樸金蘭 張幼怡 李子健 耿 力

(北京大學(xué)第三醫(yī)院婦產(chǎn)科,北京 100083)

·基礎(chǔ)研究·

細(xì)胞外基底剛度調(diào)控宮頸癌細(xì)胞遷移的microRNA 的篩選

樸金蘭 張幼怡①李子健**②耿 力**

(北京大學(xué)第三醫(yī)院婦產(chǎn)科,北京 100083)

目的 通過(guò)microRNA 芯片篩選不同基底剛度影響宮頸癌細(xì)胞遷移過(guò)程中的關(guān)鍵microRNA 的候選者。 方法用丙烯酰胺及雙丙烯酰胺的不同比例配置基底剛度為1、20 kPa 的人工基底膜，在其上種植宮頸癌細(xì)胞系Siha，36 h后收取細(xì)胞提取總RNA，用microRNA芯片及qRT-PCR方法篩選2種基底剛度條件下的差異表達(dá)microRNA。 結(jié)果 在2種不同剛度條件下生長(zhǎng)的宮頸癌細(xì)胞系Siha 共有173 個(gè)表達(dá)差異的microRNA，其中包括70 個(gè)表達(dá)上調(diào)的microRNA和103 個(gè)表達(dá)下調(diào)的microRNA。在宮頸癌細(xì)胞系Siha、Hela、Caski 中，檢測(cè)與宮頸癌細(xì)胞遷移相關(guān)的miR-21、miR-125a、miR-75b、miR-150、miR-595、miR-218、miR-200b、miR-107、miR-183 等表達(dá)與microRNA芯片結(jié)果一致。 結(jié)論 不同基底剛度可引起宮頸癌細(xì)胞系Siha 的microRNA 表達(dá)譜不同，microRNA 在基底剛度調(diào)控宮頸癌細(xì)胞遷移的過(guò)程中可能具有重要作用。

宮頸癌； microRNA 芯片； 遷移

宮頸癌是世界范圍內(nèi)女性常見的惡性腫瘤，每年全球約有528 000個(gè)新發(fā)病例和266 000個(gè)死亡病例[1，2]。宮頸癌的發(fā)病特點(diǎn)要經(jīng)歷從正常宮頸上皮細(xì)胞、癌前病變和浸潤(rùn)癌階段，臨床數(shù)據(jù)表明宮頸癌前病變CIN(包括原位癌)的5年生存率可高達(dá)100%，Ⅰ期宮頸癌(浸潤(rùn)癌)患者則為70%～90%，而發(fā)展到Ⅳ期僅為20%左右，可見宮頸癌的間質(zhì)浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的關(guān)鍵因素。細(xì)胞的遷移貫穿于腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的全過(guò)程，該過(guò)程中發(fā)生癌基因的激活和抑癌基因的失活等一系列的改變[1～5]。microRNA是一種具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用的小分子RNA，可調(diào)控一些重要的癌基因及抑癌基因的表達(dá)。越來(lái)越多的研究顯示，惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、預(yù)后都與腫瘤細(xì)胞的周圍環(huán)境因素有密切關(guān)系。細(xì)胞外基質(zhì)剛度的變化可以影響細(xì)胞的重要功能，如遷移、生長(zhǎng)、分化、增殖等[6～11]。2014 年Mouw 等[12]研究顯示細(xì)胞外基質(zhì)剛度的變化可通過(guò)microRNA 調(diào)節(jié)PTEN 的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生，提示在細(xì)胞外基質(zhì)剛度影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中microRNA 具有重要的作用。利用microRNA 芯片技術(shù)可以高通量地對(duì)腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵microRNA進(jìn)行篩選，本研究通過(guò)microRNA 芯片研究不同基底剛度作用下的宮頸癌鱗癌細(xì)胞系Siha的差異microRNA 表達(dá)譜，尋找不同基底剛度的力學(xué)信號(hào)影響宮頸癌細(xì)胞遷移過(guò)程中關(guān)鍵microRNA 的候選者。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的不同比例配置基底剛度為1、20 kPa的人工基底膜，紫外燈照射2 h后，用于種植宮頸癌細(xì)胞系Siha，并以玻璃板作為對(duì)照。人工基底膜配方見表1。

表1 人工基底膜1、20 kPa的配方

1.2 microRNA 芯片

選擇1、20 kPa 2種基底剛度，將Siha 種植在人工基底膜上，未設(shè)平行孔，待生長(zhǎng)36 h后，利用Trizol法提取Siha細(xì)胞的總RNA，并用Qiagen’s RNeasy Mini Kits 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。送北京博奧有限公司進(jìn)行昂飛microRNA 芯片分析。

