范世珍，于波海，陳旭娜，莫 莉

(深圳市福田區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳518034)

姜黃素調(diào)控自噬在抑制HPV陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞的體外研究

范世珍，于波海，陳旭娜，莫 莉

(深圳市福田區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳518034)

目的 研究姜黃素在體外應(yīng)用于誘導(dǎo)HPV陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞凋亡與自噬的影響。方法 采用MTT檢測(cè)法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)姜黃素(10,20,30,40 μmol/L)對(duì)HPV陽(yáng)性宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖和凋亡的影響；采用自噬抑制劑3-MA與姜黃素聯(lián)用，觀察自噬對(duì)姜黃素抑制HPV陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響；分光光度法檢測(cè)SiHa細(xì)胞Caspase-3活性；應(yīng)用ELISA檢測(cè)姜黃素和(或)自噬抑制劑3-MA對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax和Beclin-1表達(dá)的影響。結(jié)果 姜黃素對(duì)HPV陽(yáng)性的宮頸癌SiHa細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，而且這種抑制作用呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性；而姜黃素與3-MA聯(lián)用后，對(duì)HPV陽(yáng)性宮頸癌SiHa細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用明顯下降；與對(duì)照組相比，姜黃素組細(xì)胞Caspase-3活性明顯提高(P<0.01)、Bax和Beclin-1的表達(dá)均明顯升高(P<0.01)，而Bcl-2的表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與單獨(dú)應(yīng)用姜黃素組相比，姜黃素與3-MA聯(lián)用組細(xì)胞Caspase-3活性和Bax表達(dá)均明顯下降(P<0.01)，而Bcl-2的表達(dá)明顯增加(P<0.01)。結(jié)論 姜黃素能有效抑制HPV陽(yáng)性宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖，可以提高細(xì)胞Caspase-3活性、促進(jìn)促凋亡因子Bax的表達(dá)升高和抑制凋亡因子Bcl-2表達(dá)下調(diào)，同時(shí)促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白Beclin 1的表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)HPV陽(yáng)性宮頸癌SiHa細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬性細(xì)胞死亡。

姜黃素；宮頸癌SiHa細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；自噬

(ChinJLabDiagn,2017,21:1264)

宮頸癌(Cervical cancer)作為全球第三大癌癥類型，是導(dǎo)致癌癥死亡率的第四大原因[1]，超過(guò)85%的宮頸癌病例和死亡發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。 其發(fā)病率與人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的持續(xù)感染高度相關(guān)，特別是HPV 16和18型[2,3]。國(guó)外一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，有超過(guò)50%和13%的宮頸癌分別與HPV16和18相關(guān)[4]。姜黃素(Curcumin)是一種來(lái)自姜科姜黃屬植物姜黃根莖中的多酚類物質(zhì)[5,6]?，F(xiàn)代分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗病毒以及抗腫瘤等多種藥理作用[7-13]。本研究旨在探索姜黃素對(duì)HPV 陽(yáng)性宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖抑制作用，并初步研究這種作用是否與其對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)控有關(guān)，以期為臨床上HPV陽(yáng)性宮頸癌的治療提供新的思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

姜黃素(純度98%)、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)購(gòu)自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。細(xì)胞培養(yǎng)胎牛血清(南京森貝伽生物科技有限公司)；AnnexinⅤ-FITC 凋亡試劑盒(碧云天)；Caspase-3分光光度法檢測(cè)試劑盒(南京凱基公司)、Bcl-2和Bax ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物)；Beclin1檢測(cè)試劑盒(上海艾睿生物科技有限公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó) Bio-Rad 公司)；細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；細(xì)胞超聲破碎儀(寧波新芝生物科技有限公司)；流式細(xì)胞儀(FC500，美國(guó)Beckman)。其余試劑均購(gòu)自上海生物工程有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

人宮頸癌細(xì)胞系SiHa購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，用含10%熱滅活的胎牛血清以及抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2以及95%空氣的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代10-20次后，實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對(duì)照組(姜黃素 0 μmol/L)、姜黃素(10、20、30、40 μmol/L)組、3-MA(2 μmol/L)組和姜黃素(30 μmol/L)+3-MA組，分別加入姜黃素和(或)(2 μmol/L)3-MA作用24,48,72 h，隨后收集細(xì)胞進(jìn)行下一步研究。

