夏劍鋒，谷江，張永春，劉淼，董安濤，楊錦春

（貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，貴陽550004）

烏梅提取物對納米細(xì)菌致大鼠腎損傷的修復(fù)與拮抗結(jié)石生成的關(guān)系研究

夏劍鋒，谷江，張永春，劉淼，董安濤，楊錦春

（貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，貴陽550004）

目的構(gòu)建納米細(xì)菌（NB）致腎結(jié)石大鼠模型，觀察烏梅提取物對早期腎損傷分子1（KIM-1）和骨橋蛋白（OPN）的影響，分析烏梅提取物對早期腎結(jié)石的治療意義。方法從人上尿路結(jié)石分離并培養(yǎng)NB。將54只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組、誘石組和治療組，采取尾靜脈注射NB構(gòu)建腎結(jié)石模型，以烏梅提取物干預(yù)模型，并在不同時期分批處死大鼠，實時PCR檢測腎組織KIM-1 mRNA的表達(dá)，ELISA檢測尿KIM-1濃度，HE染色觀察腎組織結(jié)石晶體情況，并用免疫組化方法檢測OPN表達(dá)。結(jié)果誘石組及治療組腎結(jié)石模型大鼠出現(xiàn)腎小管擴(kuò)張，腎小管結(jié)石晶體形成，早期KIM-1和OPN的表達(dá)升高，上述變化與NB的注射時間呈正相關(guān)，烏梅提取物可拮抗該類變化。結(jié)論烏梅提取物可能通過修復(fù)腎損傷減少腎結(jié)石形成，該機(jī)制可能與烏梅提取物對KIM-1、OPN的基因調(diào)節(jié)有關(guān)。

烏梅提取物；納米細(xì)菌；腎結(jié)石；損傷修復(fù)

泌尿系結(jié)石是泌尿外科常見病，以腎結(jié)石為主，主要成分是草酸鈣，具有復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)［1-2］。研究［3］發(fā)現(xiàn)，腎集合管、腎乳頭細(xì)胞受到納米細(xì)菌（nanobacteria，NB）的破壞損傷，并形成碳灰石晶核，成為結(jié)石核心基質(zhì)，繼而誘發(fā)結(jié)石形成。烏梅含多種有機(jī)酸，其中檸檬酸是納米細(xì)菌礦化的顯著抑制物［4］，且烏梅在免疫損傷、氧化損傷中的修復(fù)作用逐漸被認(rèn)識［5］，故研究選取烏梅提取物作為治療干預(yù)藥物。同時，檢測腎損傷分子1（kidney injury molecule-1，KIM-1）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的早期變化，探尋其作為評估早期腎結(jié)石形成的預(yù)警指標(biāo)價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器：兔抗大鼠多克隆抗體、多聚體抗兔IgG-HRP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、大鼠KIM-1 ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），Trizol裂解液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR Master-Mix（上海生工生物工程有限公司），檸檬酸含量測試盒（南京建成生物工程研究所），草酸檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），紫外可見光分光光度計［島津儀器（蘇州）有限公司］，多功能酶標(biāo)儀（Bio-tech公司）。

1.1.2 實驗動物：健康雄性SD大鼠54只，體質(zhì)量200～230 g，購于貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物合格證編號為01201224。

1.2 方法

1.2.1 NB細(xì)菌的分離及培養(yǎng)：將收集的人上尿路結(jié)石經(jīng)去礦物質(zhì)處理（1 mol/L HCl，30 min）、中和（PBS）、碾碎、離心（20 000 r/min，40 min）、過濾（0.22 μm）等步驟，留取濾液加入含γ-FBS的PMBI1640中培養(yǎng)8周，培養(yǎng)條件為37℃、pH7.4、5% CO2和95%空氣，30 d換液1次；以生理鹽水（經(jīng)上述相同步驟）作為陰性對照，每周記錄NB的生長情況，留取培養(yǎng)出的NB混懸液。

