劉佳 羅映紅 龍昱 劉小云

1. 長沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410219 2. 長沙醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，湖南 長沙 410219

外傷、腫瘤切除術(shù)后的較大骨缺損如果依賴自然修復(fù)，進(jìn)程緩慢，效果不良。Vacanti等[1]率先提出以組織工程技術(shù)構(gòu)建骨來進(jìn)行補(bǔ)缺，開辟了生物材料修補(bǔ)的新途徑。組織工程可使用的種子細(xì)胞有多種，臍血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞是其中上佳選擇。從取材的角度，相對于骨髓來源，人臍血獲取容易得多，避免了穿刺取骨髓的痛苦，不會給產(chǎn)婦和胎兒造成傷害，且避免了倫理問題；另外，人臍血細(xì)胞更接近胚胎干細(xì)胞，其免疫原性不強(qiáng)，降低了排異風(fēng)險，提高了效果[2]。但是促使臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的因素尚未完全明確。有研究表明，干細(xì)胞所處的微環(huán)境對細(xì)胞分化起著正向或者負(fù)向調(diào)節(jié)作用，骨損傷過程的局部為炎性微環(huán)境，炎性細(xì)胞因子是否對干細(xì)胞成骨分化存在促進(jìn)或抑制作用，因此本實驗選擇細(xì)胞因子IL-4、IL-6和TNF-α，研究其對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

選自37～40周自然分娩的產(chǎn)婦捐獻(xiàn)者，新生兒分娩離開母體后正常斷離臍帶，消毒臍帶斷端，臍靜脈穿刺，抽吸出臍帶及胎盤內(nèi)的血液，采集臍血量約為15～50 mL，在無菌玻璃瓶中與肝素(40 U/mL)混勻抗凝；采集后12 h內(nèi)分離臍血干細(xì)胞。捐獻(xiàn)者為長沙醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院產(chǎn)婦，采集臍血均征得產(chǎn)婦及其家屬同意和醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：20160023)，并經(jīng)檢測排除傳染性疾病及遺傳疾病。

1.2 實驗用主要試劑

DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；人重組IL-4, IL-6和TNF-α(美國R&D Systems公司)；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、FITC標(biāo)記鼠抗人抗體、胰蛋白酶、Percoll分離液(美國Sigma公司)；ALP檢測試劑盒(南京建成公司)；其他試劑為分析純。

1.3 臍帶血采集，分離、干細(xì)胞鑒定

獲取干細(xì)胞主要參考邵帥研究組的實驗方法進(jìn)行[3]：取15～25 mL抗凝臍血，加入等體積PBS振搖混勻，每次取液體10 mL，置于20 mL預(yù)配好Percoll分離液上層，以2 000 r/min離心20 min；吸取中間白色細(xì)胞層，PBS沖洗后離心去上清，吸取離心管底細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液緩慢吹打均勻，計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)3 d、6d后換培養(yǎng)液，去掉未貼壁細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長融合約90%時，加入0.25%胰蛋白酶溶液室溫下消化2 min，按照1∶2比例傳代培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測：取對數(shù)生長期的第3代臍血培養(yǎng)細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心后棄上清，加PBS調(diào)整細(xì)胞濃度1×109/L，并將其分裝為每管0.2 mL，分別加入FITC標(biāo)記鼠抗人CD29、CD34、CD44 0.01 mL混勻，對照組加入FITC 0.01 mL，在4 ℃避光孵育30 min，離心去上清后PBS清洗2遍，以0.5 mL的PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記。

1.4 成骨分化培養(yǎng)

1.4.1基礎(chǔ)成骨誘導(dǎo)組：取生長旺盛的第3代臍血間充質(zhì)干細(xì)胞，以胰蛋白酶消化后計數(shù)，以105/孔的細(xì)胞數(shù)接種于細(xì)胞培養(yǎng)6孔板中進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)。加入基礎(chǔ)成骨誘導(dǎo)劑(含10%胎牛血清的DMEM+0.01 μmol/L地塞米松+10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉+0.1 mmol/L抗壞血酸)進(jìn)行培養(yǎng)?？瞻讓φ战M為不加成骨誘導(dǎo)劑的細(xì)胞，以完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的DMEM)常規(guī)培養(yǎng)?；A(chǔ)成骨誘導(dǎo)組和空白對照組均設(shè)3平行孔，每3 d換培養(yǎng)液1次，倒置顯微鏡下觀察間充質(zhì)干細(xì)胞的生長情況。

