倪艷穎，張繁霜，安滿霞，高友鶴

?

細菌性腦膜炎大鼠模型的尿液蛋白質(zhì)組學(xué)變化

倪艷穎1，張繁霜1，安滿霞1，高友鶴2

1 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院病理生理學(xué)系，北京 100005 2 北京師范大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系北京基因工程與生物技術(shù)重點實驗室，北京 100875

倪艷穎, 張繁霜, 安滿霞, 等. 細菌性腦膜炎大鼠模型的尿液蛋白質(zhì)組學(xué)變化. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(7): 1145–1157.Ni YY, Zhang FS, An MX, et al. Changes of urinary proteins in a bacterial meningitis rat model. Chin J Biotech, 2017, 33(7): 1145–1157.

與腦脊液和血液不同，尿液不受到穩(wěn)態(tài)機制的調(diào)節(jié)，更傾向于積累和反應(yīng)機體生理和病理狀態(tài)下的變化。生物標(biāo)志物的本質(zhì)特征是變化，因此尿液是尋找疾病早期標(biāo)志物的更好來源。在世界范圍內(nèi)，細菌性腦膜炎依然是引起新生兒和兒童疾病的主要原因。為了降低死亡率和致殘率，需要用無創(chuàng)的方法尋找細菌性腦膜炎的相關(guān)線索。本研究中，使用大鼠腦室內(nèi)注射大腸桿菌模型模擬細菌性腦膜炎，在第1天和第3天的大鼠尿液中尋找尿液蛋白譜的差異變化，為進一步尋找大腸桿菌性腦膜炎的早期生物標(biāo)記物研究進行初步的探索。通過膜上酶切和膠內(nèi)酶切將尿蛋白切成肽段并通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù) (LC-MS/MS) 分析肽段信息。第1天的尿液通過膠內(nèi)酶切方法鑒定到17個差異蛋白，通過膜上酶切鑒定到20個差異蛋白；第3天的尿液通過膜上酶切方法鑒定到5個差異蛋白。這些差異蛋白為尋找細菌性腦膜炎早期生物標(biāo)志物的初步探索奠定了基礎(chǔ)。

細菌性腦膜炎，早期診斷，液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜偶聯(lián)技術(shù)，尿液蛋白質(zhì)組學(xué)，動物模型

與生理及病理生理過程相關(guān)的變化是生物標(biāo)志物最重要的特征。血液或腦脊液都受到穩(wěn)態(tài)機制的調(diào)節(jié)，趨向于將代謝變化排出，保持相對穩(wěn)態(tài)。尿液不受穩(wěn)態(tài)機制的調(diào)節(jié)，可以容納體內(nèi)代謝變化。因此，尿液是尋找疾病標(biāo)志物的良好場所[1]。

在世界范圍內(nèi)，細菌性腦膜炎依然是引起新生兒和兒童疾病的重要原因[2]。細菌性腦膜炎的死亡率非常高，在幸存者中的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥非常普遍[3-4]。在細菌性腦膜炎初期臨床癥狀，例如頭痛、頸強直、發(fā)熱、惡心和抽搐，不具有特異性[5]。細菌性腦膜炎診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是微生物培養(yǎng)，然而這種方法靈敏度低[6-7]。并且，這種方法對于沒有明顯腦膜炎癥狀的兒童而言，在早期很難被廣泛應(yīng)用。為了降低死亡率和致殘率，使用無創(chuàng)和簡單的方法尋找細菌性腦膜炎早期診斷相關(guān)線索是必不可少的。

尿液容納各種變化，因此會受到很多生理及病理因素的影響，例如性別、飲食、藥物和運動等[8]。運用臨床樣品去尋找早期生物標(biāo)志物，需要大量樣品去平衡種群和個體差異；而運用簡單動物模型去模擬疾病，可以降低樣品的復(fù)雜程度，還可以在疾病早期觀察相關(guān)的病理生理變化，有利于尋找和疾病早期診斷相關(guān)的信息[9]。

