi)皮細胞2種經(jīng)典黏附分子，即細胞間黏附分子-1（ICAM-1）和E-選擇素過表達的影響，探討其抗炎作用的機制。

1 實驗材料

1.1 臍帶

剖腹產(chǎn)健康嬰兒無菌臍帶，購自北京市海淀區(qū)婦幼保健院。

1.2 藥物及制備

山楂葉原花青素，本院實驗中心參照文獻[4]方法制備。6 倍體積 60%乙醇加熱山楂葉 1 h，過濾，取濾液，回收至無醇味。經(jīng)AB8樹脂吸附，水洗至清。70%乙醇洗脫樹脂至無色，收集洗出液，回收至無醇味。加氯仿萃取 2次，去除葉綠素，聚酰胺吸附，烘干。

1.3 試劑

原花青素標準品（純度＞95%，沃瑪特公司，4852-22-6），Ⅰ型膠原酶（Gibco 公司，17100-017），胰酶（Amesco 公司，0458），內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基（M 200-500）及其添加物（S003-10），Cascade 公司。重組人 TNF-α（CytoLab 公司，300-01A），藻紅蛋白（PE）標記小鼠單克隆抗人 ICAM-1 熒光抗體（BD公司，347977），異硫氰酸熒光素（FITC）標記小鼠單克隆抗人 E-選擇素熒光抗體（R&D 公司，BBA21），PE 標記小鼠 IgG2a（BD 公司，349053），F(xiàn)ITC 標記小鼠 IgG1（R&D 公司，IC002F）。

1.4 儀器

Synergy 4 多功能酶標儀，Biotek 公司；Navios 流式細胞檢測儀，Beckman Coulter公司。

2 實驗方法

2.1 山楂葉原花青素純度測定

采用香草醛法，參照文獻[5]方法進行。

2.2 人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)與鑒定

將內(nèi)皮細胞培養(yǎng)添加物按1∶50的比例加入內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基，并加入青霉素和鏈霉素（終濃度分別為100 U/L 和 100 μg/L），配制成完全內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基。取嬰兒臍帶，長約 20 cm。PBS 洗凈血跡，從臍靜脈上端插入剪去針尖的 12號針頭，以止血鉗固定。通過針頭向臍靜脈內(nèi)注入 PBS，沖洗 3 遍，洗凈殘血。以另一止血鉗夾閉臍靜脈下端，向臍靜脈內(nèi)注入以DMEM 培養(yǎng)基配制的 0.1%Ⅰ型膠原酶，取出針頭，夾閉臍靜脈上端。37 ℃消化 15 m in。收集臍靜脈內(nèi)的消化液，PBS 沖洗 2～3 遍，將流出液體與消化液合并，1500 r/m in 離心 10 m in，取沉淀。加入完全內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基，每條臍帶所得細胞約加 5 m L。將細胞吹打均勻，加入培養(yǎng)瓶內(nèi)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。當細胞生長至 80%融合時，進行傳代。PBS 沖洗 3 遍，0.25%胰酶 37 ℃消化 5 m in，收集細胞，1∶3 傳代。實驗使用第 3代細胞。免疫熒光檢測血小板Ⅷ因子表達。

2.3 人臍靜脈內(nèi)皮細胞活力檢測

細胞完全融合生長后，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗 3遍。加入含有藥物的完全內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。藥物以 DMSO 溶解，按 1∶1000 比例加入培養(yǎng)基內(nèi)。正常組給予含 0.1 m L/L DMSO 的培養(yǎng)基。24 h 后棄去培養(yǎng)基，PBS 洗 3 遍，培養(yǎng)板內(nèi)加入 1 g/L PBS 配制的 MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h；棄去 MTT 液，培養(yǎng)板內(nèi)加入 DMSO，室溫放置 15 m in，于波長 490 nm處測定吸光度（OD）。

2.4 造模和給藥

待細胞長滿培養(yǎng)皿后，棄去培養(yǎng)基，PBS 沖洗 3遍。加入含有藥物的完全內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。藥物以 DMSO 溶解，按 1∶1000 比例加入培養(yǎng)基內(nèi)。正常組和模型組給予含 1 m L/L DMSO 的培養(yǎng)基。之后，模型組和給藥組按 1∶1000 比例向培養(yǎng)基內(nèi)加入 PBS 配制的重組人 TNF-α（終濃度 10 μg/L），正常組給予等量 PBS。繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。