1.4.2細(xì)胞因子誘導(dǎo)組：間充質(zhì)干細(xì)胞加入基礎(chǔ)成骨誘導(dǎo)劑進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后融合達(dá)80%時，用胰蛋白酶消化后以5×105/mL細(xì)胞密度接種于24孔板中，貼壁后換液時，分別加入細(xì)胞因子IL-4, IL-6和TNF-α至終濃度為10 ng/mL，之后每次更換培養(yǎng)液時維持相應(yīng)細(xì)胞因子的濃度。另設(shè)不加細(xì)胞因子的細(xì)胞為陰性對照組。每組設(shè)6平行孔。

1.5 檢測成骨分化的程度

細(xì)胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性檢測：將細(xì)胞在誘導(dǎo)3 d和9d時棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次后每孔加入0.2%TritonX-100 400 μL破裂細(xì)胞，1 h后收集液體，離心取上清10 μL，置于96孔板，按照ALP測定試劑盒說明進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀測定520 nm吸光度值(OD值)，以公式：ALP活力(金氏單位/100 mL)=(OD測定-OD空白)÷(OD標(biāo)準(zhǔn)-OD空白)×0.1 mg/mL×100 mL(1個金氏單位為100 mL樣品在37 ℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚)，計算ALP活力并比較。

鈣結(jié)節(jié)染色：在6孔板中以細(xì)胞因子誘導(dǎo)18 d后吸棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次，95%乙醇固定細(xì)胞后PBS洗滌2次，加0.5%茜素紅染色劑孵育30 min，棄去茜素紅，PBS清洗2遍，室溫下干燥，高倍鏡下隨機(jī)選取10個視野觀察鈣結(jié)節(jié)形態(tài)，并統(tǒng)計鈣結(jié)節(jié)數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 臍帶血干細(xì)胞形態(tài)觀察和表面標(biāo)志物測定

Percoll分離液分離臍血，得到的中間白色層細(xì)胞在接種后48～72 h內(nèi)貼壁，開始細(xì)胞生長緩慢，形態(tài)不均一，呈現(xiàn)梭形和小圓形等多種形態(tài)；經(jīng)過2～3次換培養(yǎng)液，基本去除了不貼壁的細(xì)胞；2周后生長較快，形成較均一的長多邊形細(xì)胞，當(dāng)融合達(dá)到80%左右時可見細(xì)胞呈漩渦狀，細(xì)胞面積隨著時間延長逐漸延展(圖1)。采用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞表面抗原分子，CD29(99.5%)和CD44(98.7%)均高表達(dá)； CD34(1.1%)基本不表達(dá)(圖2)；提示細(xì)胞為較純的間充質(zhì)干細(xì)胞。

圖1 臍帶血干細(xì)胞原代培養(yǎng)(×400)Fig.1 Primary culture of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells (×400)

圖2 干細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)量測定Fig.2 Expression levels of stem cell surface markers

2.2 基礎(chǔ)成骨誘導(dǎo)分化

基礎(chǔ)成骨誘導(dǎo)組和空白對照組在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)相似，生長速度也未見明顯區(qū)別。

2.3 細(xì)胞因子作用后ALP活性測定結(jié)果

誘導(dǎo)3 d時，IL-6、TNF-α組的ALP活力高于陰性對照組(P<0.05)；誘導(dǎo)9 d時，IL-4、IL-6實驗組ALP活性均顯著高于陰性對照組(P<0.01)。結(jié)果顯示，隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時間的延長，實驗組和對照組均呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢；對照組ALP活性增長不快(1.71倍)，細(xì)胞因子IL-4、IL-6刺激后各實驗組細(xì)胞內(nèi)ALP活力顯著增強(qiáng)，誘導(dǎo)9 d時，其中IL-6組的ALP活力為誘導(dǎo)3 d時的活力的9.51倍；TNF-α組ALP活力在短時間(3 d)內(nèi)有增加，但是TNF-α作用時間達(dá)到9 d時，ALP活力反倒未提升了，提示TNF-α對成骨分化的促進(jìn)作用有效期短。見表1。

2.4 茜素紅染色結(jié)果

實驗組細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)成骨18 d后，以茜素紅染色，可見被染成紅色的鈣結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)形態(tài)無規(guī)則、大小不一；其中IL-6組鈣結(jié)節(jié)數(shù)目最多，高倍鏡視野下可見(11.2±1.75)個結(jié)節(jié)；TNF-α組鈣結(jié)節(jié)為(4.5±1.90)個，且鈣質(zhì)含量不高、結(jié)節(jié)染色較淺；IL-4組高倍鏡視野結(jié)節(jié)數(shù)目(6.4±1.78)個，但普遍面積較??；陰性對照組偶見鈣結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)數(shù)為(0.6±0.84)，且面積小(圖3)。各細(xì)胞因子實驗組鈣結(jié)節(jié)數(shù)都比陰性對照顯著(n=10，P<0.01)。

