陳向華，王建吉，耿學麗，丁萌，華正祥

（1.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，河北承德067000；2.承德縣醫(yī)院骨外科，河北承德067000；3.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院輸血科，河北承德067000）

Tim-1蛋白表達及其基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者營養(yǎng)功能的相關性

陳向華1，王建吉2，耿學麗1，丁萌1，華正祥3

（1.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，河北承德067000；2.承德縣醫(yī)院骨外科，河北承德067000；3.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院輸血科，河北承德067000）

目的探討Tim-1蛋白表達及其基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者營養(yǎng)功能指標的相關性。方法收集126例SLE患者外周血樣；采用ELISA法檢測血清中人Tim-1蛋白水平；采用PCR-RFLP法檢測外周血DNA樣本Tim-1基因-416G＞C和-1454G＞A多態(tài)性；應用免疫比濁法檢測血清標本中前白蛋白、銅藍蛋白、視黃醇結合蛋白的水平；采用電化學發(fā)光法檢測血清標本中鐵蛋白、1，25-二羥維生素D3的水平。結果血清Tim-1蛋白、前白蛋白、銅藍蛋白、視黃醇結合蛋白、鐵蛋白及1，25-二羥維生素D3的濃度分別為（249.7±30.2）pg/mL、（226±42）μg/mL、（363±95）μg/mL、（29.4±13.2）μg/mL、（355±164）ng/mL、（26.4± 11.5）ng/mL；-416G＞C位點上GG基因型占11.9%，GC基因型占57.1%，CC基因型占31.0%；-1454G＞A位點上GG基因型占67.5%，GA基因型占26.2%，AA基因型占6.3%。-416G＞C位點不同基因型之間（F=0.575，P=0.564）及-1454G＞A位點不同基因型之間（F=1.255，P=0.289）Tim-1蛋白濃度均無統(tǒng)計學差異。Tim-1與前白蛋白顯著負相關（r=-0.176，P=0.033），與銅藍蛋白（r=0.205，P=0.014）和1，25-二羥維生素D3（r=0.166，P=0.042）均顯著正相關。-1454G＞A位點GG基因型患者血清中前白蛋白水平顯著降低（P=0.027），AA基因型患者血清中1，25-二羥維生素D3水平顯著降低（P=0.024）。結論血清Tim-1蛋白水平及Tim-1基因-1454G＞A位點多態(tài)性與SLE患者營養(yǎng)功能指標存在相關性。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡；Tim-1；基因多態(tài)性；營養(yǎng)功能

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種自身免疫性疾病，是以免疫性炎癥為突出表現(xiàn)的彌漫性結締組織病，可出現(xiàn)從皮疹到多器官功能衰竭等各種不同的表現(xiàn)，臨床以女性多見［1-2］。目前認為SLE的發(fā)病機制包括T細胞過度活化、B細胞激活、Th1/Th2與細胞因子失衡、細胞凋亡紊亂等，由此產生大量致病性自身抗體和免疫復合物，進而引起組織損傷［3］。許多基因遺傳多態(tài)性與SLE的易感性有關。T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein，Tim）家族位于人染色體的5q33.2上［4］，該家族第一個成員為Tim-1，也稱為人甲型肝炎病毒受體1，在Th2細胞上有高表達，可通過調節(jié)Th2細胞因子的表達來調節(jié)Th1/Th2的反應。Tim-1可以結合磷脂酞絲氨酸，促進凋亡細胞的清除［5］；此外，Tim-1還可以調節(jié)B細胞的免疫功能。近年研究［6-9］認為，Tim-1表達增高與SLE發(fā)病相關，Tim-1基因多態(tài)性與SLE發(fā)病亦相關，但尚有爭論。

