林海鳴 黃云梅 吳銀生 黃美雅 陳翔 劉振濤 林燕萍

福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMOP)發(fā)病的主要原因是由于絕經(jīng)后婦女卵巢功能下降，特別是雌激素的缺乏，導(dǎo)致骨吸收作用增強(qiáng)，造成快速骨丟失所引起。PMOP的發(fā)生與骨代謝失衡密切相關(guān)，目前研究表明OPG/RANKL/RANK軸是影響骨代謝的重要途徑，許多研究工作基于該軸從骨代謝入手對(duì)PMOP的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行探討，但目前對(duì)OPG/RANKL/RANK軸與骨代謝關(guān)系的研究尚未完全闡明[1]，有待更深入的研究。課題組在既往工作中已對(duì)去卵巢大鼠骨代謝標(biāo)志物的變化進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究[2]，并基于OPG/RANK/RANKL軸做了對(duì)成骨細(xì)胞OPG、RANKLmRNA表達(dá)的探討[3]。由于PMOP是一進(jìn)展性疾病，有必要在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀測(cè)，目前基于該軸動(dòng)態(tài)檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)與骨代謝指標(biāo)關(guān)系的研究較少見(jiàn)報(bào)道，因此本研究擬對(duì)不同時(shí)期RANKL、OPG蛋白表達(dá)的變化及與BTMs(骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物)的相關(guān)性做一初步的探討。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：3月齡雌性SD大鼠48只，SPF級(jí)，體重(267±21)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002，合格證編號(hào)：2015000517533。在福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心鼠類實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施為SPF級(jí)(合格證號(hào)：SYXK (閩)2014-0005)。

1.1.2主要試劑：兔抗大鼠RANKL一抗(武漢博士德公司)，兔抗大鼠OPG一抗(SAB公司)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠、兔IgG(Earthox LLC公司)，一、二抗稀釋液(碧云天生物技術(shù)研究所)，ECL發(fā)光試劑(Thermo Scientific公司)，SDS-PAGE凝膠配置試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，RIPA裂解液(南京諾唯贊公司)，BGP、CTX-I、BALP和TRAP-5b Elisa試劑盒(上海西唐公司)，PVDF膜(Invitrogen公司)。

1.1.3主要儀器設(shè)備：AIR TECH無(wú)菌操作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)，64R低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)，MILLI-Q超純水裝置(美國(guó)Milipore公司)，Du650紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Beckman公司)，Trans-Blot Turbo蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)，ChemiDocXRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組及處理：48只3月齡SD雌性大鼠隨機(jī)分成Sham組和OVX組，每組各24只。OVX組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)：用2%戊巴比妥鈉按40 mg/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉，行腹部正中切口，沿子宮雙側(cè)探及左、右卵巢，卵巢結(jié)扎切除術(shù)后腹壁逐層縫合。術(shù)后3 d連續(xù)肌注青霉素預(yù)防感染(8萬(wàn)單位/只)；Sham組未切除卵巢，其余步驟與OVX組同。

1.2.2取材：于術(shù)后第2、6、10、14周分批進(jìn)行取材，每批次每組各取6只。大鼠以10%水合氯醛麻醉后，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，全血室溫靜置2 h后，經(jīng)3 000 r/min離心20 min，取血清，1.5mLEP管分裝，-80 ℃凍存，用于血清相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。取大鼠腰椎，其中L5、L6置于1.5mLEP管，-80 ℃凍存，用于骨組織OPG、RANKL蛋白檢測(cè)。骨組織取材時(shí)，均在取材中及時(shí)放入液氮中暫存。

1.2.3指標(biāo)檢測(cè)：Western blot檢測(cè)各時(shí)期大鼠骨組織的OPG、RANKL蛋白表達(dá)：取大鼠L5、L6提取骨組織蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后切膠，然后將膠上蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，經(jīng)封閉后一抗孵育過(guò)夜。次日孵二抗后，加ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上顯影。Image Lab圖象分析軟件分析目的條帶，讀取并記錄每條帶的光密度值。Elisa檢測(cè)各時(shí)期大鼠血清骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物BGP、BALP、CTX-I、TRAP-5b的變化。分別按相應(yīng)Elisa試劑盒說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)，最后酶標(biāo)儀讀取OD值，并計(jì)算各標(biāo)志物水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 OPG、RNAKL蛋白表達(dá)

Western blot檢測(cè)不同時(shí)期大鼠L5、L6骨組織的OPG、RNAKL蛋白表達(dá)，與Sham組比較，OVX組在術(shù)后各時(shí)期骨組織RANKL蛋白表達(dá)均升高，第2周(P<0.01)和第10、14周(P<0.05)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OPG蛋白表達(dá)在第2周(P<0.01)和第6周(P<0.05)顯著降低。見(jiàn)圖1、2。