1.3 qRT-PCR 方法

應(yīng)用Qiagen 試劑盒將5 μL RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，選取β-actin 作為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)，以驗(yàn)證基因芯片準(zhǔn)確性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增步驟參照SYBRGreen 實(shí)時(shí)定量PCR 試劑盒說(shuō)明書(日本TaKaRa 公司)。采用2-ΔΔCt計(jì)算正常宮頸細(xì)胞及宮頸癌細(xì)胞之間目的mRNA 表達(dá)水平的差異倍數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件, 2種剛度條件下microRNA表達(dá)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同基底剛度作用下宮頸癌細(xì)胞Siha 差異表達(dá)的microRNA

在基底剛度為1、20 kPa 上生長(zhǎng)的宮頸癌細(xì)胞系Siha 檢測(cè)差異表達(dá)的microRNA結(jié)果顯示，在2個(gè)不同剛度條件下生長(zhǎng)的宮頸癌細(xì)胞系Siha 共有173 個(gè)表達(dá)差異的microRNA，其中包括70 個(gè)表達(dá)上調(diào)的microRNA 和103 個(gè)表達(dá)下調(diào)的microRNA (P<0.05, FRD<0.05)，并對(duì)差異篩選結(jié)果做了聚類圖(圖1)。聚類圖中顏色的深淺代表microRNA 在不同剛度宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)水平的高低，從圖1 可以看出1、20 kPa 的宮頸癌細(xì)胞系Siha的microRNA 表達(dá)譜有明顯不同。

圖1 1、20 kPa 2種基底剛度條件下宮頸癌細(xì)胞系Siha的差異表達(dá)的microRNA 聚類圖

表2、3顯示在基底剛度為1、20 kPa 2種條件下上調(diào)、下調(diào)倍數(shù)較高的差異表達(dá)的microRNA。上調(diào)倍數(shù)較高的microRNA 包括miR-21、miR-125a、miR-75b、miR-150、miR-595等，表達(dá)下調(diào)倍數(shù)較高的包括miR-218、miR-200b、miR-506b、miR-107、miR-183等。

表2 在基底剛度為1、20 kPa剛度條件下宮頸癌細(xì)胞系Siha上調(diào)倍數(shù)較高的差異表達(dá)的microRNA

表3 在基底剛度為1、20kPa基金剛度條件下宮頸癌細(xì)胞系Siha下調(diào)倍數(shù)較高的差異表達(dá)的microRNA

2.2 實(shí)時(shí)定量RT-PCR

從microRNA芯片檢測(cè)結(jié)果，再根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道篩選與宮頸癌細(xì)胞遷移密切相關(guān)且差異倍數(shù)較大的microRNA，miR-106b、miR-211、miR-218、miR-200b等，并利用熒光定量RT-PCR在宮頸癌細(xì)胞系Caski、Siha、Hela中進(jìn)行驗(yàn)證，并以U6作為內(nèi)參照并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。miR-218(P=0.000)、miR-200b(P=0.008)、miR-107(P=0.000)、miR-183(P=0.000)在20 kPa時(shí)明顯比1 kPa低，miR-21(P=0.000)、miR-125a(P=0.000)、miR-75b(P=0.000)、miR-150(P=0.000)、miR-595(P=0.000)在20 kPa比1 kPa表達(dá)高(圖2)，除miR-506b在Siha細(xì)胞系不一致，其他與芯片結(jié)果一致，即不同剛度條件可引起宮頸癌細(xì)胞系microRNA表達(dá)不同。