大腸桿菌是引起兒童細菌性腦膜炎的一種常見革蘭氏陰性桿菌[10]。在本研究中，用感染大腸桿菌的大鼠去模擬兒童細菌性腦膜炎。該細菌性腦膜炎模型病情進展相對緩慢，有利于在早期尋找疾病標(biāo)志物。我們在疾病早期 (即手術(shù)后的第1天) 和大鼠臨床癥狀明顯時 (即手術(shù)后第3天)，收取尿液進行分析 (圖1)。

本研究的目的是通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法在尿液中尋找蛋白質(zhì)表達的差異，為后續(xù)在尿液中尋找細菌性腦膜炎的早期特異性生物標(biāo)志物進行初步探索。不但有利于進一步研究細菌性腦膜炎的病理生理機制，而且可為尋找細菌性腦膜炎的尿液生物標(biāo)志物研究奠定基礎(chǔ)。

圖1 細菌性腦膜炎大鼠模型尿液蛋白質(zhì)鑒定的過程

1 材料與方法

1.1 細菌性腦膜炎模型的建立

SPF級的雄性Sprague-Dawley大鼠 (170?190 g) 由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證為SCXK (京) 2008-0001。動物實驗遵循中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所倫理委員會的審查和批準(zhǔn)。所有動物在室內(nèi)溫度為 (22±1) ℃和濕度為65%?70%條件下使用標(biāo)準(zhǔn)實驗動物飲食進行飼養(yǎng)。

Sprague-Dawley大鼠用2%苯巴比妥鈉 (40 mg/kg) 進行腹腔注射麻醉。細菌性腦膜炎模型制作如下[11]：大鼠腦池內(nèi)注射20 μL(DH5α 1×107CFU/mL)，對照組注射同等體積的生理鹽水。在造模后的第1天和第3天進行臨床表現(xiàn)評分[12]：1) 昏迷；2) 不能直立；3) 30 s內(nèi)不能直立；4) 自發(fā)活動減少，5 s內(nèi)不能直立；5) 正常。不能自發(fā)行走并且昏迷的大鼠評分為1，有神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)缺陷的評分低于4。

1.2 細菌性腦膜炎大鼠病理檢查及生化檢查

用4%多聚甲醛灌注大鼠。將灌注好的鼠腦組織取出，并于甲醛中固定。將鼠腦組織做成石蠟切片并進行蘇木精-伊紅染色 (HE) 和Nissl’s染色 (N) 以顯示組織病理損傷。

分別采集細菌性腦膜炎組和對照組大鼠的腦脊液和血液。白細胞計數(shù)在北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)院檢驗科完成。

1.3 尿蛋白樣品制備和LC-MS/MS分析

在注射大腸桿菌后使用大鼠代謝籠收集對照組大鼠和細菌性腦膜炎模型大鼠的尿液進行分析，并于–80 ℃冰箱保存。提取尿液樣品蛋白的過程如下：取4 mL未進行任何處理的大鼠凍存尿液 (可根據(jù)尿蛋白濃度，更改尿液的體積)，4 ℃、2 000 ×的條件下離心30 min，并取上清于4 ℃、12 000 ×的條件下再次離心30 min，目的是去除大的細胞碎片；使用3倍體積的預(yù)冷乙醇于–20 ℃過夜沉淀蛋白；裂解液 (8 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，25 mmol/L二硫蘇糖醇和50 mmol/L Tris) 重新溶解尿蛋白[13]；Bradford方法測定蛋白濃度。

對照組和細菌性腦膜炎模型組大鼠各3只通過膠內(nèi)酶切方法進行質(zhì)譜分析。膠內(nèi)酶切尿蛋白過程如下：1D-SDS-PAGE (Invitrogen，Carlsbad，CA) 分離尿蛋白；將差異表達的凝膠帶切成小塊，用25 mmol/L 碳酸氫銨/乙腈 (1∶1) 洗滌，直至帶色褪色并消失；使用20 mmol/L二硫蘇糖醇 (Dithiothreitol，DTT) 使尿蛋白變性，并使用55 mmol/L碘乙酰胺 (IAA) 烷基化尿蛋白；將trypsin (Trypsin Gold，Promega，F(xiàn)itchburg，WI，USA) 加入到干燥的凝膠小粒中，并孵育過夜，收集肽段。將提取的多肽通過zip tip (PipetteTips；Waters，Inc，Milford，Massachusetts，USA) 脫鹽。