圖1 大鼠骨組織RANKL、OPG的Western Blot結(jié)果Fig.1 Western Blot results of RANKL and OPG in rat bone tissue

圖2 大鼠骨組織RANKL、OPG蛋白表達(dá)相對(duì)量結(jié)果比較注：與Sham組比較，* P<0.05，** P<0.01Fig.2 Comparison of the relative expression of RANKL and OPG in rat bone tissueNote:Compared with Sham group,*P<0.05,**P<0.01

2.2 血清骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物BGP、BALP、CTX-I、TRAP-5b水平

Elisa檢測(cè)不同時(shí)期大鼠血清骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物BGP、BALP、CTX-I、TRAP-5b水平，與Sham組比較，術(shù)后第2周OVX組TRAP-5b水平顯著升高(P<0.01)，BGP、BALP、CTX-I水平顯著升高(P<0.05)；術(shù)后第6周OVX組BGP、BALP水平顯著升高(P<0.01)，CTX-I水平顯著下降(P<0.05)、TRAP-5b水平顯著下降(P<0.01)；術(shù)后第10周及第14周OVX組CTX-I水平顯著升高(P<0.05)，BALP水平顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

2.3 骨組織OPG、RANKL蛋白表達(dá)與骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物的相關(guān)性

BTMs數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，采用Spearman檢驗(yàn)，相關(guān)性分析顯示骨組織RANKL與血清CTX-I、TRAP-5b水平成正相關(guān)(P<0.05)，骨組織OPG與血清CTX-I、TRAP-5b水平成負(fù)相關(guān)(P<0.01)。見(jiàn)表1。

3 討論

骨代謝標(biāo)志物可分為一般生化標(biāo)志物、骨代謝調(diào)控激素和骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物3類，PMOP是高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥，本實(shí)驗(yàn)選擇骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物(BTMs)為檢測(cè)指標(biāo)，包括骨形成標(biāo)志物BGP、BALP，骨吸收標(biāo)志物CTX-I、TRAP-5b。

表1 骨組織RANKL、OPG與血清骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between serum BTMs and RANKL and OPG of bone tissue

注：*在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)，**在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。
Note:*Significant correlation at 0.05 level(bilateral),**Significant correlation at 0.01 level(bilateral).

圖3 不同時(shí)期大鼠血清骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物(BGP、BALP、CTX-I、TRAP-5b)變化的比較注：與Sham組比較，* P<0.05，** P<0.01Fig.3 Comparison of BTMs (BGP, BALP, CTX-I and TRAP-5b) in serum of rats at different periodsNote:Compared with Sham group,*P<0.05,**P<0.01

TRAP-5b是由破骨細(xì)胞產(chǎn)生的非膠原蛋白，是早期反映破骨細(xì)胞活性的標(biāo)志物[4]，血清TRAP-5b與骨吸收水平呈正相關(guān)；CTX-I是I型膠原的降解產(chǎn)物，是反映骨吸收的特異性指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)顯示OVX組術(shù)后2周TRAP-5b顯著升高，提示卵巢切除后骨吸收增強(qiáng)，但該指標(biāo)在后期(10、14周)無(wú)顯著性差異，而CTX-I在第2、10、14周OVX組均較Sham組顯著升高，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，可能與骨組織的構(gòu)成有關(guān)，骨有機(jī)成分主要是由I型膠原組成，當(dāng)骨吸收增強(qiáng)時(shí)I型膠原降解較正常增多，降解產(chǎn)物增加，CTX-I升高，且CTX-I有骨I型膠原分子間交聯(lián)物的重要區(qū)段和近似交聯(lián)物的殘基，其緊密結(jié)構(gòu)可以保護(hù)不受肝、腎的進(jìn)一步降解，具有較好的穩(wěn)定性[5]，因此在術(shù)后第10、14周組間仍有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)中TRAP-5b的早期升高及CTX-I術(shù)后第2、10、14周的升高均提示，卵巢切除后由于雌激素水平下降，導(dǎo)致骨吸收增加，但在第6周TRAP-5b、CTX-I有階段性的下降，結(jié)合骨形成標(biāo)志物BALP及BGP的結(jié)果(第6周BALP、BGP水平OVX組較Sham組高)，提示可能是快速骨丟失后的暫時(shí)的某種機(jī)制的骨吸收抑制。

