趙曉婷，孫潔，劉爽，白陽，王星，初瑞，王翠芳

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院研究生院，沈陽110034；2.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科，沈陽110024；3.遼寧省新民市人民醫(yī)院病理科，沈陽110300）

三陰乳腺癌中CXCR1和CXCR2的表達(dá)及臨床意義

趙曉婷1，孫潔2，劉爽3，白陽2，王星2，初瑞1，王翠芳2

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院研究生院，沈陽110034；2.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科，沈陽110024；3.遼寧省新民市人民醫(yī)院病理科，沈陽110300）

目的探討CXCR1和CXCR2蛋白在三陰乳腺癌（TNBC）組織中的表達(dá)及意義。方法收集乳腺癌（BC）癌旁正常組織28例，乳腺非特殊型浸潤性導(dǎo)管癌（IDC-NOS）30例，TNBC組織34例，應(yīng)用免疫組化EnVision法檢測CXCR1和CXCR2蛋白的表達(dá)，并分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系，以及CXCR1和CXCR2蛋白與TNBC的相關(guān)性。結(jié)果在TNBC中，CXCR1和CXCR2蛋白表達(dá)的陽性率（23.5%，35.3%）明顯低于IDC-NOS（63.3%，60.0%）和BC癌旁正常組織（89.3%，92.9%）。在TNBC中，CXCR1和CXCR2蛋白的表達(dá)與臨床病理特征（年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、組織學(xué)分級）無相關(guān)性（P＞0.05）。CXCR1和CXCR2蛋白的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（r=0.606，P＜0.01）。結(jié)論CXCR1和CXCR2蛋白在BC癌旁正常組織、IDC-NOS和TNBC中均有表達(dá)，呈強(qiáng)陽性、中度陽性、陰性遞減，且二者在TNBC中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。CXCR1和CXCR2蛋白的表達(dá)與TNBC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

三陰乳腺癌；CXCR1；CXCR2；免疫組織化學(xué)

乳腺癌（breast cancer，BC）屬于組織高度異質(zhì)性腫瘤［1］，是女性最常見的惡性腫瘤，占女性惡性腫瘤的第一位。在全球范圍內(nèi)，乳腺癌死亡率占女性全部惡性腫瘤的14%［2］。發(fā)病年齡高峰在45～55歲［3］。BC按照分子免疫表型分為5種亞型［4］，其中，三陰乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是一種殊的亞型，具有很強(qiáng)的異質(zhì)性，病因尚不完全清楚，遺傳和機(jī)體免疫等多種內(nèi)源性因素均可促進(jìn)其發(fā)生、發(fā)展［5］。因此，明確其發(fā)生機(jī)制，尋找有效的靶向治療方法是延長患者生存期的關(guān)鍵。近年來，研究發(fā)現(xiàn)趨化因子受體CXCR1和CXCR2與包括BC在內(nèi)的腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究擬應(yīng)用免疫組化EnVision法檢測CXCR1和CXCR2蛋白在TNBC中的表達(dá)，并探討其與TNBC臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院2010年1月至2011年12月女性浸潤性BC標(biāo)本92例，其中，TNBC 34例，乳腺非特殊型浸潤性導(dǎo)管癌（invasive ductal carcinoma-not otherwise specified，IDC-NOS）30例，BC癌旁正常組織標(biāo)本28例（對照組）。TNBC和IDCNOS患者年齡29～87歲，平均（55.4±13.2）歲，64例標(biāo)本中，＜55歲33例，≥55歲31例；腫瘤最大徑≤2 cm 22例，＞2 cm 42例；有轉(zhuǎn)移25例，無轉(zhuǎn)移39例；組織學(xué)分級Ⅰ和Ⅱ級42例，Ⅲ級22例。所有病例的診斷均經(jīng)HE染色和免疫組化確認(rèn)。

1.2 主要試劑

兔抗人CXCR1多克隆抗體濃縮型（BA0755-1）購自武漢博士德生物公司，兔抗鼠/兔/人CXCR2多克隆抗體濃縮型（ab14935）購自美國Abcam公司，二抗試劑盒DAB染色液（聚合物法）、PBS磷酸鹽緩沖液（粉劑）（產(chǎn)品編號：PBS-0060/0061）、粉劑型抗原修復(fù)液（檸檬酸法）（產(chǎn)品編號：MVS-0066）均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。DAB顯色劑購自上?；蚩萍加邢薰尽?/p>

