馬忠平 黃健 張志峰 楊云 葉楠

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030

骨質(zhì)疏松癥作為臨床上最為常見的骨代謝異常狀態(tài)，以骨密度下降為主要特點，常常增加患者的骨折風(fēng)險[1]。國外研究提示，高血壓病和骨質(zhì)疏松癥存在著密切的聯(lián)系，絕經(jīng)期后婦女骨量丟失明顯加速，骨形成明顯不足，而老年高血壓病患者體內(nèi)持續(xù)的高血壓狀態(tài)引起血管硬化損傷，加速骨量流失[2]。貝尼地平是臨床上常用的L型鈣離子通道阻滯劑，在降低血壓的同時對成骨細胞有明顯的促進成骨作用[3]，但該藥物對骨代謝作用至今仍未見報道。

1 材料和方法

1.1 材料

雌性10周大C57/BL6小鼠，體重20～23 g，購至內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心；主要實驗儀器與試劑：(1)主要儀器：倒置光學(xué)顯微鏡(Nikon，TE2000-U)，熒光顯微鏡(Olympus，F(xiàn)V-1000)，顯微CT(SCANCO Medical，μCT80)，石蠟切片機(Leica公司)。(2)主要試劑：一抗Runx2(CST公司)，一抗OCN(CST公司)，偶聯(lián)異硫氰酸熒光素山羊抗兔二抗(Abcam公司)，伊紅(Sigma公司)，蘇木素(Sigma公司)，乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA，Sigma公司)，甘油(Sigma公司)。

1.2 動物飼養(yǎng)與造模

隨機將30只10周大C57/BL6小鼠平分為3組，分別為：假手術(shù)組(Sham)10只，去卵巢組(OVX)10只，去卵巢加藥組(OVX+BD)10只；假手術(shù)組切除卵巢周圍少量脂肪墊后縫合，去卵巢組完整切除雙側(cè)卵巢，去卵巢加藥組在完整切除雙側(cè)卵巢后灌胃貝尼地平20 mg/(kg·d)。所有小鼠正常飲食，常規(guī)飼養(yǎng)3個月后，斷頸處死，取股骨4 ℃下4%多聚甲醛固定24小時，EFTA-甘油溶液4 ℃脫鈣1個月。

1.3 組織學(xué)檢測

股骨石蠟包埋，切片(厚度5 μm)，行伊紅蘇木素染色，倒置光學(xué)顯微鏡觀察股骨下段骨小梁數(shù)量，拍照，Image-Pro Plus(version 6.0，IPP，美國)軟件測量骨小梁作色區(qū)域面積定量。

1.4 顯微CT掃描

標本固定后行顯微CT掃描股骨下段，掃描厚度20 μm，骨小梁三維重建后定量骨密度(bone mineral density，BMD)，骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)，骨小梁數(shù)量 (trabecular number,Tb.N).

1.5 免疫組織化學(xué)

股骨切片脫蠟至水，微波抗原修復(fù)10 min，0.25%Triton X-100 室溫破膜30 min，1×TBST清洗3遍，每遍5 min，5%BSA常溫封閉20 min，RUNX2一抗(1∶50)4 ℃孵育過夜，1×TBST清洗3遍，每遍5 min，二抗(1∶50)室溫孵育1小時，1×TBST清洗3遍，每遍5 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，倒置顯微鏡觀察，拍照, Image-Pro Plus(version 6.0，IPP，美國)軟件計數(shù)染色陽性細胞數(shù)。

1.6 免疫熒光檢測

股骨切片脫蠟至水，微波抗原修復(fù)10 min，0.25%Triton X-100 室溫破膜30 min，1×TBST清洗3遍，每遍5 min，5%BSA常溫封閉20 min，OCN一抗(1∶50)4 ℃孵育過夜，1×TBST清洗3遍，每遍5 min，偶聯(lián)異硫氰酸熒光素山羊抗兔二抗二抗(1∶50)室溫孵育1小時，1×TBST清洗3遍，每遍5 min，帶DAPI封片劑封片，熒光共聚焦顯微鏡觀察股骨下段熒光強弱拍照，Image-Pro Plus(version 6.0，IPP，美國)軟件計數(shù)染色陽性細胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 貝尼地平對股骨下段骨小梁的組織學(xué)影響

股骨下段行HE染色(圖1)發(fā)現(xiàn)去卵巢加藥組小鼠的骨小梁數(shù)量明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但仍然低于假手術(shù)組小鼠(圖1，表1)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各組小鼠股骨下段HE染色Fig.1 HE staining of distal femur in different groups of mice

2.2 BD對股骨下段骨代謝參數(shù)的影響

股骨下段顯微CT掃描(圖2)發(fā)現(xiàn)，和去卵巢加藥組小鼠(圖2，表1)相比，去卵巢組小鼠的BMD、Tb.Th、Tb.N均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而各組中假手術(shù)組(圖2，表1)的BMD、Tb.Th和Tb.N最高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 各組小鼠股骨下段RUNX2免疫組織化學(xué)染色(放大倍數(shù)100×)Fig.3 RUNX2 IHC staining of distal femur in different groups of mice (magnification 100×)

