梁晨晨，王立，羅秋玲，吳靜

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一種增加畢赤酵母生產(chǎn)胰島素前體的方法

梁晨晨1,2，王立1,2，羅秋玲2，吳靜1

1 江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122 2 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122

梁晨晨,王立, 羅秋玲, 等. 一種增加畢赤酵母生產(chǎn)胰島素前體的方法. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(7): 1178–1189.Liang CC, Wang L, Luo QL, et al. A method to increase the production of insulin precursor in Pichia pastoris. Chin J Biotech, 2017, 33(7): 1178–1189.

為了提高胰島素前體 (PI) 的產(chǎn)量，構(gòu)建了pPIC9K-PI表達(dá)載體并電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母菌株GS115中，在濃度為4.0 mg/mL的G418抗性平板上篩選到了1株拷貝數(shù)為12的菌株CL012。將SNAREs (可溶性N-乙基馬來(lái)酰亞胺敏感因子受體蛋白) 組分中的SNC2和SNC2-SSO2分別轉(zhuǎn)入菌株CL012中，并在搖瓶和5 L發(fā)酵罐水平上檢測(cè)SNAREs對(duì)PI產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明：搖瓶水平上，甲醇誘導(dǎo)96 h后，菌株CL012的PI產(chǎn)量為1.53 mg/L；表達(dá)SNC2和SNC2-SSO2的菌株的PI產(chǎn)量分別為1.89 mg/L和2.21 mg/L，分別比菌株CL012提高了23.53%和44.44%。在5 L發(fā)酵罐上進(jìn)行高密度發(fā)酵，甲醇誘導(dǎo)96 h后菌株CL012的PI產(chǎn)量為53 mg/L，是搖瓶水平的34.64倍；表達(dá)SNC2和SNC2-SSO2的菌株的PI產(chǎn)量分別達(dá)到64 mg/L和78 mg/L，分別比菌株CL012提高了20.75%和47.17%。由此得出結(jié)論SNAREs可以促進(jìn)胰島素前體的分泌，從而提高在畢赤酵母中的異源表達(dá)。

畢赤酵母，胰島素前體，SNAREs，異源表達(dá)

作為重要蛋白表達(dá)宿主，畢赤酵母廣泛應(yīng)用于不同來(lái)源 (人、動(dòng)物、植物、真菌和病毒) 和不同類(lèi)型(分泌型和非分泌型) 重組蛋白的高效生產(chǎn)[1-2]。但是，并不是所有的重組蛋白都能有效地分泌，這是因?yàn)橹亟M蛋白的高水平表達(dá)面臨著基因劑量[3]、mRNA的轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的加工折疊[4]以及在胞質(zhì)中的運(yùn)輸?shù)戎T多制約其產(chǎn)量的關(guān)鍵瓶頸。其中，重組蛋白的分泌運(yùn)輸是制約其高效生產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一。重組蛋白在畢赤酵母中的分泌過(guò)程主要包括新生蛋白從核糖體上合成后到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的運(yùn)輸、蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的折疊、蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的運(yùn)輸[5]以及蛋白從高爾基體到質(zhì)膜的運(yùn)輸。分泌路徑中的每一步都可能成為蛋白分泌的限速步驟，從而影響目標(biāo)蛋白的有效分泌。其中新生蛋白到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的運(yùn)輸分為兩種：共翻譯運(yùn)輸[6]和翻譯后運(yùn)輸[7]；運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)的新生肽鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中折疊蛋白的作用下進(jìn)行折疊加工[8]；緊接著蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸?shù)礁郀柣w進(jìn)行進(jìn)一步加工，加工成熟的蛋白質(zhì)離開(kāi)高爾基體運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)膜。蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體以及高爾基體到細(xì)胞質(zhì)膜的運(yùn)輸需要運(yùn)輸囊泡的作用[9-11]。運(yùn)輸囊泡和靶膜之間的相互作用需要SNAREs的作用，SNAREs (可溶性N-乙基馬來(lái)酰亞胺敏感因子附著型蛋白受體)是一種Ⅱ型膜蛋白，在運(yùn)輸囊泡和靶膜的膜融合過(guò)程中促使膜融合[12]，促進(jìn)蛋白的運(yùn)輸。