3 討論

我們的研究結(jié)果顯示，通過(guò)microRNA 芯片分析發(fā)現(xiàn)基底剛度為1、20 kPa Siha 細(xì)胞共有173 個(gè)表達(dá)差異的microRNA，其中包括70 個(gè)表達(dá)上調(diào)的microRNA和103 個(gè)表達(dá)下調(diào)的microRNA (P<0.05, FRD<0.05)，其中表達(dá)上調(diào)最明顯的包括miR-21、miR-125a、miR-75b 等，表達(dá)下調(diào)最明顯的包括miR-218、miR-200b等。人體結(jié)締組織剛度平均值大致是1～10 kPa，人體實(shí)體瘤組織剛度平均值大致是20 kPa ，已有研究顯示宮頸癌隨著病變進(jìn)展其組織剛度逐漸增加[13]。上述結(jié)果提示細(xì)胞外基質(zhì)剛度的變化可引起宮頸癌細(xì)胞microRNA 表達(dá)譜的不同，在基底剛度影響宮頸癌的發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中有眾多的microRNA 參與其中。RT-PCR結(jié)果顯示1、20 kPa 2種基底剛度條件下與宮頸癌細(xì)胞遷移關(guān)系密切，miR-21、miR-125a、miR-75b、miR-150、miR-595、miR-218、miR-200b、miR-107、miR-183 的表達(dá)有明顯差異，miR-506b在20 kPa下比1 kPa高，與microRNA芯片結(jié)果不一致，需要進(jìn)一步研究。miR-21 可通過(guò)靶向降解抑癌基因PTEN 促進(jìn)宮頸癌進(jìn)一步進(jìn)展[14]；miR-125a通過(guò)靶向降解ABL2 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移及增殖功能[15]；miR-27b 在宮頸癌細(xì)胞系中表達(dá)明顯比正常宮頸細(xì)胞系高，并可通過(guò)靶向降解CDH11 促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換及遷移[16]；miR-150 可靶向降解FOXO4 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移及侵襲[17]；miR-519 也可通過(guò)靶向降解Smad7 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移[18]；同樣miR-595 也通過(guò)靶向降解Wnt 信號(hào)通路抑制因子SOX 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移[19]。而miR-218 表達(dá)降低與宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲密切相關(guān)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌組織中的表達(dá)明顯比無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中低[20]；miR-200b 的高表達(dá)可靶向降解RhoE 抑制宮頸癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換及遷移[21]；同樣miR-506b 通過(guò)靶向降解box Q1 蛋白抑制宮頸癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換及遷移[22]；而且miR-107 通過(guò)靶向降解CCR5 抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖及遷移[23]；同時(shí)，miR-183 作為抑癌基因靶向降解MMP-9 抑制宮頸癌細(xì)胞的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移[24]；miR-195 也被發(fā)現(xiàn)可通過(guò)靶向降解CCND2 及MYB 抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。上述結(jié)果提示microRNA在基底剛度調(diào)控宮頸癌細(xì)胞遷移的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[7～13]。繼續(xù)探討microRNA 在基底剛度影響宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中的作用將有助于宮頸癌的早期診斷及判斷預(yù)后，也將為尋找基底剛度的力學(xué)信號(hào)影響宮頸癌細(xì)胞遷移過(guò)程中的關(guān)鍵microRNA 提供新線索。

圖2 A. 1、20 kPa 2種基底剛度的Caski、Siha、Hela 的miR-21 表達(dá)情況；B. 1、20 kPa 2種基底剛度的Caski、Siha、Hela 的miR-125a 表達(dá)情況；C. 1、20 kPa 2種基底剛度的Caski、Siha、Hela 的miR-75b 表達(dá)情況；D. 1、20 kPa 2種基底剛度的Caski、Siha、Hela 的miR-150 表達(dá)情況；E. 1、20 kPa 2種基底剛度的Caski、Siha、Hela 的miR-595 表達(dá)情況；F. 1、20 kPa 2種基底剛度的Caski、Siha、Hela 的miR-218 表達(dá)情況；G. 1、20 kPa 2種基底剛度的Caski、Siha、Hela 的miR-200b 表達(dá)情況；H. 1、20 kPa 2種基底剛度的Caski、Siha、Hela 的miR-506b 表達(dá)情況；I. 1、20 kPa 2種基底剛度的Caski、Siha、Hela 的miR-107 表達(dá)情況；J. 1、20 kPa 2種基底剛度的Caski、Siha、Hela 的miR-183 表達(dá)情況 *P<0.05, **P<0.01

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(修回日期：2016-09-01)

(責(zé)任編輯：李賀瓊)

Screening of MicroRNAs Related with Cervical Cancer Cell Migration Regulated by Basement Membrane Stiffness

Piao Jinlan*, Zhang Youyi, Li Zijian, et al.*

Department of Obstetrics and Gynecology,Peking University Third Hospital, Beijing 100083, China

Li Zijian, E-mail:lzjgy1995@163.com; Geng Li, E-mail:gengli57@163.com

Objective To screen differently expressed microRNAs of cervical cancer cell line Siha in different basement membrane stiffness conditions. Methods The Siha cells were stimulated with different stiffness of basement membrane (1 kPa and 20 kPa). The total RNA was isolated after 36 h, and the microRNA chip analysis was proceeded to screen differently expressed microRNAs. Results We found 173 differently expressed microRNAs, including 70 microRNAs expressed higher and 103 microRNAs expressed lower in 20 and 1kPa. We also tested some microRNAs (miR-21, miR-125a, miR-75b, miR-150, miR-595, miR-218, miR-200b, miR-107, and miR-183) closely related with migration of cervical cancer cells using real-time PCR, and the results were also in accordance with the results of microRNA chip analysis. Conclusions Cervical cancer cells have differently expressed microRNA profiles in different stiffness of basement membranes. The microRNAs may play important roles in the regulation of cervical cancer cell migration by different basement membranes.

Cervical cancer; MicroRNA chip; Migration

國(guó)家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào)：81472429，81471893，81270157)；973 課題計(jì)劃(項(xiàng)目編號(hào)：2013CB933702,2014CBA02003)

A

1009-6604(2017)07-0653-05

10.3969/j.issn.1009-6604.2017.07.021

2016-04-05)

**通訊作者，E-mail：lzjgy1995@163.com(李子健)，gengli57@163.com(耿力)

①心內(nèi)科

②血管醫(yī)學(xué)研究所