2.5 細胞間黏附分子-1 和 E-選擇素檢測

棄去培養(yǎng)基，PBS 洗 3 遍，0.01%胰酶-0.02%EDTA消化 10 min。胎牛血清終止消化，收集細胞，PBS 洗3 次。4 ℃、1500 r/m in 離心 10 min，棄去上清液，加入 10 μL PBS，吹打均勻，平均分作 2 份。一份加入 5 μL 抗 ICAM-1 抗體和 5 μL 抗 E-選擇素抗體，另一份加入 5 μL PE 標記小鼠 IgG2a 和 10 μL FITC 標記小鼠 IgG1，作為同型對照。4 ℃、避光孵育 30 min。4 ℃、1500 r/min 離心 10 m in，棄去上清液，PBS 洗1 次。收集細胞，每份細胞加入 25 μL 多聚甲醛固定15 min，加入 250 μL PBS，4 ℃避光保存，24 h 內(nèi)測定。流式細胞術(shù)測定 PE 和 FITC 熒光強度，以同型對照調(diào)定檢測范圍。各樣本熒光強度＝測定管熒光強度－同型對照管熒光強度。每次實驗每組只作1個樣本，以對模型的表達抑制率（1－給藥組樣本熒光強度÷同次實驗模型樣本熒光強度）衡量藥效。

3 統(tǒng)計學方法

采用 SPSS16.0 統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較用方差分析或 Kolmogorov-Smirnov Test檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 山楂葉原花青素的純度測定

0.006 25～0.1 g/L 濃度范圍內(nèi)，標準品濃度與 OD 值呈良好的線性相關(guān)?；貧w方程為原花青素濃度（g/L）＝3.306 3×OD 值－0.140 6，r2＝0.998 3；山楂葉原花青素樣品的測定點分布在標準品曲線的附近，表明其純度與標準品相近或稍高。見圖1。

圖 1 山楂葉原花青素與原花青素標準品純度比較

4.2 人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)與鑒定結(jié)果

培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞成梭形、卵圓形或多角形，融合生長時呈青石子鋪路狀，見圖 2?？寡“澧蜃用庖邿晒馊旧鶠殛栃裕栃员磉_部位在胞漿，呈綠色；細胞核以 DAPI染色呈藍色，見圖 3。

4.3 山楂葉原花青素對人臍靜脈內(nèi)皮細胞活力的影響

與正常組比較，山楂葉原花青素 25、50、100、200 mg/L 組人臍靜脈內(nèi)皮細胞活力無明顯差異，見表 1。

表 1 各組人臍靜脈內(nèi)皮細胞活力比較（±s）

表 1 各組人臍靜脈內(nèi)皮細胞活力比較（±s）

組別 濃度/（mg/L） n OD 值正常組 5 0.101±0.004山楂葉原花青素組 200 5 0.102±0.003 100 5 0.102±0.005 50 5 0.106±0.003 25 5 0.100±0.004

4.4 山楂葉原花青素對腫瘤壞死因子-α誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞細胞間黏附分子-1 和 E-選擇素過表達的影響

與正常組比較，模型組 ICAM-1、E-選擇素熒光強度明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，山楂葉原花青素各濃度均可抑制 ICAM-1、E-選擇素的表達升高，其中 40、50 mg/L 原花青素差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01），見圖 4、表 2。

圖 4 ICAM-1 和 E-選擇素流式細胞檢測直方圖

圖 2 培養(yǎng) 3 代的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（×100）

圖 3 培養(yǎng) 3 代的人臍靜脈內(nèi)皮細胞鑒定（免疫熒光染色，×200）

表 2 各組人臍靜脈內(nèi)皮細胞 ICAM-1 和 E-選擇素過表達比較（±s）

表 2 各組人臍靜脈內(nèi)皮細胞 ICAM-1 和 E-選擇素過表達比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 濃度/（mg/L） n ICAM-1 E-選擇素熒光強度 抑制率 熒光強度 抑制率組 4 0.33±0.17 0.68±0.32組 4 11.25±1.05** 5.03±2.00**葉原花青素組 10 4 0.18±0.10 -0.01±0.18 20 4 0.18±0.25 0.02±0.15 30 4 0.20±0.17 0.08±0.16 40 4 0.38±0.09## 0.25±0.10#50 4 0.35±0.14## 0.32±0.14##

5 討論

炎癥是一種極其重要的病理過程。它是有血管生物體對損傷因素做出的一種非特異性的反應，其主要表現(xiàn)為實質(zhì)器官細胞的變性和死亡、血液成分和血細胞的滲出及炎性、組織間質(zhì)細胞的增生。一方面，炎癥反應有助于清除感染病原體以及損傷、死亡的細胞，對機體具有有利的影響；但是，過于強烈的炎癥反應會波及那些原本正常的組織，使其出現(xiàn)嚴重的水腫、缺血缺氧和代謝障礙，并大量殺傷那些原本未出現(xiàn)損傷的細胞，從而導致嚴重的附加傷害[6]。