SNAREs分為兩種：一種存在于靶膜上，被稱(chēng)為v-SNAREs；另一種存在于運(yùn)輸囊泡上，被稱(chēng)為t-SNAREs。v-SNAREs和特定靶膜上的t-SNAREs相互作用形成復(fù)合體SNAREs，稱(chēng)為SNAREpin[13]。SNAREpin由3種成分組成：Sso1/2、Sec9和Snc1/2。其中SNAREs復(fù)合體由Snc1/2和Sso1/2的各一個(gè)α螺旋區(qū)域和Sec9的兩個(gè)螺旋區(qū)域組成。SNAREs已經(jīng)被確定存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、高爾基體膜、液泡/溶酶體、質(zhì)膜以及從這些膜衍生出的運(yùn)輸囊泡的膜上[14]。在促進(jìn)蛋白運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中，SNAREs在不同的囊泡和質(zhì)膜之間的膜融合運(yùn)輸中扮演著重要的角色。van Zyl等[15]通過(guò)過(guò)表達(dá)釀酒酵母中SNC1將來(lái)自埃默森籃狀菌的纖維二糖水解酶的產(chǎn)量提高71%，過(guò)表達(dá)SSO1將來(lái)自扣裹腹膜酵母的β-葡糖苷酶的產(chǎn)量提高43.8%。Xu等[16]發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母中過(guò)表達(dá)SSO1可以將來(lái)自里氏木霉的纖維二糖水解酶的產(chǎn)量提高10%。Gasser等[17]通過(guò)在畢赤酵母中過(guò)表達(dá)SSO2將人免疫抗體Fab的產(chǎn)量提高20%。Hou等[11]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SNAREs蛋白的輔助蛋白SM蛋白中的組分SEC1可以使α-淀粉酶的產(chǎn)量提高16%。

除了優(yōu)化畢赤酵母中高爾基體到質(zhì)膜的分泌路徑，人們還常常使用以下策略用來(lái)提高畢赤酵母中異源蛋白的生產(chǎn)，如：增加拷貝數(shù)[18]、優(yōu)化密碼子[19]、使用強(qiáng)啟動(dòng)子[20]、選擇利于分泌的信號(hào)肽[21]，以及共表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中幫助新生蛋白的正確折疊的分子伴侶PDI[22]和BiP[7]等。Zhu等[23]通過(guò)將豬胰島素前體基因的拷貝數(shù)增加到12，使得豬胰島素前體的產(chǎn)量提高12.5倍，達(dá)到181 mg/L。Ben等[1]利用密碼子優(yōu)化的序列使得狂犬病毒糖蛋白的產(chǎn)量增加了2.1倍。Ben等[24]利用組成型啟動(dòng)子GAP替換AOX1啟動(dòng)子將狂犬病毒糖蛋白的產(chǎn)量增加了1.22倍。Vadhana等[25]利用自身信號(hào)肽代替α信號(hào)肽將南極假絲酵母脂肪酶B的產(chǎn)量提高了2倍。Shen等[26]在畢赤酵母中共表達(dá)PDI使得白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑 (IL1ra) 的產(chǎn)量增加了2.4倍。Damasceno等[8]在畢赤酵母中共表達(dá)BiP使A33單鏈抗體 (A33scFv) 的產(chǎn)量提高了3倍。

本研究中為了提高胰島素前體的產(chǎn)量，以胰島素前體作為模式蛋白檢測(cè)SNAREs對(duì)胰島素前體從高爾基體到細(xì)胞質(zhì)膜運(yùn)輸?shù)淖饔?。單?dú)與同時(shí)共表達(dá)來(lái)自釀酒酵母的SNAREs，增加胰島素前體的分泌。本實(shí)驗(yàn)中，首先在畢赤酵母中成功表達(dá)并分泌胰島素前體基因 (PI)，然后通過(guò)整合SNARE組分的SNC2和SSO2，提高胰島素前體的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體

pMD19-T-simple (TakaRa公司)；pPICZα載體，pPIC9K載體，大腸桿菌JM109，畢赤酵母GS115，本實(shí)驗(yàn)室保存。pPIC6α載體，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所高新老師惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑和儀器