1.3 MTT檢測(cè)SiHa細(xì)胞增殖

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SiHa細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種量1.0×105個(gè)，經(jīng)姜黃素和(或)3-MA作用24,48,72 h后，棄培養(yǎng)上清，加入100 μl MTT溶液(將10 μl 10 μg/ml MTT用90 μl培養(yǎng)基稀釋)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，待形成藍(lán)紫色的結(jié)晶沉淀后傾去上清，加入100 μl DMSO溶液，振搖15 min，待甲瓚顆粒完全溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。

1.4 SiHa細(xì)胞凋亡情況檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SiHa細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種量1.0×105個(gè)，6 h后細(xì)胞穩(wěn)定時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別加入姜黃素和(或)3-MA處理細(xì)胞，48 h后按照 Annexin V-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書處理細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 分光光度法檢測(cè)SiHa細(xì)胞Caspase-3活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SiHa細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種量1.0×105個(gè)，6 h后細(xì)胞穩(wěn)定時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別加入姜黃素和(或)3-MA處理細(xì)胞，48 h后采用試劑盒所附操作指南通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)SiHa細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性。

1.6 姜黃素對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax和Beclin-1表達(dá)的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SiHa細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種量1.0×105個(gè)，6 h后細(xì)胞穩(wěn)定時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別加入姜黃素和(或)3-MA處理細(xì)胞，48 h后分別按照試劑盒說(shuō)明書對(duì)SiHa細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2、Bax和Beclin-1 進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖的影響

由圖1可見(jiàn)，與對(duì)照組(0μmol/L)相比，不同濃度的姜黃素(10、20、30、40μmol/L)分別處理宮頸癌SiHa細(xì)胞24、48、72h后，宮頸癌SiHa細(xì)胞的生長(zhǎng)均受到不同程度抑制，而且這種抑制作用呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性。當(dāng)30μmol/L濃度的姜黃素處理宮頸癌SiHa細(xì)胞48h后，宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖的抑制率為48.6%(P<0.01)，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用30μmol/L濃度的姜黃素進(jìn)行。

圖1 不同濃度姜黃素在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖的抑制率

2.2 姜黃素與自噬抑制劑3-MA聯(lián)用對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖的影響

由圖2可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，30μmol/L濃度的姜黃素作用于宮頸癌SiHa細(xì)胞48h后，宮頸癌SiHa細(xì)胞的生長(zhǎng)均受到明顯抑制(P<0.01)；而單獨(dú)使用自噬抑制劑3-MA(2μmol/L)處理細(xì)胞48h，對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響(P>0.05) 。與單獨(dú)應(yīng)用姜黃素組相比，姜黃素與3-MA聯(lián)用組對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖的抑制作用明顯下降(P<0.01)。MTT結(jié)果提示，姜黃素對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用，而自噬抑制劑3-MA可以降低姜黃素抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖的作用。

注：與對(duì)照組比較*P<0.01；與姜黃素組比較，#P<0.01。

2.3 姜黃素與自噬抑制劑3-MA聯(lián)用對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡的影響

由圖3細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，30μmol/L濃度的姜黃素組中細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)；而自噬抑制劑3-MA組中細(xì)胞的凋亡率無(wú)明顯變化(P>0.05 ) 。與單獨(dú)應(yīng)用姜黃素組相比，姜黃素與3-MA聯(lián)用組中宮頸癌SiHa細(xì)胞的凋亡率明顯下降(P<0.01)。上述結(jié)果與MTT檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果相一致。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與姜黃素組比較，#P<0.01。

2.4 姜黃素對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞Caspase-3活性的影響

如圖4所示，與對(duì)照組相比，姜黃素處理可以提高宮頸癌SiHa細(xì)胞Caspase-3活性，并呈濃度依賴性(P<0.01)；而3-MA組細(xì)胞Caspase-3活性無(wú)明顯變化(P>0.05 ) 。與單獨(dú)應(yīng)用姜黃素組相比，姜黃素與3-MA聯(lián)用組中細(xì)胞Caspase-3活性明顯下降(P<0.01)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與姜黃素組比較，#P<0.01。