圖4 各組小鼠股骨下段OCN免疫熒光染色(放大倍數(shù)100×)Fig.4 OCN IF staining of distant femur in different groups of mice (magnification 100×)

2.3 BD對股骨下段RUNX2表達的影響

對各組股骨下段行RUNX2免疫組織化學(xué)染色(圖3)發(fā)現(xiàn)，去卵巢加藥組(圖3，表1)股骨下段RUNX2陽性細胞數(shù)量明顯多于單純?nèi)ヂ殉步M(圖3，表1)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而假手術(shù)組(圖3，表1)RUNX2表達量在各組中表達最強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 BD對股骨下段OCN表達的影響

各組小鼠股骨下段OCN免疫熒光染色(圖4)發(fā)現(xiàn)，去卵巢加藥組(圖4，表1)股骨下段OCN表達明顯高于單純?nèi)ヂ殉步M(圖4，表1)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但仍低于假手術(shù)組(圖4，表1)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 各組小鼠股骨下段顯微CT掃描重建Fig.2 μCT scan of distal femur in different groups of mice

組別HE染色(ccm)BMD(mgHA/ccm)Tb.Th(mm)Tb.N(l/mm)RUNX2陽性細胞數(shù)(/ccm)OCN陽性細胞數(shù)(/ccm)Sham組81.6667±12.0610754.6873±66.60870.0825±0.01295.1247±0.8950141.4255±10.094539.0452±9.0679OVX組23.5000±9.4604330.6000±53.52790.0385±0.00991.8320±0.682589.3607±24.318419.5373±3.0733OVX+BD組44.6667±11.3959515.9692±52.13380.0655±0.00664.0995±1.1469118.0877±10.989231.3866±8.1857

3 討論

貝尼地平作為臨床上用的降壓藥，具有L型、N型和T型三亞型通道阻滯作用，可舒張血管，能降低血壓和增加冠脈流量[4]。國外的一些體外實驗明確了貝尼地平促進成骨的作用[3,5]，但具體機制尚不清楚。另外，貝尼地平在體內(nèi)的作用是否和以往的體外實驗相吻合目前尚不得而知。本課題旨在探討貝尼地平對骨代謝的影響。

本實驗通過去卵巢模仿絕經(jīng)期后婦女骨質(zhì)疏松模型[6]，探討在雌激素水平缺乏情況下，貝尼地平對小鼠骨代謝的影響。本研究通過組織學(xué)檢測以及股骨下段顯微CT掃描，通過假手術(shù)組和去卵巢組小鼠股骨下段的骨小梁數(shù)量和骨密度對比，發(fā)現(xiàn)去卵巢組小鼠相關(guān)參數(shù)均明顯下降，可驗證骨質(zhì)疏松造模成功；另外，通過單純切卵巢組和切卵巢加藥組小鼠骨代謝相關(guān)指標對比，可發(fā)現(xiàn)模型組各項指標均優(yōu)于單純切卵巢組，明確了貝尼地平對股骨下段骨小梁數(shù)量的影響以及促進骨代謝參數(shù)的恢復(fù)，去卵巢加藥組的小鼠股骨下段骨小梁作色區(qū)域明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，骨密度、骨小梁厚度及骨小梁等定量指標和單純?nèi)ヂ殉残∈笙啾染黠@增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，可以明確在體內(nèi)環(huán)境下，貝尼地平具有對抗雌激素水平下降的骨質(zhì)疏松作用。

為進一步探討貝尼地平在體條件下促進骨形成的體內(nèi)分子生物學(xué)聯(lián)系，本課題對股骨下段石蠟切片進行了成骨關(guān)鍵蛋白OCN和重要轉(zhuǎn)錄因子RUNX2免疫熒光以及免疫組織化學(xué)檢測。OCN是成骨細胞特性的調(diào)控蛋白，在成骨細胞成熟和分化過程中起著至關(guān)重要的作用[7]，來自胞外促進成骨的信號分子通過膜受體的信號方法及細胞質(zhì)中的第二信使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，將明顯上調(diào)胞核內(nèi)OCN的表達，進而上調(diào)成骨相關(guān)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄與表達，促進成骨并調(diào)節(jié)骨的礦化及成熟[8]，通過OCN免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)貝尼地平加藥組小鼠股骨下段OCN表達明顯高于單純切卵巢組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但仍低于假手術(shù)組小鼠，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；此外，成骨細胞重要的轉(zhuǎn)錄因子RUNX2是胞質(zhì)中廣泛分布的促進成骨的轉(zhuǎn)錄因子[9]，RUNX2的表達受WNT/β-catenin信號通路直接調(diào)控，而WNT/β-catenin是成骨細胞行使生物學(xué)功能最為重要的信號通路[10]，因此，RUNX2表達的增加可間接反映WNT/β-catenin信號通路的活性[11]；本實驗中發(fā)現(xiàn)，在去卵巢組小鼠的股骨下段RUNX2表達量明顯低于假手術(shù)組和去卵巢加藥組。