限制性?xún)?nèi)切酶Ⅰ、Ⅰ、RⅠ、Ⅰ、Ⅱ、Ⅰ、Ⅱ、DNA marker DL10000、DNA marker DL2000，購(gòu)自大連寶生物工程公司；蛋白marker、蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒、Lyticase、引物合成、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒，購(gòu)自上海生工生物工程公司；博萊霉素 (Zeocin)、遺傳霉素 (G418)、殺稻瘟菌素(Blasticidin)，購(gòu)自Invitrogen公司；酵母基因組試劑盒，購(gòu)自天根公司；iUniversal SYBR Green Supermix，購(gòu)自Bio-rad 公司；PCR、QPCR擴(kuò)增儀、全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)、電穿孔儀Green Pulser、核酸電泳儀、蛋白電泳儀，購(gòu)自Bio-rad公司；Diode Array Bio Photometer U-0080D核酸濃度測(cè)定儀，購(gòu)自HITACHI公司；5 L發(fā)酵罐，購(gòu)自上海保興生物設(shè)備工程有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

低鹽LB、YPD、YPDS、MD、BMGY、BMMY、BSM基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基、PTM1微量元素液的組成與配置參見(jiàn)Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊(cè)。

1.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

將含胰島素前體基因PI的質(zhì)粒pUC57-PI經(jīng)RⅠ和Ⅰ雙酶切連接至相同雙酶切的pPIC9K質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化JM109后，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。根據(jù)伴侶蛋白SNC2、SSO2基因序列設(shè)計(jì)寡核苷酸鏈，合成引物 (表1)，通過(guò)PCR技術(shù)利用引物SNC2-F和SNC2-R、SSO2-F和SSO2-R分別以釀酒酵母的基因組為模板擴(kuò)增出SNC2和SSO2基因序列，兩端均分別含有Ⅱ和Ⅰ酶切位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物純化后將SNC2和SSO2的成熟片段與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)，涂布于含氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基平板，將長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的菌株送測(cè)序，將測(cè)序正確的菌株提取質(zhì)粒后使用Ⅱ和Ⅰ雙酶切后進(jìn)行膠回收，與使用同樣酶切的畢赤酵母表達(dá)載體pPICZα、pPIC6α相連接，構(gòu)建克隆載體 (α信號(hào)肽已除) pPICZ-SNC2、pPICZ-SSO2和pPIC6-SSO2。

1.3 重組畢赤酵母的構(gòu)建

用Ⅱ線(xiàn)性化的表達(dá)載體pPIC9K-PI電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115后，涂布到MD固體平板上，將長(zhǎng)出的單菌落接入YPD培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，提取酵母基因組，以5′AOX1和3′AOX1為引物 (表1)，PCR條件：95 ℃2 min；95 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，檢測(cè)表達(dá)載體pPIC9K-PI是否整合進(jìn)酵母基因組中。

表1 PCR引物序列列表

1.4 重復(fù)電轉(zhuǎn)化制備不同拷貝數(shù)的重組畢赤酵母

將MD平板上長(zhǎng)出并且驗(yàn)證正確的菌株作為出發(fā)菌株，進(jìn)行下一輪電轉(zhuǎn)化。以選出的出發(fā)菌制作酵母感受態(tài)細(xì)胞，利用Ⅰ線(xiàn)性化的pPIC9K-PI對(duì)其再次電轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化的菌液涂布到含不同濃度的G418的YPDS平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)2–5 d，G418的濃度梯度為1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 mg/mL，將長(zhǎng)出的菌落再次劃線(xiàn)于含相同濃度G418的YPDS 平板上，并以出發(fā)菌作對(duì)照，以5′AOX1和3′AOX1為引物，驗(yàn)證制備的不同拷貝數(shù)的重組畢赤酵母。

1.5 定量PCR確定PI基因拷貝數(shù)

質(zhì)粒的構(gòu)建：提取X-33菌株基因組，以GAP-F和GAP-R為引物 (表2) 從X-33基因組中擴(kuò)增出GAP基因片段，將擴(kuò)增出的GAP片段連接pMD19-simple-T載體，送測(cè)序，將測(cè)序正確的T載體命名為pMD19-GAP，制作內(nèi)參的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；含有PI序列的表達(dá)載體pPIC9K-PI制作目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