本研究收集SLE患者外周血樣本，檢測血清Tim-1蛋白表達水平、Tim-1基因-416G＞C和-1454G＞A多態(tài)性以及前白蛋白血清營養(yǎng)功能指標，并分析Tim-1蛋白表達和基因多態(tài)性與血清營養(yǎng)功能指標之間的相關性，以探討Tim-1蛋白表達和基因多態(tài)性檢測對于評價SLE病情的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院2014年5月至2016年8月間確診的SLE患者化驗殘留血樣126例，每例取5 mL全血，室溫下靜置30 min，然后離心收集血清2 mL，和余下沉淀一并保存于-80℃深度冷凍冰箱備用。

1.2 ELISA檢測血清中Tim-1蛋白水平

解凍-80℃保存的血清樣本，應用Tim-1 ELISA檢測試劑盒（EHHAVCR1，美國Thermo Fisher Scientific）檢測血清中人Tim-1蛋白水平，以試劑盒說明書指導的操作步驟進行，以試劑盒提供的標準品制作質控曲線，相關系數(shù)R2為0.9985。

1.3 PCR-RFLP檢測Tim-1基因-416G＞C和-1454G＞A多態(tài)性

外周血離心后沉淀標本解凍后，取500 μL加滅菌去離子水1 mL，離心后棄上清，加5 mol/L KI溶液50 μL旋渦振蕩，然后加入0.9%NaCl溶液、氯仿/異戊醇（24∶1，V/V）溶液，漩渦振蕩后離心取上清，以預冷異丙醇析出DNA，并用冷無水乙醇清洗2～3遍；靜置干燥后，DNA溶于TE溶液。以該DNA樣本作為模板，以生工生物工程（上海）股份有限公司提供的引物、退火溫度條件進行PCR擴增（表1）。36個循環(huán)后，產物經限制性內切酶（R0149L，R0577L，美國NEB公司）酶切過夜后，于1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳。電泳后于WFH-202B型PCR紫外透射儀（上海精科實業(yè)有限公司）觀察凝膠上酶切產物DNA核酸條帶，以判斷單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點的基因型。

表1 Tim-1基因SNP位點-416G＞C和-1454G＞A的引物序列及限制性內切酶Tab.1 Prim er sequences of the-416G＞C and-1454G＞A SNP site in Tim-1 gene and the restriction enzym e

1.4 血清營養(yǎng)功能指標的檢測

采用全自動蛋白分析儀（BNⅡ，德國西門子）及其配套試劑盒，應用免疫比濁法檢測血清標本中前白蛋白、銅藍蛋白、視黃醇結合蛋白的水平；采用全自動免疫分析儀（e601，瑞士羅氏）及其配套試劑盒，應用電化學發(fā)光法檢測血清標本中鐵蛋白、1，25-二羥維生素D3的水平。

1.5 統(tǒng)計學分析

數(shù)據分析采用SPSS 16.0軟件包進行。ELISA法檢測結果以及血清營養(yǎng)功能指標水平等計量資料以x±s表示，計量資料的組間比較采用單因素方差分析；不同計量資料之間的相關性分析采用Pearson相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SLE患者血清Tim-1蛋白水平

ELISA法檢測126例SLE患者血清中Tim-1蛋白水平，結果顯示，Tim-1蛋白濃度為（249.7±30.2） pg/mL（188.5～310.4 pg/mL）。

2.2 SLE患者Tim-1基因多態(tài)性

PCR-RFLP法檢測126例SLE患者Tim-1基因-416G＞C和-1454G＞A多態(tài)性（圖1），結果發(fā)現(xiàn)-416G＞C位點上GG基因型15例（11.9%），GC基因型72例（57.1%），CC基因型39例（31.0%）；-1454G＞A位點上GG基因型85例（67.5%），GA基因型33例（26.2%），AA基因型8例（6.3%）。

分析2個SNP位點上不同基因型患者的血清Tim-1蛋白濃度的差異（圖2），結果發(fā)現(xiàn)對于-416G＞C位點，不同基因型之間Tim-1蛋白濃度無統(tǒng)計學差異（F=0.575，P=0.564），對于-1454G＞A位點，不同基因型之間Tim-1蛋白濃度也無統(tǒng)計學差異（F= 1.255，P=0.289）。