對照組和細菌性腦膜炎模型組大鼠各6只通過膜上酶切方法進行質(zhì)譜分析。膜上酶切尿蛋白過程如下：將蛋白質(zhì)裝載到10 kDa濾膜 (Pall，Port Washington，NY，USA) 上；用UA(8 mol/L尿素加入0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.5) 和50 mmol/L NH4HCO3依次洗滌尿蛋白；向濾膜體系內(nèi)再依次加入5 mmol/L DTT和50 mmol/L IAA；加入胰蛋白酶 (1∶50) 孵育過夜，收集肽段；酶切的肽段肽通過HLB柱 (Waters，Milford，MA) 脫鹽，然后通過真空泵 (Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany) 抽干。

酶切后的肽段用0.1% 甲酸酸化，然后使用Thermal EASY-nLC1200色譜系統(tǒng)加載到反相微毛細管柱上。通過Thermo Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany) 進行質(zhì)譜分析獲取數(shù)據(jù)。

1.4 蛋白質(zhì)鑒定和非標(biāo)記定量

所有的質(zhì)譜數(shù)據(jù)均使用PD軟件進行處理 (Version 2.4.1，Matrix Science，London，UK)，并于Swiss-prot數(shù)據(jù)庫中搜索匹配。其搜索參數(shù)設(shè)置如下：多肽母離子和子離子的質(zhì)量偏差為0.05 Da；固定修飾為半胱氨酸的脲基甲基化，可變修飾為蛋白質(zhì)N-末端乙酰化和甲硫氨酸氧化；允許兩個缺失的胰蛋白酶裂解位點。

通過Scaffold軟件(Version 4.4.6，Proteome Software Inc.，Portland，Oregon，USA) 進行定性分析。設(shè)置條件如下：可信分數(shù)≥95.0%；包含兩個以上特異肽段[14]。譜圖數(shù)用于篩選差異蛋白[15]。

1.5 Gene ontology分析

在大鼠尿液樣品中鑒定的所有蛋白質(zhì)通過PANTHER數(shù)據(jù)庫 (http://www.pantherdb.org/) 進行分析。蛋白質(zhì)分類是基于分子功能、參與的生物過程和細胞定位3個方面。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌性腦膜炎大鼠腦的組織病理學(xué)變化

與對照組相比，細菌性腦膜炎大鼠的腦組織HE染色可見明顯炎癥浸潤 (圖2)。在蛛網(wǎng)膜下腔可見毛細血管擴張充血和大量炎癥細胞。尼氏染色可見，神經(jīng)細胞腫脹變形，大量尼氏小體溶解消失。對照組蛛網(wǎng)膜下腔未見炎癥，海馬神經(jīng)元也未見損傷。說明已成功地建立了細菌性腦膜炎模型。

圖2 細菌性腦膜炎大鼠腦組織的組織病理改變

2.2 細菌性腦膜炎大鼠的行為表現(xiàn)、體重變化及白細胞檢查

細菌性腦膜炎大鼠感染大腸桿菌后第3天出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，例如呼吸急促，活動減少，并顯示較低的癥狀評分。注射細菌后的第4天，細菌性腦膜炎組的大鼠出現(xiàn)死亡。而對照組的大鼠未見神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，癥狀評分較高 (圖3A，=6，<0.001)。細菌性腦膜炎大鼠體重在第3天出現(xiàn)明顯下降，而對照組大鼠體重呈穩(wěn)步上升趨勢 (圖3B，=6，<0.05)。這些指標(biāo)的變化也與細菌性腦膜炎一致。