PI基因拷貝數(shù)的測(cè)定：待測(cè)酵母菌株接種于YPD中，30 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，收集約1×107個(gè)細(xì)胞，先用酵母細(xì)胞壁裂解酶 (Lyticase) 進(jìn)行破壁處理30 min，再按照酵母基因組提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。使用Beacon Designer 軟件設(shè)計(jì)定量PCR引物 (表2)。反應(yīng)體系：10 μL 2×SYBR Premix Ex，1 μL 10 μmol/L正向和反向引物，2 μL質(zhì)粒 (制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)) 或待測(cè)重組畢赤酵母基因組為模板，6 μL水；反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。熒光信號(hào)在每個(gè)循環(huán)延伸結(jié)束時(shí)采集，擴(kuò)增后，融解曲線(xiàn)按儀器默認(rèn)程序進(jìn)行，即65–95 ℃，0.5 ℃/s，測(cè)定待測(cè)重組畢赤酵母PI基因的拷貝數(shù)[27]。

1.6 含SNAREs畢赤酵母菌株的構(gòu)建

以Ⅰ線(xiàn)性化表達(dá)載體pPICZ-SNC2、pPICZ-SSO2 后電轉(zhuǎn)化含PI拷貝數(shù)最高的畢赤酵母，分別涂布在100 μg/mL的含博萊霉素的抗性平板，30 ℃倒置培養(yǎng)2–5 d，將長(zhǎng)出的菌落再次劃線(xiàn)于含相同濃度博萊霉素的YPDS平板上，將長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行基因組驗(yàn)證，以5′AOX1和3′AOX1為引物，驗(yàn)證含伴侶蛋白的重組畢赤酵母菌株的構(gòu)建。將基因組驗(yàn)證正確的含SNC2的重組畢赤酵母菌株制作感受態(tài)，以Ⅰ線(xiàn)性化表達(dá)載體pPIC6-SSO2后電轉(zhuǎn)化之，涂布在400 μg/mL含殺稻瘟菌素的抗性平板上。30 ℃倒置培養(yǎng)2–5 d，將長(zhǎng)出的菌落再次劃線(xiàn)于含相同濃度殺稻瘟菌素的YPDS平板上，將長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行基因組驗(yàn)證，驗(yàn)證含兩個(gè)SNAREs組成的SNC2、SSO2的重組畢赤酵母菌株的構(gòu)建。

1.7 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)

將重組菌株GS115/pPIC9K-PI和分別整合分子伴侶的SNC2、SSO2、SNC2-SSO2的GS115/pPIC9K-PI的單菌落接種于50 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基BMGY/500 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h；將上述生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的菌液以4 000 r/min離心10 min后棄掉上清液，用30 mL BMMY培養(yǎng)基重新懸浮菌體，加入100%甲醇至終濃度為1% (/)，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)，每隔24 h補(bǔ)加100%甲醇至終濃度為1% (/) 進(jìn)行誘導(dǎo)；甲醇誘導(dǎo)96 h后，12 000 r/min離心5 min，保留上清液，進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE或RP-HPLC。

1.8 重組畢赤酵母的高密度發(fā)酵

接1 mL重組畢赤酵母甘油管菌液于100 mL YPD/500 mL三角瓶中，200 r/min、30 ℃培養(yǎng)20 h；然后以10%接種量接入到2 L BSM培養(yǎng)基/5 L罐中進(jìn)行發(fā)酵，用30%的氨水維持pH 5.5，當(dāng)甘油耗盡后，溶氧陡然上升，開(kāi)始流加甘油(控制溶氧大于10%)，6 h后停止，待甘油再次耗盡并饑餓菌體2 h后，開(kāi)始流加甲醇，并通過(guò)調(diào)節(jié)其流速維持培養(yǎng)基中的甲醇濃度在 2 g/L[28]。

表2 定量PCR引物序列

胰島素前體濃度的測(cè)定：發(fā)酵液于12 000×離心10 min，保留上清液，將上清用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾后，利用液相進(jìn)行分析。使用Dionex UltiMate 3000 system，色譜柱為Vydac Grace C18 (4.6 mm×250 mm) 色譜柱，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，進(jìn)樣量20 μL，采用梯度洗脫進(jìn)行分析，流動(dòng)相A為0.1% TFA水，B為0.1% TFA乙腈，梯度為20%–35% B (0–30 min)，35%–70% B (30–35 min)，70%–20% B (35–36 min)，20%–20% B (36–46 min)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多拷貝重組畢赤酵母菌株的構(gòu)建和表達(dá)