2.5 姜黃素對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞Bcl-2、Bax和Beclin-1表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，姜黃素組細(xì)胞中Bax和Beclin-1表達(dá)明顯增加(P<0.01)，而Bcl-2的表達(dá)明顯減低(P<0.01)；而3-MA組細(xì)胞Bcl-2、Bax和Beclin-1表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05 ) 。與單獨(dú)應(yīng)用姜黃素組相比，姜黃素與3-MA聯(lián)用組細(xì)胞Bax表達(dá)均明顯下降(P<0.01)，而Bcl-2的表達(dá)增加(P<0.01)，詳見(jiàn)表1。

表1 姜黃素對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞Bcl-2、Bax和Beclin-1表達(dá)的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與姜黃素30 μmol/L組比較，#P<0.01。

3 討論

姜黃素是一種來(lái)源于姜黃根莖(姜黃)中的多酚類物質(zhì)，也是亞洲和印度最喜歡的食品調(diào)味品之一[6]。以往的實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有多種生物和藥理作用，包括抗炎[8，9]，抗氧化劑[10]，保肝[11]，抗關(guān)節(jié)炎[12]，抗癌和化學(xué)預(yù)防[13]和免疫調(diào)節(jié)[7]等。本實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用姜黃素(10、20、30、40 μmol/L)分別處理宮頸癌SiHa細(xì)胞24、48、72 h后，發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)HPV陽(yáng)性的宮頸癌SiHa細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，而且這種抑制作用呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性。這與之前的文獻(xiàn)報(bào)道相似[3,6,7]，然而姜黃素抑制HPV陽(yáng)性宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖的具體機(jī)制至今尚不完全清楚。

自噬是一種非凋亡性細(xì)胞死亡，通過(guò)溶酶體的作用降解不必要或功能失調(diào)的細(xì)胞成分，特別是當(dāng)細(xì)胞面臨諸如放射和化學(xué)治療等惡劣環(huán)境時(shí)，自噬對(duì)細(xì)胞的生存必不可少。在自噬過(guò)程中，靶向的細(xì)胞質(zhì)成分被裝入雙膜囊泡(自噬體)，其與溶酶體融合以產(chǎn)生自溶質(zhì)并因此降解。研究發(fā)現(xiàn)自噬在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝平衡、抗腫瘤以及抵抗微生物等方面起著重要的生物學(xué)作用[14]。自噬是細(xì)胞防御和應(yīng)激調(diào)控的重要機(jī)制。自噬在病毒感染和機(jī)體免疫中起調(diào)控作用，自噬過(guò)程異常可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡。許多RNA病毒和DNA病毒感染的細(xì)胞都存在自噬現(xiàn)象。自噬在宿主免疫防御中起重要作用，包括細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡，腫瘤抑制和轉(zhuǎn)移，抗原呈遞，病原體清除，抗衰老和神經(jīng)變性等[14,15]。3-甲基腺嘌呤(3-MA)是目前常用的一種自噬抑制劑，主要通過(guò)抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的磷脂酰肌醇三磷酸激酶(PI3K)來(lái)抑制自噬的起始階段。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素可以誘導(dǎo)HPV陽(yáng)性宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡，而姜黃素分別與3-MA聯(lián)用后，對(duì)HPV陽(yáng)性宮頸癌SiHa細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用明顯下降。說(shuō)明姜黃素誘導(dǎo)HPV陽(yáng)性宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡的作用可能與誘導(dǎo)細(xì)胞自噬有關(guān)。