造模后的第1天和第3天，測量腦脊液和血液中的白細胞數(shù)量 (圖4A，B，=6)。與對照組相比，實驗組大鼠的腦脊液白細胞和血液白細胞數(shù)量都上升，然而并未達到統(tǒng)計學(xué)上的意義。這說明，造模后第1天和第3天的白細胞檢查不能為早期診斷提供有價值的線索。

2.3 尿蛋白的SDS-PAGE分析

通過SDS-PAGE凝膠電泳技術(shù)分析造模后第1天和第3天的尿蛋白。造模后第1天，細菌性腦膜炎大鼠的尿蛋白出現(xiàn)如下變化：分子量位于170 kD和15 kDa的尿蛋白表達下降；位于55 kDa和35 kDa的尿蛋白表達上升 (圖5)。造模后第3天的尿蛋白膠上沒有顯著的差異。根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果，造模后第1天的尿蛋白通過傳統(tǒng)膜上酶切和針對變化條帶的膠上酶切兩種酶切方法將蛋白切成肽段，進行質(zhì)譜分析；造模后第3天的尿蛋白通過傳統(tǒng)膜上酶切的方法進行酶切，進行質(zhì)譜分析。

2.4 尿液的蛋白肌酐比分析

細菌性腦膜炎大鼠感染大腸桿菌后第1、 3天的尿蛋白肌酐比分析。與對照組大鼠相比，細菌性腦膜炎大鼠模型的尿蛋白肌酐比在注射大腸桿菌后的第1天發(fā)生下降，第3天出現(xiàn)上升。但尿蛋白肌酐比均未出現(xiàn)顯著改變，可初步評估細菌性腦膜炎大鼠的腎功能與對照組大鼠的腎功能并無明顯差異。細菌性腦膜炎大鼠尿液蛋白表達的差異，可能是同時發(fā)生的血漿蛋白成分改變而引起的，而不是由于感染應(yīng)激等全身反應(yīng)導(dǎo)致腎功能改變引起的。

圖3 細菌性腦膜炎大鼠的癥狀評分和體重

圖4 細菌性腦膜炎大鼠的腦脊液和血液中的白細胞計數(shù)

圖5 尿液蛋白樣品的SDS-PAGE分析

2.5 大腸桿菌性腦膜炎的尿蛋白質(zhì)組學(xué)變化

通過LC-MS/MS鑒定和軟件分析后，膜上酶切共鑒定到500個尿液蛋白。將質(zhì)譜分析得到的尿液蛋白進行篩選。滿足以下條件的尿蛋白可被篩選為差異蛋白：1) 含有兩個特異性肽段；2) 變化倍數(shù)≥1.5或≤0.67，<0.05；3) 升高組中譜圖數(shù)≥5。

圖6 尿蛋白肌酐比分析

大腸桿菌性腦膜炎第1天的尿液通過膠內(nèi)酶切方法鑒定到17個差異蛋白 (表1)，其中11個蛋白表達上升，6個蛋白表達下降；通過膜上酶切方法鑒定到20個差異蛋白 (表2)，其中11個蛋白表達上升，9個蛋白表達下降。其中α-1-酸性糖蛋白 (A1AG)、α-1-抗蛋白酶 (A1AT)、中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白 (NGAL)、T-激肽原1 (KNT1) 在兩種方法中表達均上升，前表皮生長因子 (EGF) 表達均下降。大腸桿菌性腦膜炎第3天的尿液使用膜上酶切方法鑒定到5個差異蛋白 (表2)，其中2個蛋白表達上升，3個蛋白表達下降。補體C4在大腸桿菌性腦膜炎大鼠第1天和第3天的尿液中均顯著變化。將所有篩選到的差異蛋白在Ensembl homolog數(shù)據(jù)庫中搜索，33個差異蛋白具有人的同源蛋白[16]。

表1 膠內(nèi)酶切方法鑒定到的差異蛋白

Note: C and M represent the control group and meningitis group, respectively with C1 and M1 representing No. 1 rat in each group.