用Ⅱ線(xiàn)性化表達(dá)載體pPIC9K-PI后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，涂布到MD平板上，將MD平板上長(zhǎng)出并且驗(yàn)證正確的菌株作為出發(fā)菌株，進(jìn)行下一輪電轉(zhuǎn)化：以選出的出發(fā)菌株制作酵母感受態(tài)細(xì)胞，利用Ⅰ線(xiàn)性化的pPIC9K-PI對(duì)其再次電轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化液涂布到含有1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 mg/mL G418的YPDS固體平板上 (圖1A)。將不同濃度G418平板上篩選出的突變株進(jìn)行基因組PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有的菌株都可以擴(kuò)增出2.2 kb (醇氧化酶基因) 和927 bp (表達(dá)載體上目的片段) 的片段 (圖1B)。GAP (3′-磷酸甘油醛脫氫酶基因) 在酵母基因組中拷貝數(shù)為1，通過(guò)計(jì)算待測(cè)重組畢赤酵母基因組中目的基因總拷貝數(shù)與GAP總拷貝數(shù)的比值，確定出目的基因的拷貝數(shù)。對(duì)pMD19-GAP和表達(dá)載體pPIC9K-PI進(jìn)行系列稀釋?zhuān)瑥亩@得目的基因PI和內(nèi)參基因GAP的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。然后將從1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 mg/mL G418平板上篩選獲得的突變菌株進(jìn)行拷貝數(shù)測(cè)定，測(cè)定的拷貝數(shù)分別為2、3、6、7、12，將對(duì)應(yīng)的菌株分別命名為CL002、CL003、CL006、CL007和CL012 (表3)。進(jìn)一步將5株菌株分別進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，胞外上清進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE分析 (圖2)，結(jié)果表明在6.7 kDa處有一明顯條帶，其中菌株CL012的條帶最為明顯。

圖1 多拷貝重組畢赤酵母的構(gòu)建

2.2 含SNAREs重組畢赤酵母菌株的構(gòu)建

將Ⅰ線(xiàn)性化的表達(dá)載體pPICZ-SSO2、pPICZ-SNC2電轉(zhuǎn)化畢赤酵母CL012，涂布在100 μg/mL的含博萊霉素的抗性平板上，將長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行基因組驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的菌株分別命名為CL0121和CL0122。以Ⅰ線(xiàn)性化表達(dá)載體pPIC6-SSO2后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母CL0122，涂布在400 μg/mL的含殺稻瘟菌素的抗性平板上，將長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行基因組驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的菌株命名為CL0123。表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程如圖3A所示。以5′AOX1和3′AOX1為引物進(jìn)行基因組驗(yàn)證 (圖3B)，結(jié)果表明：菌株CL0121、CL0122和CL0123中都含有大小為2.2 kb (醇氧化酶基因) 和927 bp (表達(dá)載體pPIC9K-PI上的目的片段) 的片段，由于畢赤酵母表達(dá)載體pPICZα/pPIC6α自身可以擴(kuò)增出588 bp (醇氧化酶基因) 大小的片段，而pPICZα/pPIC6α中信號(hào)肽的大小為266 bp且已經(jīng)被切除，所以pPICZα/pPIC6α應(yīng)該擴(kuò)增出322 bp大小的片段，由于SNC2片段大小為348 bp，SSO2的大小為888 bp，所以表達(dá)載體pPICZ-SNC2、pPICZ-SSO2和pPIC6-SSO2擴(kuò)增出的大小分別為670 bp、1 210 bp和1 210 bp的片段。

表3 不同濃度G418平板上篩選出的菌株P(guān)I基因拷貝數(shù)的測(cè)定

圖2 不同拷貝數(shù)重組蛋白PI表達(dá)上清的Tricine-SDS-PAGE分析

2.3 搖瓶水平檢測(cè)SNAREs對(duì)PI表達(dá)的影響

將菌株CL012、CL0121、CL0122和CL0123經(jīng)甲醇誘導(dǎo)96 h后，保留上清液，進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE (圖4A) 和RP-HPLC。其中CL012菌株作為對(duì)照菌株，發(fā)現(xiàn)對(duì)照菌株CL012的產(chǎn)量為1.53 mg/L，菌株CL0121、CL0122和CL0123的產(chǎn)量分別為1.58 mg/L、1.89 mg/L和2.21 mg/L，比對(duì)照菌株CL012提高了3.27%、23.53%和44.44% (圖4B)。菌株CL012的生產(chǎn)能力為0.015 mg/(L·h)，CL0121、CL0122和CL0123的生產(chǎn)能力分別為0.016 mg/(L·h)、0.019 mg/(L·h) 和0.023 mg/(L·h)(圖4C)，比對(duì)照菌株CL012提高了6.67%、26.67%和53.33%。