1.3 方法

1.3.1 免疫組化（EnVision法）：標(biāo)本石蠟切片脫蠟水化，檸檬酸抗原高壓修復(fù)（pH6.0）25 min，室溫冷卻30 min，PBS溶液沖洗3 min×3次，將抗原修復(fù)后的切片用自來水沖洗1 min，用油性筆圈定玻片上的待測組織區(qū)域，PBS溶液沖洗3 min×3次。除去PBS溶液，在油性筆圈定的區(qū)域內(nèi)滴加阻斷內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，在室溫下保濕盒孵育10 min，PBS溶液沖洗3 min×3次。滴加CXCR1與CXCR2一抗（1∶50稀釋），4℃過夜。PBS沖洗，滴加酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫下保濕盒內(nèi)孵育20 min（CXCR1蛋白）和15 min（CXCR2蛋白），PBS溶液沖洗3 min× 3次。室溫下，DAB顯色3～5 min，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。分別用人肺癌和胰腺癌組織切片作為CXCR1和CXCR2陽性對照。

1.3.2 免疫組化結(jié)果判定：由2位獨(dú)立的病理醫(yī)生盲法進(jìn)行免疫組織化學(xué)半定量評分。CXCR1和CXCR2蛋白染色評分參考FROMOWITZ等［6］的方法進(jìn)行，2種蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，極少數(shù)也在細(xì)胞核表達(dá)。所有染色結(jié)果均采用統(tǒng)一評分標(biāo)準(zhǔn)，所有評分均重復(fù)2次以上，每張切片隨機(jī)取5個100倍視野，進(jìn)行陽性細(xì)胞百分比計分與著色強(qiáng)度計分。無著色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分，兩者相加之和＜2分為（-），2～3分為（+），4～5分為（++），6～7分為（+++）。為了統(tǒng)計學(xué)方便，本研究將顯色（-）～（+）定義為陰性，（++）～（+++）為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)和關(guān)聯(lián)性分析或Fisher’s確切概率法進(jìn)行數(shù)據(jù)的比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCR1和CXCR2蛋白在不同組織中的表達(dá)

CXCR1和CXCR2蛋白在BC癌旁正常組織、IDC-NOS和TNBC中表達(dá)程度不同。二者主要細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，少數(shù)在細(xì)胞核表達(dá)（圖1）。如表1所示，CXCR1和CXCR2蛋白在BC癌旁正常組織中均呈高表達(dá)，IDC-NOS中呈中度表達(dá)，TNBC中呈低表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

2.2 TNBC中CXCR1和CXCR2表達(dá)的相關(guān)性

34例TNBC中，CXCR1陽性8例（23.5%），陰性26例（76.5%），CXCR2陽性12例（35.3%），陰性22例（64.7%），CXCR1和CXCR2蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.606，P＜0.001）。

2.3 CXCR1和CXCR2蛋白與TNBC臨床病理特征的關(guān)系

如表2所示，CXCR1和CXCR2蛋白的表達(dá)與TNBC患者的年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、組織學(xué)分級均無相關(guān)性（P＞0.05）。

3 討論

TNBC具有侵襲性高、惡性程度高、易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)和生存率低等特點(diǎn)，治療有一定的難度。目前，化療是TNBC主要的治療手段，內(nèi)分泌治療和和抗HER2靶向治療基本無效。

圖1 CXCR1、CXCR2在乳腺癌癌旁正常乳腺組織、乳腺非特殊型浸潤性導(dǎo)管癌、三陰乳腺癌組織中的表達(dá)IHC×10Fig.1 Exp ression o f CXCR1 and CXCR2 in adjacent norm al tissues o f breast cancer，invasive ducta l carcinoma（NOS）and triple-negative breast cancer IHC×10

表1 CXCR1和CXCR2蛋白在乳腺癌癌旁正常組織、乳腺非特殊型浸潤性導(dǎo)管癌和三陰乳腺癌中的表達(dá)［n（%）］Tab.1 CXCR1 and CXCR2 p rotein expression in ad jacent norm al tissue，invasive ducta l carcinom a（NOS）and triple-negative breast cancer［n（%）］

表2 CXCR1和CXCR2蛋白表達(dá)與TNBC臨床病理特征的關(guān)系（n）Tab.2 Association of CXCR1 and CXCR2 expression w ith clinicopathological features of trip le-negative breast cancer（n）

近年來，趨化因子受體在在腫瘤中的作用日益引起研究者們的重視，目前已經(jīng)鑒定的趨化因子受體至少有20種［7］。CXCR1和CXCR2屬于趨化因子CXCR家族中的2個重要成員。CXCR1和CXCR2基因定位于2q35，CXCR1包含2個外顯子和1個內(nèi)含子，長4 149 bp。CXCR2包含3個外顯子和2個內(nèi)含子，長11 964 bp。CXCR1和CXCR2屬于G蛋白耦聯(lián)的7次跨膜受體，主要在特定炎癥細(xì)胞表面表達(dá)，如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞等，可與CXCR家族其他成員結(jié)合，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。主要功能是通過G蛋白變構(gòu)激活下游的效應(yīng)分子并進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生遷移、脫顆粒等一系列生物學(xué)效應(yīng)，在調(diào)節(jié)局部炎癥反應(yīng)、細(xì)胞發(fā)育、新生血管生成和對組織細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的趨化等方面發(fā)揮重要功能。目前發(fā)現(xiàn)，受體CXCR1和CXCR2可存在于某些癌細(xì)胞及新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中，白細(xì)胞介素8與該受體結(jié)合后能促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管生長，還能調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子分化。