1.2.2 動物分組及給藥方法：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為空白組、誘石組和治療組，每組18只（6只/籠），其中，空白組第1日尾靜脈注射生理鹽水（1 mL/只），每日以生理鹽水灌胃（2 mL/只）；誘石組第1日尾靜脈注射NB混懸液［6］（1 mL/只），每日以生理鹽水灌胃（2 mL/只）；治療組第1日尾靜脈注射NB混懸液（1 mL/只），每日以烏梅提取物（0.15 g/mL，2 mL/只）懸液灌胃。標(biāo)準(zhǔn)鼠糧喂養(yǎng)，自由飲水。在烏梅給藥的第1、2、4周后分別隨機(jī)處死各組大鼠6只及留取腎，處死前收集大鼠24 h尿液。

1.2.3 檢測指標(biāo)：將一側(cè)腎制成腎組織勻漿，實時PCR檢測其KIM-1mRNA的表達(dá)水平。將留取的腎組織勻漿保存于Trizol中，按說明書操作提取總RNA，分別使用one-drop檢測其濃度和凝膠電泳檢測其完整性。取7 μL逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列為β-actin上游5’-TCATGAAGTGTGACGTTGA CATCCGT-3’，下游5’-CCTAGAAGCATTTGCGGTG CACGATG-3’，產(chǎn)物長度285 bp。KIM-1上游5’-TG GAGATTCCTGGATGGT-3’，下游5’-GAGGTG GAGACTCTGGTTGA-3’，產(chǎn)物長度175 bp。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)后，72℃5 min終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，以2.0%瓊脂糖凝膠電泳成像。將另一側(cè)腎以10%福爾馬林固定，制備石蠟病理切片，HE染色觀察腎組織結(jié)晶情況，以及應(yīng)用免疫組化檢測腎組織OPN表達(dá)程度，24 h尿液離心（3 000 r/ min，20 min，4℃）后送我院生化科檢測尿Ca2+、尿Mg2+、尿酸（uric acid，UA）含量；采用Cr3+比色法和高錳酸鉀褪色法測定尿檸檬酸（citric acid，CA）和草酸（oxalic acid，Oxa）含量；ELISA檢測尿液KIM-1濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以x±s表示，OPN表達(dá)強(qiáng)度數(shù)量比較采用秩和檢驗（Kruskal-Wallis H），其余數(shù)據(jù)均采用單因素方差（oneway ANOVN）分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 24 h尿液生化指標(biāo)

各組大鼠Ca2+、Mg2+、UA、Oxa、CA在尿液的含量如表1所示，誘石組和治療組較空白組各項指標(biāo)均有不同程度變化，其中尿Ca2+、UA和Oxa的排出量均增加，尿Mg2+排出量減少，誘石組CA顯著下降，治療組CA則明顯上升。

2.2 大鼠腎結(jié)石模型形成結(jié)晶

喂養(yǎng)時間最長（第4周）的誘石組大鼠可見腎小管明顯擴(kuò)張，小管內(nèi)形成結(jié)石晶體，且結(jié)晶較密集甚至鏈接成片堵塞小管；而治療組結(jié)晶形成程度較誘石組輕，以散在不鏈接為主，見圖1。

2.3 腎組織KIM-1mRNA的表達(dá)

以β-actin作內(nèi)參，觀察擴(kuò)增后KIM-1mRNA表達(dá)水平，可見治療組表達(dá)水平略低于誘石組，而空白組表達(dá)水平明顯低于誘石組及治療組，見圖2。

2.4 大鼠尿液KIM-1含量變化

誘石組第1周KIM-1尿液濃度顯著增加，約為空白組的3倍，其后隨時間延長而逐漸增加；而治療組在第1周的排出量也增加，但在第4周的排出量較第2周減少，治療組的變化量較誘石組稍弱，見表2。