表2 膜上酶切方法鑒定到的差異蛋白

Note: C represents the control group, and M represents the meningitis group, respectively with M1 and M3 representing day 1 and day 3.

2.6 Gene ontology 分析

大腸桿菌性腦膜炎大鼠的尿液差異蛋白通過PANTHER分類系統(tǒng)進行分析，并同時展示不同尿液差異蛋白在分子功能、不同生物學(xué)過程中的作用以及在細胞分區(qū)中的分布信息 (表3)。分析顯示，同一尿液差異蛋白具有不同的分子功能，并可參與不同的生物學(xué)過程。例如，血漿銅藍蛋白具有結(jié)合、催化、運輸?shù)幕钚?，可參與定位、代謝、多細胞生物體等多種生物學(xué)過程。

表3 尿液差異在分子功能、不同生物學(xué)過程中的作用以及在細胞分區(qū)中的分布信息

3 討論

我們用大腸桿菌腦池注射構(gòu)造了細菌性腦膜炎的大鼠模型，該模型的主要病理生理過程是炎癥以及免疫防御反應(yīng)等一系列過程。我們的目的是想探究大腸桿菌性腦膜炎鼠的尿蛋白譜是否會發(fā)生變化，進而為尋找細菌性腦膜炎的生物標(biāo)志物奠定基礎(chǔ)。本研究尿液中鑒定到的一些差異蛋白，例如A1AG、補體C4和纖連蛋白，曾被其他研究報道過在細菌性腦膜炎患者的血液或腦脊液中顯著變化。例如，A1AG和A1AT在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)方面起作用，在細菌性腦膜炎患者的腦脊液和血液中表達上升，與本研究中尿液中變化趨勢一致[17]；血漿銅藍蛋白可參與代謝反應(yīng)以及機體對刺激的反應(yīng)等生物學(xué)過程，其在細菌性腦膜炎患者的血液中表達上升[18]；半乳凝素-3結(jié)合蛋白、β2-微球蛋白與中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白在細菌性腦膜炎患者的腦脊液中表達上升[19-21]；叢生蛋白在細菌性腦膜炎患者的血液中表達下降[22]，以上這些蛋白在其他文獻中的變化與本文尿液中的變化一致。另外，還有一些差異蛋白在其他文獻中的變化與本文尿液中的變化相反。例如，補體C4可參與機體對刺激的應(yīng)激反應(yīng)，其在細菌性腦膜炎患者腦脊液中表達下降[23]，在本文尿液中表達上升；纖連蛋白在細菌性腦膜炎患者腦脊液中表達上升[24]，在本文尿液中表達下降。這些差異蛋白居多是源自感染應(yīng)激等全身反應(yīng)，可以反映機體處于炎性、感染和免疫等應(yīng)激狀態(tài)。還有一些尿液中的差異蛋白，例如基質(zhì)重塑相關(guān)蛋白8，在血腦屏障的成熟和維持中發(fā)揮作用，可能是源自腦部損傷的蛋白。本研究是針對細菌性腦膜炎診斷標(biāo)志物的初步探索，特異性尿液差異蛋白還需要進一步的研究探索。

尿蛋白譜的改變可能來源于不同的途徑。尿液內(nèi)的差異蛋白有可能繼發(fā)于腦脊液或血液內(nèi)蛋白的改變，進而引起腎臟過濾的尿液蛋白發(fā)生改變；也可能是機體內(nèi)產(chǎn)生的病理生理過程，例如感染、應(yīng)激等，引起了腎臟功能的改變，進而導(dǎo)致尿液蛋白的改變。本研究中通過尿蛋白肌酐比初步分析，與對照組大鼠的腎功能相比，大腸桿菌細菌性腦膜炎大鼠模型的腎功能未發(fā)生明顯的改變。本研究中的尿液差異蛋白可能來源于同時發(fā)生改變的腦脊液蛋白或者血漿蛋白。說明不僅泌尿系統(tǒng)疾病的尿蛋白譜會發(fā)生改變，大腸桿菌細菌性腦膜炎的尿蛋白譜也會發(fā)生改變，這為后續(xù)在尿液中尋找疾病生物標(biāo)志物奠定了重要基礎(chǔ)。并且尿液中差異蛋白的具體改變機制以及運輸?shù)侥蛞褐兴婕暗降母鞣N通路都是我們今后的研究重點。