圖3 含SNAREs的重組畢赤酵母的構(gòu)建

2.4 高密度發(fā)酵水平檢測(cè)SNAREs對(duì)PI表達(dá)的影響

選取重組畢赤酵母CL012、CL0121、CL0122和CL0123在5 L發(fā)酵罐上以甘油為碳源進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵，20 h甘油耗盡，繼續(xù)流加甘油6 h，待溶氧陡然升高后再饑餓菌體2 h，然后流加甲醇開(kāi)始誘導(dǎo)培養(yǎng)，并維持培養(yǎng)液中甲醇濃度為2 g/L，共誘導(dǎo)96 h。發(fā)酵液上清進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE分析 (圖5)，高密度發(fā)酵數(shù)據(jù)如圖6所示，相關(guān)發(fā)酵參數(shù)計(jì)算并總結(jié)于表4。其中CL012是對(duì)照菌株，結(jié)果表明：在 5 L發(fā)酵罐上進(jìn)行高密度發(fā)酵，甲醇誘導(dǎo)96 h后菌株CL012的600達(dá)到567，甲醇誘導(dǎo)96 h后菌株CL0121、CL0122和CL0123的600分別為502、460和470，比菌株CL012分別降低了12.95%、23.26%和20.64% (圖6A)。對(duì)照菌株CL012的產(chǎn)量為53 mg/L，菌株CL0121、CL0122和CL0123的產(chǎn)量分別為54 mg/L、64 mg/L和 78 mg/L (圖6B)，比對(duì)照菌株CL012提高了1.89%、20.75%和47.17%。5 L發(fā)酵罐上進(jìn)行高密度發(fā)酵，CL012的600達(dá)到567，產(chǎn)量為 53 mg/L，是搖瓶水平的34.64倍。CL0121、CL0122和CL0123的罐上產(chǎn)量分別是搖瓶水平的34.18倍、33.86倍和35.29倍。高密度發(fā)酵可以大幅度提升菌體的密度，增加胰島素前體的產(chǎn)量。5 L發(fā)酵罐的發(fā)酵周期是124 h，對(duì)照菌株CL012單位時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)胰島素前體的生產(chǎn)能力為0.43 mg/(L·h)，菌株CL0121的生產(chǎn)能力也是0.43 mg/(L·h)，CL0122和CL0123的生產(chǎn)能力分別為0.52 mg/(L·h)和0.63 mg/(L·h)，比對(duì)照菌株CL012提高了20.93%和46.51%。