2.5 腎組織OPN免疫組化檢測結(jié)果

OPN在3組腎小管均有表達(dá)（圖3），以髓質(zhì)腎小管為主，空白組只能檢測到有微弱表達(dá)（+），而誘石組第1周就能檢測到陽性表達(dá)，且隨時間延長其表達(dá)強(qiáng)度逐漸增加（++～+++），在第2周之后即出現(xiàn)所有處死大鼠強(qiáng)陽性表達(dá)（P＜0.05）；治療組亦檢測到OPN的表達(dá)，但是表達(dá)明顯弱于誘石組（+～++）；OPN表達(dá)的大鼠數(shù)量（表3）第1周其Kruskal-Wallis H檢驗結(jié)果（P＜0.05）提示，空白組、誘石組和治療組的平均秩次分別為6.00、13.50和9.00，表明在第1周時，誘石組OPN表達(dá)最強(qiáng)，治療組次之，空白組最低（+，腎小管胞質(zhì)淺黃色；++，腎小管胞質(zhì)黃色；+++，腎小管胞質(zhì)黃色深染，能看到深棕色顆粒）。

表1 2 4 h尿液生化指標(biāo)（x±s）Tab.1 Twenty-four-hour biochem ical indexes in urine（x±s）

圖1 腎小管草酸鈣晶體HE×200Fig.1 Ca lcium oxa late crystal in renal tubular HE×200

圖2 各組大鼠第1周腎組織KIM-1 mRNA的表達(dá)水平Fig.2 The KIM-1 mRNA expression leve l in the renal tissue of rats on the first week

3 討論

腎結(jié)石的最初形成需要結(jié)晶鹽的析出、結(jié)石核心形成和腎小管上皮細(xì)胞提供可粘附的受創(chuàng)平面［7-8］。NB致腎結(jié)石產(chǎn)生的學(xué)說符合上述條件，NB在生理性鈣磷濃度環(huán)境下可形成羥磷灰石碳酸鹽結(jié)晶，從而形成結(jié)石核心，NB的毒性作用可導(dǎo)致細(xì)胞的空泡形成、組織炎癥反應(yīng)和腫脹［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，各實驗組可見腎小管擴(kuò)張，結(jié)石晶體形成，隨著NB浸染時間的延長，腎小管擴(kuò)張程度增大，細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性和壞死，管內(nèi)結(jié)晶量也增多，該結(jié)果符合上述觀點(diǎn)。烏梅富含多種能明顯抑制結(jié)石形成的有機(jī)酸，其中檸檬酸是納米細(xì)菌礦化的顯著抑制物，而有機(jī)酸的協(xié)同作用能與鈣離子螯合降低結(jié)石的形成［9］。同時，烏梅中多種有機(jī)酸的協(xié)同效應(yīng)具有較強(qiáng)的抗氧化和抗免疫損傷作用，進(jìn)而修復(fù)組織和細(xì)胞的損傷［10-11］。而本研究中尿生化指標(biāo)的變化結(jié)果與檸檬酸抑制結(jié)石礦化、修復(fù)組織和細(xì)胞損傷的作用相符。

表2 空白組、誘石組和治療組尿KIM-1含量（x±s，pg/m L）Tab.2 Urinary KIM-1 content in the control，stone and treatm ent groups（x±s，pg/m L）

圖3 免疫組化染色檢測OPN在腎小管的表達(dá)×200Fig.3 Immunohistochem ical staining of OPN in renal tubules×200

表3 不同時間點(diǎn)大鼠OPN蛋白表達(dá)強(qiáng)度的數(shù)量比較Tab.3 Com parison of the number o f OPN protein exp ression intensity at different tim e points