Beclin 1 是哺乳動(dòng)物的自噬相關(guān)蛋白，與自噬的激活和自噬體的形成密切相關(guān)[16]。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中最有代表性的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡基因， 而活化的Caspase 3 常被用作細(xì)胞凋亡的標(biāo)記物，它們?cè)谀[瘤細(xì)胞凋亡中具有重要作用[17]。自噬與凋亡不單參與維持機(jī)體正常生理功能的平衡，還參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，在特定條件下，凋亡與自噬之間存在著互相促進(jìn)、互相拮抗又或是互相轉(zhuǎn)換的復(fù)雜關(guān)系[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過(guò)提高HPV陽(yáng)性宮頸癌SiHa細(xì)胞Caspase-3活性，誘導(dǎo)細(xì)胞Bax的表達(dá)升高和Bcl-2的表達(dá)降低而發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)姜黃素在調(diào)控細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的同時(shí)，還引起細(xì)胞Beclin 1的表達(dá)升高；而與單獨(dú)應(yīng)用姜黃素組相比，姜黃素與3-MA聯(lián)用后，宮頸癌SiHa細(xì)胞Beclin 1的表達(dá)均明顯下降，同時(shí)聯(lián)用3-MA組細(xì)胞Caspase-3活性和Bax的表達(dá)也明顯下降，而Bcl-2的表達(dá)升高，姜黃素誘導(dǎo)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡的作用受到明顯抑制。提示姜黃素可以通過(guò)提高細(xì)胞Caspase-3活性、上調(diào)Bax表達(dá)和抑制Bcl- 2表達(dá)，同時(shí)上調(diào)自噬相關(guān)蛋白Beclin 1表達(dá)，誘導(dǎo)HPV陽(yáng)性宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能有效抑制HPV陽(yáng)性宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖，可以提高細(xì)胞Caspase-3活性、促進(jìn)促凋亡因子Bax的表達(dá)升高和抑制凋亡因子Bcl-2表達(dá)下調(diào)，同時(shí)促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白Beclin 1的表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)HPV陽(yáng)性宮頸癌SiHa細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬性細(xì)胞死亡。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，我們將對(duì)姜黃素誘導(dǎo)HPV陽(yáng)性宮頸癌SiHa細(xì)胞發(fā)生自噬的機(jī)制及其與凋亡的關(guān)系開(kāi)展進(jìn)一步研究，以進(jìn)一步明確自噬在姜黃素抑制HPV陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞增殖中的分子機(jī)制。

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Curcumin regulated mitochondrial autophagy in the inhibition of HPV-positive cervical cancer cells

FANShi-zhen,YUBo-hai,CHENXu-na,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,TraditionalChineseMedicalHospitalofFutian,Shengzhen,Guangdong518034,China)

Objective To study the effect of curcumin on the apoptosis and autophagy of HPV-positive cervical cancer cells in vitro.Methods The effects of curcumin (10,20,30,40 μmol / L) on the proliferation and apoptosis of HPV-positive cervical cancer SiHa cells were detected by MTT assay and flow cytometry; autophagy inhibitor 3-MA

was used in combination with curcumin to observe the effect of autophagy on curcumin inhibition of HPV positive cervical cancer cell proliferation and induction of apoptosis; the expression of Caspase-3 in SiHa cells was detected by spectrophotometry,and the effects of curcumin and / or autophagy inhibitors (3-MA) on the expression of Bcl-2 and Bax in cervical cancer SiHa cells were detected by ELISA.Results Curcumin inhibited the growth of HPV-positive cervical cancer SiHa cells,and the inhibitory effect was in a dose-dependent and time-dependent manner.After curcumin combined with 3-MA,the effect of curcumin on the HPV-positive cervical cancer SiHa The effect of cell apoptosis was significantly decreased.Compared with the control group,the expression of Caspase-3,Bax and Beclin-1 in the curcumin group was significantly higher than that in the control group (P<0.01),while the expression of Bcl-2 was significantly decreased (P<0.01) (P<0.01),and the expression of Bcl-2 was significantly higher in the combination of curcumin and 3-MA group (P<0.01),and the expression of Caspase-3,Bax and Beclin-1 increased (P<0.01).Conclusion Curcumin can effectively inhibit the proliferation of HPV-positive cervical cancer SiHa cells,can promote the expression of pro-apoptotic factors Bax,Caspase-3 and inhibit the down-regulation of apoptosis factor Bcl-2 expression,while promoting the expression of autophagy-related protein Beclin 1 Upregulation,which induced HPV-positive cervical cancer SiHa cells apoptosis and autophagic cell death.

Curcumin;Cervical cancer SiHa cells;Apoptosis;Autophagy

2015年深圳市科技研發(fā)資金基礎(chǔ)研究資助項(xiàng)目 (JCYJ20150331091010278)

1007-4287(2017)07-1264-05

R737.33

A

范世珍，女，44歲，主任技師，學(xué)士學(xué)位，從事臨床檢驗(yàn)研究。

2016-12-26)