李楊 張延輝 王云楓 魏鑫 關(guān)利新 關(guān)悅*

1.牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院骨科，黑龍江 牡丹江 157011 2.牡丹江醫(yī)學(xué)院內(nèi)分泌科，黑龍江 牡丹江 157011 3.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011

骨質(zhì)疏松癥已成為一種在世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，越來(lái)越引起人們的重視。絕經(jīng)后婦女由于性激素水平嚴(yán)重降低，骨密度也隨之降低，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率隨著年齡的增加而升高，其主要的特點(diǎn)為骨量的減少以及骨組織微結(jié)構(gòu)的退行性病變，從而導(dǎo)致骨脆性增加進(jìn)而易骨折[1]。成骨細(xì)胞的骨形成與破骨細(xì)胞的骨吸收失調(diào)是發(fā)生骨代謝疾病的主要原因。骨形成需要一定數(shù)量的骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞可以通過(guò)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)分化而來(lái)[2]。因此，尋找一種能夠定向誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的藥物成為治療骨質(zhì)疏松的新思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

MEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Hyclone公司)，F(xiàn)BS胎牛血清(GIBCO公司)，ALP試劑盒(南京建成)，CCK-8試劑盒(日本同仁公司)，其余試劑購(gòu)自Sigma公司，丹參購(gòu)于哈爾濱市同仁堂大藥房。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 丹參提取物制備

參考文獻(xiàn)[3]，將丹參藥材40 ℃烘干，粉碎成干粉，然后加入10倍水于80 ℃提取兩次，每次提取30 min。過(guò)濾，棄去濾渣，合并濾液，過(guò)濾，將溶液定容至100 mL，離心2000 r/min，10 min，取上清液。

1.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)[4]

取出生14 d的健康 SD大鼠，采用頸椎脫臼法處死浸泡于75%酒精中 10 min，無(wú)菌條件下取雙側(cè)股骨、脛骨以及肱骨，置于無(wú)血清的培養(yǎng)液中，剪斷雙側(cè)干骺端，暴露出骨髓腔，用注射器吸取2.5 mL培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔,收集沖洗液置于離心管中，離心1200 r/min，5 min，棄上清，用含有10%血清的完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，于 5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h 后換液，去除未貼壁細(xì)胞，每2～3d 換液一次，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)80%～90%，0.25%胰酶消化并傳代，每隔2 d換液一次，用傳代的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 丹參提取物對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響

取第三代BMMSCs以1×103/孔的濃度接種于 96 孔板，分別加入0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL的丹參提取液，每組設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔，分別在培養(yǎng)1、3、5、7 d 時(shí)終止培養(yǎng)，同時(shí)每孔中加入100 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)液以及 10 μL CCK-8 檢測(cè)液，置于培養(yǎng)箱中2 h后，使用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定OD值。

1.5 鈣化結(jié)節(jié)染色(茜素紅法)

取第3代細(xì)胞，接種培養(yǎng)皿中，1.0×105/孔。待細(xì)胞貼合至80%后加入濃度0、0.4、0.8、3.2 mg/mL 的丹參提取液，誘導(dǎo)21 d后終培養(yǎng)，PBS 沖洗3次，95%酒精固定 15 min 后， 0.1%茜素紅染色，37 ℃孵育1 h，雙蒸水沖洗3次。觀察并照相。

1.6 ALP含量檢測(cè)

取第 3 代 BMMSCs 以每孔 1.0×105細(xì)胞接種于24 孔板，分別加入0、0.4、0.8、3.2 mg/mL 的丹參提取液。于21 d時(shí)終止培養(yǎng)，參照 ALP 試劑盒說(shuō)明書于 520 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.7 Western bloting 法測(cè)定BMP-2、Runx2蛋白含量

將濃度為0.8 mg/mL的丹參提取物作用于BMMSCs，對(duì)照組不做任何處理，培養(yǎng)7 d后，提取各組細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上， 5%脫脂奶粉室溫孵育2 h后，加入一抗工作液，4 ℃過(guò)夜， TBS-T緩沖液洗膜5次，10 min/次，加入二抗工作液，室溫孵育1 h，TBS-T洗膜5次，10 min/次，采用ECL法顯色。凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 BMMSCs培養(yǎng)及鑒定

大鼠原代細(xì)胞培養(yǎng) 24 h 后可見少量星形、梭形細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，4 d后可見細(xì)胞呈放射狀排列，呈梭形，如圖1A所示。培養(yǎng)7 d后可見細(xì)胞呈片狀生長(zhǎng)排列緊密，呈漩渦狀生長(zhǎng)，如圖1B所示。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。A：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)4d；B：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)7dFig.1 Bone marrow derived mesenchymal stem cell.A: MMSCs cultured for 4 days; B: BMMSCs cultured for 7 days.