本研究中有一些差異蛋白已被其他研究報道過，例如EGE在Fanconi綜合征者尿液中表達下降[25]，A1AT在糖尿病患者尿液中表達上升[26]；A1AG是急性闌尾炎[27]以及尿毒癥[28]的尿液差異表達。以上研究說明多種蛋白有可能參與相同的病理生理過程，同一種蛋白也可能與很多疾病密切相關(guān)[29]。實驗中尋找到的差異蛋白可以參與很多病理生理過程，包括機體的炎癥反應(yīng)，以及應(yīng)激狀態(tài)反應(yīng)等。一組參與不同生理和病理生理過程的差異蛋白的組合更有可能反映機體的變化信息。

針對造模后第1天尿蛋白兩種不同酶切方法，鑒定到了相同的差異蛋白，也鑒定到了不同的差異蛋白。傳統(tǒng)的自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)策略，即膜上酶切方法可以提供更為詳細的信息。然而，很難區(qū)分完整的蛋白質(zhì)與降解的碎片。相反，基于一維SDS-PAGE的膠內(nèi)酶切方法解決了這一問題。例如血清轉(zhuǎn)鐵蛋白 (76 kDa) 在15 kDa條帶中被鑒定到，鑒定片段可能是血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的降解片段。低分子量蛋白A1AG (24 kDa) 在55 kDa條帶中被鑒定到，鑒定的可能是帶有修飾的A1AG蛋白。因此，在傳統(tǒng)膜上酶切之前，首先應(yīng)該分析一維SDS-PAGE是否有差異。如果有差異，應(yīng)該針對不同的實驗?zāi)康倪x擇更加適合的酶切方法進行酶切，進而質(zhì)譜鑒定。

隨著時間的延長，在細菌性腦膜炎大鼠尿液中鑒定到的差異蛋白越來越少。尿液是人體代謝的廢物，可以容納身體的各種代謝變化，因此尿液中蛋白的變化情況可以反映身體的變化。在細菌性腦膜炎疾病初期，是大鼠體內(nèi)各種反應(yīng)變化產(chǎn)生最為集中、最為強烈的時期。因此體內(nèi)的各種變化可以在尿液中較明顯地反映出來，進而會鑒定到較多的差異蛋白。隨著病情的進展，大鼠機能的下降，體內(nèi)的反應(yīng)有可能會減少，例如大鼠的免疫系統(tǒng)同病原的斗爭會減少，因此各種反應(yīng)變化也會逐漸減少，可能是導(dǎo)致鑒定到的差異蛋白越少的原因。具體的原因還需要更加深入的研究才能確定。

本研究通過注射大腸桿菌的大鼠模型模擬細菌性腦膜炎，用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析大腸桿菌性腦膜炎大鼠的尿蛋白譜改變。該研究在設(shè)計之初，并不知道能否見到任何的尿蛋白變化。實驗中在大鼠大腸桿菌性腦膜炎尿液中尋找到一些差異表達的蛋白，說明大鼠在注射大腸桿菌后尿蛋白譜確實發(fā)生了改變，為后續(xù)尋找細菌性腦膜炎尿液標(biāo)志物奠定了重要的基礎(chǔ)。相信隨著質(zhì)譜鑒定水平的不斷提高，在今后的研究中會有更多的低峰度尿液蛋白被挖掘，加之更加完善的實驗設(shè)計，例如大腸桿菌性腦膜炎大鼠模型、其他類型大腸桿菌感染大鼠模型以及對照組3組平行實驗的對比分析，可以為尋找細菌性腦膜炎標(biāo)志物提供更多的線索。當(dāng)然，如果針對尿液中所尋找到的差異蛋白在細菌性腦膜炎發(fā)病機制中所參與的具體通路及功能進行研究，能更加明確地將尿中蛋白的變化與細菌性腦膜炎的病理生理過程相聯(lián)系。

REFERENCES

[1] Gao YH. Urine—an untapped goldmine for biomarker discovery? Sci China Life Sci, 2013, 56(12): 1145–1146.