研究［8］表明，CXCR1在胃癌、子宮內(nèi)膜癌、黑色素瘤和結(jié)腸癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞中均呈過度表達(dá)，胃癌、前列腺癌和部分乳腺癌等實(shí)體腫瘤中也可見CXCR2表達(dá)［9］。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測了CXCR1和CXCR2蛋白在BC癌旁正常組織、IDC-NOS和TNBC中的表達(dá)。結(jié)果顯示，CXCR1和CXCR2蛋白在3組標(biāo)本中均有不同程度的表達(dá)，二者在癌旁正常組織中均呈高表達(dá)，IDC-NOS中呈中度表達(dá)，TNBC中呈低表達(dá)，即在BC癌旁正常組織、IDC-NOS和TNBC中的表達(dá)呈遞減趨勢。CXCR1和CXCR2蛋白在TNBC中的表達(dá)呈正相關(guān)（r= 0.606，P＜0.001），證實(shí)了這2種受體具有很高的同源性，與文獻(xiàn)［10］中二者有76%的高度同源性的結(jié)論一致。

研究［11-12］表明，TNBC共有6種亞型，它在PI3K/ AKT/mTOR信號通路中可能存在某些關(guān)鍵因子的突變或缺失。本研究結(jié)果顯示，CXCR1和CXCR2蛋白在TNBC中呈低表達(dá)，考慮可能與TNBC的不同亞型及PI3K/AKT/mTOR信號通路關(guān)鍵因子的突變或缺失有關(guān)。盡管目前還沒有針對乳腺癌的CXCR1抑制劑，但是有文獻(xiàn)［13］報道對小鼠乳腺癌模型給予藥物阻斷CXCR1，可抑制乳腺癌癥干細(xì)胞生長。本研究還發(fā)現(xiàn)，在34例TNBC標(biāo)本中，有8例CXCR1蛋白表達(dá)陽性，12例CXCR2蛋白表達(dá)陽性，提示二者可能具有高度同源性，因此，在未來的研究中，本研究組將進(jìn)一步探討使用阻滯劑同時阻斷CXCR1和CXCR2的表達(dá)從而改善TNBC療效的可能性。

［1］陳青，孟剛，黃雯.乳腺癌中ERα、PR的表達(dá)與預(yù)后關(guān)系及其影響陽性率的相關(guān)因素［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2016，32（1）：13-18.DOI：10.13315/j.cnki.cjcep.2016.01.004.

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（編輯王又冬）

Expression and Clinical Significance of CXCR1 and CXCR2 in Triple-negative Breast Cancer

ZHAO Xiaoting1，SUN Jie2，LIU Shuang3，BAI Yang2，WANG Xing2，CHU Rui1，WANG Cuifang2

（1.Graduate School of Basic Medical Sciences，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Department of Pathology，The Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China；3.Department of Pathology，Xinmin People’s Hospital，Shenyang110300，China）

Objective To investigate the expression of CXC chemokine receptor 1（CXCR1）and CXC chemokine receptor 2（CXCR2）in triplenegative breast cancer（TNBC）and its significance.Methods The EnVision immunohistochemistry system was used to detect the expression of CXCR1 and CXCR2 in 28 specimens from normal tissues adjacent to breast cancer，30 specimens of invasive ductal carcinoma not otherwise specified（IDC-NOS），and 34 TNBC specimens.The relationship between the expression of CXCR1 and CXCR2，and clinical pathological features was analyzed.Results In the adjacent normal tissues of breast cancer，the positive expression rates of CXCR1 and CXCR2 were 89.3%and 92.9%，respectively；CXCR1 and CXCR2 expression displayed no significant association with clinicopathological parameters such as age，tumor size，or Scarff-Bloom-Richardson（SBR）score.The positive expression rates of CXCR1 and CXCR2 were 63.3%and 60.0%，respectively，in the IDCNOS samples and 23.5%and 35.3%，respectively，in the TNBC samples.There was a positive correlation between CXCR1 and CXCR2 expression in the TNBC samples（r=0.606，P＜0.001）.Conclusion Correlation of CXCR1 and CXCR2 expression with sample type was strong in adjacent normal tissues，moderate in IDC-NOS samples，and low in TNBC samples.CXCR1 expression was positively correlated with CXCR2 expression in all sample types.The expression of CXCR1 or CXCR2 was closely related to the development and promotion of TNBC.

CXCR1；CXCR2；triple-negative breast cancer；immunohistochemistry

R737.9

A

0258-4646（2017）07-0636-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.07.014

2014年沈陽市衛(wèi)生和計劃生育委員會科研課題

趙曉婷（1990-），女，碩士研究生.

王翠芳，E-mail：sywcf321@sohu.com

2016-09-13

網(wǎng)絡(luò)出版時間：