分組作用時間ALP活力(king’sU)作用時間ALP活力(king’sU)陰性對照組3d265 5±33 59d453 2±20 4 IL-4組301 8±18 9911 6±24 1?? IL?6組496 0±68 8?4714 7±31 6?? TNF?α組387 2±21 2?527 2±40 5

注：與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖3 細(xì)胞因子成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色(×400)Fig.3 Alizarin red staining of MSCs induced by IL-4, IL-6, or TNF-α (×400)

3 討論

臍帶等結(jié)構(gòu)在女性生產(chǎn)后，常作為醫(yī)療廢棄物處置，這極為可惜，因為臍血有很多具有多向分化能力的干細(xì)胞，除了造血干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞也可在體內(nèi)外分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，本課題組采用的是國內(nèi)同行研究人員類似的方式，實驗不需要高精儀器來完成，方法較為簡易，培養(yǎng)中可逐步去掉非貼壁細(xì)胞的血細(xì)胞和造血干細(xì)胞。鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞則需要檢測其特異性的表面標(biāo)志物，例如CD29、CD44、CD90或CD105等間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物是否表達(dá)，同時滿足造血干細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD34不表達(dá)。本組實驗中培養(yǎng)的第3代細(xì)胞，以流式細(xì)胞儀進(jìn)行表面標(biāo)志物測定，確定細(xì)胞以間充質(zhì)干細(xì)胞為主，血細(xì)胞極少；細(xì)胞分離量雖有限，但足以用于實驗研究。

許多胞外成分可引導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，如骨形成蛋白2[4]、成纖維細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β、胰島素樣生長因子[5]、力生長因子[6]等，但較常用的方法為地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸共同促間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。其中地塞米松可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞堿性磷酸酶活性增強(qiáng)，早期促基質(zhì)合成，后期促鈣化；β-甘油磷酸鈉迅速水解生成磷酸根離子，可作為堿性磷酸酶的底物，促進(jìn)鈣鹽沉積；抗壞血酸可以促進(jìn)細(xì)胞合成膠原，形成鈣化。本實驗除了采用經(jīng)典的基礎(chǔ)成骨誘導(dǎo)劑(抗壞血酸+β-甘油磷酸鈉+地塞米松)，還加入了新的成分——炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-4、IL-6等，為了探索更有效的的成骨分化誘導(dǎo)因素。

在骨損傷修復(fù)的初始階段，炎性相關(guān)細(xì)胞因子被釋放在損傷部位，短時間內(nèi)對周圍的各類細(xì)胞都有著促進(jìn)增殖、加速修復(fù)的作用，有研究表明，IL-10等細(xì)胞因子可抑制破骨細(xì)胞活性、加速成骨[7]，但是也有研究者提出IL-6促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖和活性[8]。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞都是已經(jīng)分化的細(xì)胞，而各類細(xì)胞因子是否影響原始的多能間充質(zhì)干細(xì)胞分化成為成骨細(xì)胞、對骨修復(fù)進(jìn)行支持，這是有爭議的。本實驗顯示，細(xì)胞因子TNF-α,IL-6和IL-4在人類臍血來源間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化中的促進(jìn)作用。濃度10ng/mL的TNF-α作用3 d，IL-6，IL-4在作用9 d后顯著增加了ALP活力，三種細(xì)胞因子誘導(dǎo)18 d后則顯著增加鈣結(jié)節(jié)的形成，在基礎(chǔ)成骨誘導(dǎo)劑的作用上更進(jìn)一步促進(jìn)成骨。其中尤其是IL-6，顯著的增強(qiáng)了ALP活力,在骨結(jié)節(jié)的形成上也能看出其作用顯著?？傊?所選細(xì)胞因子短時間(18 d)內(nèi)都有提高成骨分化的作用,但是TNF-α只在極短時間內(nèi)(3 d)起作用，估計主要是一過性促進(jìn)成骨的作用；本實驗結(jié)果與陳林等[9]的TNF-α對成骨分化的影響受作用時間、作用濃度的影響，較為相同。比較三種細(xì)胞因子，IL-6起效快、有效時間較長、效果顯著，可能是合適的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化誘導(dǎo)因子，這也與Angela等[10]結(jié)果較為一致。