圖1 PCR-RFLP法檢測Tim-1基因-416G＞C和-1454G＞A多態(tài)性Fig.1 The-416G＞C and-1454G＞A polymorphisms in the Tim-1 gene detected by PCR-RFLP

圖2 SLE患者Tim-1基因-416G＞C和-1454G＞A多態(tài)性與血清Tim-1蛋白水平的關系Fig.2 The relationship between-416G＞C，-1454G＞A po lymorphism s in the Tim-1 gene and serum Tim-1 p rotein leve ls

2.3 SLE患者血清營養(yǎng)功能指標水平

采用免疫比濁法檢測126例SLE患者血清標本中前白蛋白、銅藍蛋白、視黃醇結合蛋白的水平，三者濃度分別為（226±42）μg/mL（174～308 μg/mL）、（363±95）μg/mL（227～721 μg/mL）、（29.4±13.2）μg/mL（14.8～47.2 μg/mL）。采用電化學發(fā)光法檢測126例SLE患者血清標本中鐵蛋白和1，25-二羥維生素D3的水平，二者濃度分別為（355±164）ng/mL（148～592ng/mL）和（26.4±11.5）ng/mL（9.9～55.7ng/mL）。

2.4 SLE患者Tim-1蛋白水平及其基因多態(tài)性與營養(yǎng)功能指標水平的相關性

分析Tim-1蛋白水平與營養(yǎng)功能指標之間的相關性，結果發(fā)現(xiàn)Tim-1與前白蛋白負相關（r=-0.176，P= 0.033），與銅藍蛋白（r=0.205，P=0.014）和1，25-二羥維生素D3（r=0.166，P=0.042）均正相關。

比較Tim-1基因-416G＞C和-1454G＞A位點不同基因型患者各營養(yǎng)功能指標水平的差異（表2），結果發(fā)現(xiàn)-1454G＞A位點GG基因型患者血清中前白蛋白水平顯著降低（P=0.027），AA基因型患者血清中1，25-二羥維生素D3水平顯著降低（P=0.024）。其余基因型對營養(yǎng)功能指標水平無顯著影響。

表2 SLE患者Tim-1基因-416G＞C、-1454G＞A多態(tài)性對營養(yǎng)功能指標血清水平的影響Tab.2 The correlation of the-416G＞C，-1454G＞A polymorphism in the Tim-1 gene and nutrition function indicators in patients w ith SLE

3 討論

人Tim-1基因的染色體定位與包括SLE在內的多種自身免疫性疾病的相關染色體區(qū)域重疊［10-11］，并且Tim-1蛋白表達增高已被證實在SLE的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用［12］。Tim-1基因多態(tài)性對于自身免疫性疾病的意義近年來時有報道，如MAZROUEI等［13］發(fā)現(xiàn)Tim-1基因5383-5397插入/缺失多態(tài)性與多發(fā)性硬化癥相關，CHAE等［14］發(fā)現(xiàn)Tim-1基因-1637A＞G多態(tài)性與類風濕性關節(jié)炎相關。在SLE的相關報道中，熊勤［15］、陳杰等［9］均認為Tim-1基因第4外顯子插入與缺失的基因多態(tài)性與SLE無相關性，LI等［7］研究發(fā)現(xiàn)Tim-1基因rs1501909和rs12522248多態(tài)性與SLE無關，而彭傳梅等［16］認為-1454G＞A位點多態(tài)性變異與我國云南人群SLE遺傳易感性相關，而-416G＞C則不相關。CHAE等［14］在類風濕性關節(jié)炎患者中也檢測了Tim-1基因-416G＞C和-1454G＞A兩位點的多態(tài)性，結果未卻發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性與類風濕性關節(jié)炎的相關性。