圖4 搖瓶水平檢測(cè)SNAREs對(duì)PI表達(dá)的影響

圖5 Tricine-SDS-PAGE分析發(fā)酵罐水平上SNAREs對(duì)PI的影響

圖6 高密度發(fā)酵檢測(cè)SNAREs對(duì)胰島素前體產(chǎn)量的影響

表4 甲醇誘導(dǎo)階段重組畢赤酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和PI的合成情況

3 討論

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)是一種成熟的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，由于分泌路徑的瓶頸導(dǎo)致很多外源蛋白留在胞內(nèi)，不能有效地運(yùn)輸?shù)桨鈁9]。本文通過(guò)共表達(dá)SNAREs中的組分SNC2和SSO2希望可以增加目的蛋白從高爾基體到細(xì)胞質(zhì)膜的運(yùn)輸，增加目的蛋白的分泌。本文以胰島素前體 (PI) 作為模式蛋白，研究SNAREs在畢赤酵母中促進(jìn)異源蛋白從高爾基體到細(xì)胞質(zhì)膜的運(yùn)輸作用。SNAREs通過(guò)和其輔助蛋白SM相互作用，SM蛋白結(jié)合到t-SNARE的突觸區(qū)域，促進(jìn)t-SNARE和運(yùn)輸囊泡上的v-SNARE結(jié)合，t-SNARE和v-SNARE結(jié)合后就會(huì)引起構(gòu)型改變，在靶膜上形成融合孔，促進(jìn)目的蛋白的釋放[13]。在5 L發(fā)酵罐上單獨(dú)表達(dá)SNC2可以使PI的產(chǎn)量提高20.75%，同時(shí)PI的生產(chǎn)能力也增加了20.93%，說(shuō)明表達(dá)SNC2可以促進(jìn)胰島素前體更多釋放，也和SNC2本身可以促進(jìn)目的蛋白從高爾基體到細(xì)胞質(zhì)膜的運(yùn)輸作用相一致。單獨(dú)表達(dá)SSO2對(duì)PI的產(chǎn)量沒(méi)有影響，不能促進(jìn)更多的胰島素前體從高爾基體到細(xì)胞質(zhì)膜的運(yùn)輸。但是同時(shí)共表達(dá)SNC2和SSO2可以進(jìn)一步提高胰島素前體的產(chǎn)量，使PI的產(chǎn)量提高47.17%，對(duì)PI的生產(chǎn)能力提高46.51%。SNC2屬于v-SNARE，SSO2屬于t-SNARE，說(shuō)明SNC2和SSO2在促進(jìn)PI于畢赤酵母中的運(yùn)輸過(guò)程中具有協(xié)同作用，將兩者共表達(dá)時(shí)可以進(jìn)一步促進(jìn)胰島素前體的運(yùn)輸，提高胰島素前體的產(chǎn)量。蛋白伴侶之間經(jīng)常存在著這種協(xié)同作用，如陳飛等[22]利用PDI和Ero1之間的協(xié)同作用將灰蓋鬼傘過(guò)氧化物酶的酶活提高2.62倍。Shusta等[29]利用PDI和BIP之間的協(xié)同作用將單鏈抗體片段的產(chǎn)量提高了8倍。

本文通過(guò)共表達(dá)促進(jìn)高爾基體到細(xì)胞質(zhì)膜的SNAREs組分，提高了畢赤酵母分泌異源蛋白的能力，尋找到了一種可以提高異源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)的方法，為促進(jìn)其他外源蛋白在畢赤酵母中的分泌提供了新的方法和思路，同時(shí)也找到了一種可以提高胰島素前體產(chǎn)量的新方法。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

A method to increase the production of insulin precursor in

Chenchen Liang1,2, Li Wang1,2, Qiuling Luo2, and Jing Wu1

1 College of Pharmacy, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122,Jiangsu,China

To improve the yield of insulin precursor (PI), we constructed a recombinant expression vector pPIC9K-PI and transformed it intoGS115 using electroporation. After screening, a mutant strain CL012 with 12 copies was obtained on the YPDS plate containing 4.0 mg/mL G418. Then, the components of SNAREs (Soluble-ethylmaleimide-sensitive factor attachment receptor proteins), SNC2 and SNC2-SSO2, were expressed in the strain CL012 to explore the effect of SNAREs on the yield of PI. In shake flask culture, the strains expressing SNC2 and SNC2-SSO2 yielded PI of 1.89 mg/L and 2.21 mg/L after methanol induction for 96 h, which were improved by 23.53% and 44.44% compared to that of strain CL012 (1.53 mg/L), respectively. Further, in a 5-L bioreactor, the yield of PI with strain CL012 was 53 mg/L for high-density fermentation, after 96 h of methanol induction, which was 34.64-fold higher than that of shake culture. The strains expressing SNC2 and SNC2-SSO2 yielded the PI of 64 mg/L and 78 mg/L, which were respectively increased by 20.75% and 47.17%, compared to that of strain CL012. This work indicated that SNAREs components promoted the secretion of PI to improve its heterologous expression in.

, insulin precursor, SNAREs, heterologous expression

January 11, 2017; Accepted:March 24, 2017

Jing Wu. Tel: +86-510-85197873; E-mail: wujing@jiangnan.edu.cn

Supported by:Key Technologies R&D Program of Jiangsu Province (No. BE2014652), National Natural Science Foundation of China (No. 21576117), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Nos. BE2015307, BK20131103).

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