[2] Wijetunge DSS, Karunathilake KHEM, Chaudhari A, et al. Complete nucleotide sequence of pRS218, a large virulence plasmid, that augments pathogenic potential of meningitis-associatedstrain RS218. BMC Microbiol, 2014, 14: 203.

[3] Kim KS. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infect Dis, 2010, 10(1): 32–42.

[4] García-Hernández P, Prieto B, Martinez-Morillo E, et al. Interleukin-6 in cerebrospinal fluid as a biomarker of acute meningitis. Ann Clin Biochem, 2016, 53(1): 155–163.

[5] Baraff LJ, Lee SI, Schriger DL. Outcomes of bacterial meningitis in children: a meta-analysis. Pediatr Infect Dis J, 1993, 12(5): 389–394.

[6] Wu HM, Cordeiro SM, Harcourt BH, et al. Accuracy of real-time PCR, Gram stain and culture for,andmeningitis diagnosis. BMC Infect Dis, 2013, 13: 26.

[7] Task?n E, Turgut M, K?l?c M, et al. Serum procalcitonin and cerebrospinal fluid cytokines level in children with meningitis. Mediators Inflamm, 2004, 13(4): 269–273.

[8] Wu JQ, Gao YH. Physiological conditions can be reflected in human urine proteome and metabolome. Expert Rev Proteomics, 2015, 12(6): 623–636.

[9] Zhao MD, Li ML, Li XD, et al. Dynamic changes of urinary proteins in a focal segmental glomerulosclerosis rat model. Proteome Sci, 2014, 12: 42.

[10] Liu L, Johnson HL, Cousens S, et al. Global, regional, and national causes of child mortality: an updated systematic analysis for 2010 with time trends since 2000. Lancet, 2012, 379(9832): 2151–2161.

[11] Leib SL, Leppert D, Clements J, et al. Matrix metalloproteinases contribute to brain damage in experimental pneumococcal meningitis. Infect Immun, 2000, 68(2): 615–620.

[12] Leib SL, Clements JM, Lindberg RLP, et al. Inhibition of matrix metalloproteinases and tumour necrosis factorα converting enzyme as adjuvant therapy in pneumococcal meningitis. Brain, 2001, 124(9): 1734–1742.

[13] Sun W, Li FX, Wu SZ, et al. Human urine proteome analysis by three separation approaches. Proteomics, 2005, 5(18): 4994–5001.

[14] Nesvizhskii AI, Keller A, Kolker E, et al. A statistical model for identifying proteins by tandem mass spectrometry. Anal Chem, 2003, 75(17): 4646–4658.

[15] Schmidt C, Gr?nborg M, Deckert J, et al. Mass spectrometry-based relative quantification of proteins in precatalytic and catalytically active spliceosomes by metabolic labeling (SILAC), chemical labeling (iTRAQ), and label-free spectral count. RNA, 2014, 20(3): 406–420.

[16] Jia LL, Li XD, Shao C, et al. Using an isolated rat kidney model to identify kidney origin proteins in urine. PLoS ONE, 2013, 8(6): e66911.

[17] Paradowski M, ?obos M, Kuydowicz J, et al. Acute phase proteins in serum and cerebrospinal fluid in the course of bacterial meningitis. Clin Biochem, 1995, 28(4): 459–466.

[18] ?aksen H, Dede S, Cemek M, et al. Brief clinical report:evaluation of antioxidant status in children with acute bacterial meningitis and encephalitis. Int J Neurosci, 2003, 113(11): 1497–1504.