鑒于已有的報道，本研究選取Tim-1基因-416G＞C和-1454G＞A兩位點的多態(tài)性，考察其與Tim-1蛋白表達、SLE患者營養(yǎng)功能指標血清水平的相關性。結果發(fā)現(xiàn)-416G＞C和-1454G＞A兩位點不同基因型之間，Tim-1蛋白濃度均無顯著差異，這與熊勤［15］、陳杰等［9］的報道一致。本研究首次分析了Tim-1蛋白及基因多態(tài)性與SLE患者血清前白蛋白、銅藍蛋白、視黃醇結合蛋白、鐵蛋白、1，25-二羥維生素D3等營養(yǎng)功能指標的相關性，結果發(fā)現(xiàn)，Tim-1蛋白與前白蛋白顯著負相關，與銅藍蛋白和1，25-二羥維生素D3均顯著正相關，-1454G＞A位點GG基因型患者血清中前白蛋白水平顯著降低，AA基因型患者血清中1，25-二羥維生素D3水平顯著降低，而-416G＞C位點多態(tài)性對各營養(yǎng)功能指標水平無顯著影響。本研究結果提示，血清Tim-1蛋白水平及Tim-1基因-1454G＞A位點多態(tài)性與SLE患者營養(yǎng)功能指標存在相關性，在SLE診斷、治療以及預后評判中具有一定的指導意義。

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（編輯陳姜）

Association of Tim-1 Protein Expression and Gene Polymorphism with Nutritional Function in Patients with System ic Lupus Erythematosus

CHEN Xianghua1，WANG Jianji2，GENG Xueli1，DING Meng1，HUA Zhengxiang3

（1.Clinical Laboratory，Affiliated Hospital of Chengde Medical University，Chengde 067000，China；2.Orthopedic Surgery，Chengde County Hospital，Chengde 067000，China；3.Blood Transfusion Department，Affiliated Hospital of Chengde Medical University，Chengde 067000，China）

Objective To investigate the association of Tim-1 protein expression and its gene polymorphism with nutritional parameters in patients with systemic lupus erythematosus（SLE）.Methods Peripheral blood samples were collected from 126 patients with SLE.Serum Tim-1 protein levels were detected by ELISA，and the Tim-1 gene-416G＞C，-1454G＞A polymorphism was detected by PCR-RFLP.Prealbumin，ceruloplasmin，and retinol conjugated protein levels were determined by immunoturbidimetry.Ferritin and 1，25-dihydroxy vitamin D3levels were detected by electrochemiluminescence.Results Concentrations of serum Tim-1 protein，prealbumin，ceruloplasmin，retinol binding protein，ferritin，and 1，25-dihydroxyvitamin D3were249.7±30.2 pg/mL，226±42μg/mL，363±95μg/mL，29.4±13.2μg/mL，355±164ng/mL，and 26.4±11.5ng/mL，respectively.In the-416G＞C site，GG，GC，and CC genotypes accounted for 11.9%，57.1%，and 31.0%，respectively.In the-1454G＞A site，GG，GA，and AA genotypes accounted for 67.5%，26.2%，and 6.3%，respectively.The Tim-1 protein concentration did not differ significantly between the different genotypes of the-416G＞C site（F=0.575，P=0.564）or-1454G＞A site（F=1.255，P=0.289）.Tim-1 level was significantly negatively correlated with prealbumin（r=-0.176，P=0.033），and positively correlated with ceruloplasmin（r=0.205，P=0.014）and 1，25-dihydroxy vitamin D3（r=0.166，P=0.042）.The serum prealbumin level decreased significantly（P=0.027）in patients harboring the GG genotype in the-1454G＞A site，whereas the serum 1，25-dihydroxy vitamin D3level decreased significantly（P=0.024）in patients with the AA genotypein the-1454G＞A site.Conclusion Serum Tim-1 protein level and the-1454G＞A polymorphism of Tim-1 gene are associated with the nutritional function of patients with SLE.

systemic lupus erythematosus；Tim-1；gene polymorphism；nutritional function

R593.241

A

0258-4646（2017）07-0623-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.07.011

承德市科學技術研究與發(fā)展計劃（201601A031）

陳向華（1979-），男，主管技師，本科.

華正祥，E-mail：493741175@qq.com

2017-04-08

網絡出版時間：