BALP由成骨細(xì)胞分泌，在骨礦化過(guò)程中，將單磷酸酯水解成無(wú)機(jī)磷，增加局部無(wú)機(jī)磷的濃度，水解焦磷酸鹽，解除其對(duì)骨鹽形成的抑制作用，是成骨細(xì)胞成熟和具有活性的標(biāo)志，是骨形成的特異及敏感標(biāo)志物[5]；BGP是成骨細(xì)胞功能和骨質(zhì)礦化的特殊標(biāo)志物，由成骨細(xì)胞合成類骨質(zhì)時(shí)釋放到細(xì)胞外基質(zhì)，其中一小部分進(jìn)入血液循環(huán)，因此血清中BGP水平變化，是直接反映骨形成的一種特異性指標(biāo)，當(dāng)骨基質(zhì)降解時(shí)其中的BGP也進(jìn)入血液循環(huán)中，因此BGP除了能反映成骨細(xì)胞的活性，在更大程度上反映的是骨轉(zhuǎn)換[6]。本實(shí)驗(yàn)BALP檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，各時(shí)期水平總體呈升高趨勢(shì)，各時(shí)期OVX組均較Sham組顯著升高，提示卵巢切除大鼠繼發(fā)的骨形成增強(qiáng)。BGP水平在各時(shí)期OVX組均較Sham組升高，在第2、6周有顯著性差異，同樣提示卵巢切除大鼠的骨代謝活躍，骨轉(zhuǎn)換性提高。

以上顯示，卵巢切除大鼠骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物隨時(shí)間推移呈動(dòng)態(tài)變化，骨吸收標(biāo)志物TRAP-5b在卵巢切除早期即有顯著的升高，而CTX-I總體升高、有階段性下降，升高持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，總體表現(xiàn)為以骨吸收增強(qiáng)為主的高轉(zhuǎn)換性骨代謝的特點(diǎn)。變化有顯著性差異的骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物隨術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，在第2、6周各標(biāo)志物均有顯著性差異，到第14周僅BALP、CTX-I差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是機(jī)體對(duì)早期快速骨吸收的一定程度的代償機(jī)制的作用。

OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)是雌激素調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成和抗骨吸收作用的重要途徑之一[7]，雌激素可抑制破骨細(xì)胞的分化、成熟及活性，從而抑制骨吸收，雌激素缺乏可促進(jìn)OC形成、分化及增強(qiáng)其活性，這一過(guò)程與OPG、RANKL關(guān)系密切，實(shí)驗(yàn)中OVX組骨組織RANKL表達(dá)較Sham組在第2、6周均升高，第2周有顯著性差異，而OPG表達(dá)顯著下降，導(dǎo)致同時(shí)期OVX組的RANKL/OPG比值顯著升高，顯示由于雌激素水平下降導(dǎo)致成骨細(xì)胞過(guò)度表達(dá)RANKL而降低OPG的表達(dá)，使RANKL與RANK結(jié)合，啟動(dòng)OC的分化和功能活性，骨吸收過(guò)度活躍，切除卵巢早期過(guò)度表達(dá)RANKL而降低OPG表達(dá)的結(jié)果與之前一些學(xué)者的研究結(jié)果一致[8]。相應(yīng)的骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物TRAP-5b、CTX-I在第2周升高，進(jìn)入骨量快速丟失階段，文獻(xiàn)資料也顯示大鼠在去卵巢后3周和6周，骨量下降較顯著，12周之后骨量持續(xù)平穩(wěn)下降[9]。但在第6周OVX組TRAP-5b、CTX-I出現(xiàn)階段性下降，可能是機(jī)體的某種負(fù)反饋機(jī)制抑制骨吸收。有研究發(fā)現(xiàn)RANKL誘導(dǎo)表達(dá)的LGR4可做為負(fù)反饋信號(hào)抑制破骨細(xì)胞的分化與功能[10]，實(shí)驗(yàn)中OVX組RANKL早期的顯著高表達(dá)可能通過(guò)類似的機(jī)制暫時(shí)抑制OC活性，以應(yīng)對(duì)機(jī)體由于雌激素缺乏引起的快速骨量丟失。在第10、14周OVX組RANKL仍高表達(dá)，同期CTX-I均顯著升高，提示骨吸收持續(xù)增強(qiáng)，而BALP水平的顯著上調(diào)，提示伴隨成骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，骨形成增加，但由于骨吸收強(qiáng)于骨形成，而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。相關(guān)性分析顯示骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物CTX-I、TRAP-5b與骨OPG成負(fù)相關(guān)，與骨RANKL成正相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)取材受到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的限制，無(wú)法連續(xù)多次大量采血和提取骨組織標(biāo)本，使動(dòng)態(tài)觀察的連續(xù)性受到限制，有待加大樣本、改進(jìn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。