KIM-1是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，因其在尿液中穩(wěn)定、不易變性［12］，故KIM-1被認(rèn)為是腎小管損傷與修復(fù)的生物學(xué)標(biāo)記［13］。在本研究KIM-1的2組實驗中，第1周腎組織KIM-1mRNA條帶亮度誘石組高于空白組，誘石組尿KIM-1第1周出現(xiàn)高表達(dá)，表明KIM-1在結(jié)石形成的早期即出現(xiàn)了表達(dá)。根據(jù)研究［14-16］報道，KIM-1高表達(dá)會導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）的增加，ROS的升高加劇了氧化應(yīng)激，進(jìn)一步造成腎小管細(xì)胞損傷，使草酸鈣晶體在損傷腎小管細(xì)胞沉積并黏附聚集，并且腎小管細(xì)胞損傷增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞的趨化作用，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞浸潤使KIM-1增加，而草酸鈣晶體的沉積黏附又使腎小管細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重，這樣惡性循環(huán)最終形成結(jié)石。

OPN是一種分泌型的磷酸化糖蛋白，主要在遠(yuǎn)端小管和集合管表達(dá)，與結(jié)石的形成密切相關(guān)［17］。本研究中，誘石組OPN在第1周出現(xiàn)陽性表達(dá)，并強(qiáng)于空白組和治療組，說明OPN在結(jié)石形成的早期即出現(xiàn)了表達(dá)。有研究［17］表明，OPN能促進(jìn)炎癥發(fā)生，加速腎小管損傷，從而提供結(jié)晶附著位點(diǎn)，草酸鈣沉積會誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS［15］，一水草酸鈣（calcium oxalate monohydrate，COM）在ROS的作用下產(chǎn)生OPN和單核細(xì)胞趨化因子1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1），而OPN和MCP-1對炎癥均具有促進(jìn)作用，進(jìn)而導(dǎo)致形成結(jié)石［15，18］；COM表面帶正電荷，腎小管上皮細(xì)胞帶負(fù)電荷，因電荷的相互作用加速了結(jié)石的形成［19］。

綜上所述，烏梅提取物可能通過修復(fù)腎損傷減少腎結(jié)石形成，該機(jī)制可能與烏梅提取物對KIM-1、OPN的基因調(diào)節(jié)有關(guān)，KIM-1、OPN可作為早期腎結(jié)石形成的檢測指標(biāo)，為早期診斷結(jié)石形成和預(yù)防結(jié)石復(fù)發(fā)提供新的研究方向。

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（編輯于溪）

Effect of Fructus Mume Extract on Repair of Renal Injury Induced by Nanobacteria in Rats and Its Relationship with Antagonistic Stone Formation

XIA Jianfeng，GU Jiang，ZHANG Yongchun，LIU Miao，DONG Antao，YANG Jinchun

（Department of Urology，The Hospital Affiliated of Guizhou Medcial University，Guiyang 550004，China）

Objective To observe the early effect of Fructus mume extract on KIM-1 and OPN levels in rats with kidney stone formation induced by nanobacteria and to investigate the therapeutic significance of F.mume extract on early kidney stone formation.Methods Nanobacteria were separated and cultured from human upper urinary calculi.The study group appropriately included 54 healthy male SD rats.The renal calculus model was constructed by tail vein injection of nanobacteria.A kidney stone model was created with an F.mume extract intervention，and rats were killed at different stages of the intervention.Real-time polymerase chain reaction was used to detect the KIM-1mRNA expression in rat renal tissue，and the KIM-1 concentration in urine was detected by using enzyme-linked immunosorbent assay.We detected kidney tissue stone crystals and OPN expression by using hematoxylin-eosin staining and immunohistochemistry.Results Renal tubules of the experimental model were significantly expanded，thatis，the formationof renal tubularstones.Theearly KIM-1and OPNexpression levelswere increased.Theabove-mentioned changespositively correlated with the injection time of the nanobacteria，and F.mume extract antagonized the changes.Conclusion F.mume extract may be useful for the repairofrenalinjury to reducekidney stone formation，whichmaybe related to thegene regulationofKIM-1and OPN.

fuctus mume extract；nanobacteria；kidney stones；injury repair

R692.4

A

0258-4646（2017）07-0640-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.07.015

貴陽市科技計劃（2014100145）

夏劍鋒（1989-），男，碩士研究生.

谷江，E-mail：gj0851@Gmail.com

2016-11-09

網(wǎng)絡(luò)出版時間：