2.2 丹參提取物對(duì)BMMSCs增殖的影響

加入丹參提取物1、3、5、7 d后，分別采用CCK-8試劑盒檢測(cè)BMMSCs細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果表明：第3、5、7 d 天各個(gè)濃度的丹參提取物與對(duì)照組比較，丹參提取物均能夠促進(jìn) BMMSCS的增殖，且丹參提取物濃度為0.8 mg/mL時(shí)增殖率最高，如表1所示。

2.3 茜素紅染色結(jié)果

如圖2所示，對(duì)照組沒有明顯的鈣化結(jié)節(jié)，加入丹參提取物后出現(xiàn)明顯的鈣化結(jié)節(jié)染色，丹參提取物濃度為0.8 mg/mL是鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量最多，在丹參提取物濃度為0.4 mg/mL和3.2 mg/mL時(shí)均可見明顯的鈣化結(jié)節(jié)。

2.4 ALP檢測(cè)結(jié)果

不同濃度的丹參提取物對(duì)ALP的影響如表2所示，可以看出，BMMSCs在不同濃度的丹參提取物作用下向成骨細(xì)胞分化的能力明顯增強(qiáng)，且0.8 mg/mL濃度的丹參提取物促進(jìn)BMMSCs向成骨細(xì)胞分化最強(qiáng)，0.4 mg/mL和3.2 mg/mL丹參提取物也能夠促進(jìn)BMMSCs向成骨細(xì)胞分化。

組別OD值1 d3 d5 d7 d對(duì)照組0.53±0.0480.74±0.0590.95±0.0931.13±0.1030.2 mg/mLSME0.52±0.0460.82±0.076?1.11±0.109?1.23±0.141?0.4 mg/mLSME0.55±0.0490.81±0.088?1.12±0.128?1.25±0.122?0.8 mg/mLSME0.58±0.0520.93±0.046??1.21±0.133??1.34±0.151??1.6 mg/mLSME0.53±0.0540.88±0.093?1.15±0.108?1.26±0.132?3.2 mg/mLSME0.54±0.0580.82±0.08781.08±0.106?1.21±0.981?

圖2 茜素紅染色法檢測(cè)成骨細(xì)胞鈣化數(shù)量Fig.2 Calcification density of osteoblasts detected using alizarin red staining

組別nOD值對(duì)照組60.14±0.0090.4 mg/mLSME60.21±0.011?0.8 mg/mLSME60.45±0.021??3.2 mg/mLSME60.38±0.029??

2.5 Western bloting 檢測(cè)成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白結(jié)果

丹參提取物對(duì)成骨細(xì)胞分化相關(guān)蛋白表達(dá)影響如圖3所示，從圖中可以看出加入丹參提取物后BMP-2、Runx-2蛋白含量明顯高于對(duì)照組，且兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖3 丹參提取物對(duì)成骨分化蛋白BMP-2、Runx-2蛋白表達(dá)Fig.3 The expression of BMP-2 and Runx-2 protein in different concentrations of Salvia miltiorrhiza extract

3 討論

BMMSCs可以向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，這種分化不平衡能夠?qū)е鹿琴|(zhì)疏松樣的骨量減少以及脂肪組織增加[5-6]。本研究采用丹參提取物作用于BMMSCs發(fā)現(xiàn)不同濃度的丹參提取物能夠促進(jìn) BMMSCs的增殖作用，在一定濃度范圍內(nèi)促增殖作用呈劑量和時(shí)間依賴性，濃度過(guò)高反而會(huì)減弱對(duì)BMMSCs的促增殖作用。

丹參為活血化瘀類常用藥物，主要用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗塞等心血管疾病[7]。然而，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)心腦血管系統(tǒng)疾病與骨質(zhì)疏松存在著很多聯(lián)系，血管鈣化和骨形成之間存在很多相似的細(xì)胞和分子機(jī)制[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)丹參提取物作用于BMMSCs能夠明顯提高成骨細(xì)胞體內(nèi)ALP含量，0.8 mg/mL丹參提取物對(duì)ALP活性增加最高。茜素紅染色發(fā)現(xiàn)丹參提取物能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的鈣化，且0.8 mg/mL鈣化結(jié)節(jié)最為明顯，0.4 mg/mL和3.2 mg/mL也有明顯的鈣化結(jié)節(jié)，以上結(jié)果表明丹參提取物能夠明顯增加成骨細(xì)胞的增殖和分化。這與Cui[10]研究結(jié)果相似，丹參具有抗骨質(zhì)疏松的作用。

BMP-2通過(guò)激活Smads信號(hào)通路的傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)成骨相關(guān)蛋白的翻譯而發(fā)揮成骨作用，是促進(jìn)骨形成和誘導(dǎo)分化的胞外信號(hào)，Runx2是BMP-2信號(hào)通路的靶基因之一，增加Runx2基因的表達(dá)能夠刺激干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[11]。Western bloting結(jié)果表明加入0.8 mg/mL的丹參提取物能夠明顯增加BMP-2和Runx2 蛋白的含量，這可能是丹參促進(jìn)BMMSCs向成骨分化的機(jī)制。即Runx2和BMP-2翻譯誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化和骨形成。

4 結(jié)論

采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)觀察丹參提取物對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨細(xì)胞分化研究發(fā)現(xiàn)，丹參能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，可能的機(jī)制是丹參促進(jìn)BMP-2和Runx2表達(dá)激活Smads信號(hào)通路，從而促進(jìn)骨形成和分化。