白細胞等炎癥細胞黏附于血管內(nèi)皮是炎癥反應中最為關(guān)鍵的一環(huán)，它是炎癥誘發(fā)一系列嚴重損傷的必要前提。白細胞黏附會阻塞微血管，阻礙乃至終斷血流供應，還會影響血液回流，造成組織水腫；黏附的白細胞滲入組織深處，釋放氧自由基、毒性細胞因子、水解酶等，直接導致細胞的變性與死亡及組織基質(zhì)的崩解。白細胞黏附于血管內(nèi)皮細胞依賴于它們各自表面的黏附分子，這些黏附分子通過受體配基樣作用相互結(jié)合，介導白細胞的黏附。

ICAM-1 和 E-選擇素是血管內(nèi)皮細胞表達 2 個最重要的黏附分子。前者屬于免疫球蛋白超家族，通過與白細胞上整合素分子（包括 CD11、CD18 等）相作用，使白細胞與血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生牢固的結(jié)合。而后者屬于選擇素家族，與白細胞的 E-選擇素配基相作用，介導黏附的早期過程，如白細胞與內(nèi)皮細胞的接觸及白細胞在內(nèi)皮細胞上的滾動等。它們的表達主要受到炎性細胞因子的調(diào)控，TNF-α、白細胞介素-1 等均具有很強的誘生作用。

山楂葉的主要活性成分是黃酮和原花青素。黃酮含量較高，約占提取物總量的 80%，余下部分為原花青素。WS?1442 為德國開發(fā)的一種山楂葉制劑，在當今臨床上得到廣泛的應用。對其抗心肌缺血作用的研究表明，山楂葉提取物的藥理作用主要依賴于原花青素而非含量更高的黃酮，增加提取物中原花青素的含量可以顯著改進療效[7]。

本研究結(jié)果顯示，在 10～50 mg/L 濃度范圍內(nèi)，山楂葉原花青素能劑量依賴地抑制 TNF-α 誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞 ICAM-1 和 E-選擇素的過表達，且抑制作用對藥物濃度有一定的依賴性，并在 40、50 mg/L達到高峰。這一藥物有效濃度范圍與量效關(guān)系，與我們對山楂葉原花青素抗心肌細胞缺氧損傷的研究結(jié)果是一致的，這也提示 40～50 mg/L 可能就是山楂葉原花青素干預不同疾病的共同最佳范圍[8]。結(jié)合山楂葉原花青素對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的毒性實驗結(jié)果，濃度高至 200 mg/L 的山楂葉原花青素也未顯示出明顯的細胞毒性，其有效作用的濃度范圍是安全的。

至于山楂葉原花青素是如何抑制炎癥介質(zhì)誘導的血管內(nèi)皮細胞 ICAM-1 過表達的，我們推測可能與其抗氧化的性質(zhì)有關(guān)。有研究表明，包括上調(diào) ICAM-1在內(nèi)的絕大多數(shù) TNF-α 的生物學效應，均是氧自由基依賴的[9]。其具體機制還需進一步實驗驗證。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，山楂葉原花青素能抑制炎癥反應中血管內(nèi)皮細胞 ICAM-1 的表達上調(diào)，這可能是其抗炎機制之一。

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Effects of Haw thorn Leaf Procyanidins on Over Exp ressions of ICAM-1 and E-selectin in Hum an Umbilical Vein Endothelial Cells Induced by TNF-α

LI Peng, WANG Jian-nong,XU Yong-gang, FU Jian-hua, LIU Jian-xun (Xiyuan Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100091, China)

Objective To observe the effects of haw thorn leaf procyanidins (HLP) on over expressions of ICAM-1 and E-selectin in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) induced by TNF-α，and clarify the mechanism of HLP’s anti-inflammation effect. Methods HUVEC were cultured in vitro. MTT assay was used to detect cell viabilities. The expressions of ICAM-1 and E-selectin in HUVEC were detected by flow cytometry. Results Up to 200 mg/L, HLP showed no significant decrease in cell viabilities; the expression levels of ICAM-1 and E-selectin in the model group significantly increased, compared With that in the normal group; 10, 20, 30, 40, 50 mg/L HLP inhibited the expression elevations of ICAM-1 and E-selectin in concentration-dependent manner; and there were statistical significances in 40, 50 mg/L HLP groups, compared With the model group. Conclusion HLP can inhibit the over expressions of ICAM-1 and E-selectin of vascular endothelial cells induced by TNF-α, which possibly underlies HLP’s anti-inflammation effect.

haw thorn leaf; procyanidins; vascular endothelial cell; TNF-α; ICAM-1; E-selectin

R285.5

A

1005-5304(2017)08-0050-04

2016-11-29）

（

2016-12-13；編輯：華強）

國家自然科學基金（81274196）；北京市自然科學基金（7092089）

付建華，E-mai l：j ianhuaf fcn@263.net

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.012