[19] Nasioudis D, Witkin SS. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin and innate immune responses to bacterial infections. Med Microbiol Immunol, 2015, 204(4): 471–479.

[20] Bellac CL, Coimbra RS, Simon F, et al. Gene and protein expression of galectin-3 and galectin-9 in experimental pneumococcal meningitis. Neurobiol Dis, 2007, 28(2): 175–183.

[21] Hansen PB, Kjeldsen L, Dalhoff K, et al. Cerebrospinal fluid beta-2-microglobulin in adult patients with acute leukemia or lymphoma: a useful marker in early diagnosis and monitoring of CNS-involvement. Acta Neurol Scand, 1992, 85(3): 224–227.

[22] H?g?sen K, Mollnes TE, Brandtzaeg P. Low levels of vitronectin and clusterin in acute meningococcal disease are closely associated with formation of the terminal-complement complex and the vitronectin-thrombin-antithrombin complex. Infect Immun, 1994, 62(11): 4874–4880.

[23] Oren R, Laufer J, Goldberg I, et al. C3, C4, factor B and HLA-DR alpha mRNA expression in renal biopsy specimens from patients with IgA nephropathy. Immunology, 1995, 86(4): 575–583.

[24] Weller M, Sommer N, Stevens A, et al. Increased intrathecal synthesis of fibronectin in bacterial and carcinomatous meningitis. Acta Neurol Scand, 1990, 82(2): 138–142.

[25] Cutillas PR, Chalkley RJ, Hansen KC, et al. The urinary proteome in Fanconi syndrome implies specificity in the reabsorption of proteins by renal proximal tubule cells. Am J Physiol Renal Physiol, 2004, 287(3): F353–F364.

[26] Sharma K, Lee S, Han S, et al. Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis analysis of the urine proteome in human diabetic nephropathy. Proteomics, 2005, 5(10): 2648–2655.

[27] Watson L, Midgley A, Pilkington C, et al. Urinary monocyte chemoattractant protein 1 and alpha 1 acid glycoprotein as biomarkers of renal disease activity in juvenile-onset systemic lupus erythematosus. Lupus, 2012, 21(5): 496–501.

[28] Vasson MP, Baguet JC, Arveiller MR, et al. Serum and urinary alpha-1 acid glycoprotein in chronic renal failure. Nephron, 1993, 65(2): 299–303.

[29] Zhao MD, Li ML, Li XD, et al. Dynamic changes of urinary proteins in a focal segmental glomerulosclerosis rat model. Proteome Sci, 2014, 12: 42.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Changes of urinary proteins in a bacterial meningitis rat model

Yanying Ni1, Fanshuang Zhang1, Manxia An1, and Youhe Gao2

1,,,,,100005,Gene Engineering and Biotechnology Beijing Key LaboratoryDepartment of Biochemistry and Molecular BiologyBeijing Normal UniversityBeijingChina

Unlike cerebrospinal fluid or blood, urine accumulates metabolic changes of the body and has the potential to be a promising source of early biomarkers discovery. Bacterial meningitis is a major cause of illness among neonates and children worldwide. In this study, we used-injected rat model to mimic meningitis and collected urine samples on day 1 and day 3. We used two different methods to digest proteins and analyzed peptides by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We identified 17 and 20 differential proteins by two methods respectively on day 1, and 5 differential proteins by filter-aided digestion method on day 3. Finding these differential proteins laid a foundation to further explore biomarkers of bacterial meningitis.

bacterial meningitis, early diagnose, LC-MS/MS, urine proteome, animal model

January 18, 2017; Accepted:April 11, 2017

Youhe Gao. Tel/Fax: +86-10-58804382; E-mail: gaoyouhe@bnu.edu.cn

Supported by:National Key Research and Development Program of China (No. 2016YFC1306300), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2013CB530805), Beijing Natural Science Foundation (Nos. 7173264, 7172076), Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. 2015KJJCB21), Beijing Cooperative Construction Project (No. 11065113), Beijing Normal University (No. 11100704).

國家重點研發(fā)計劃課題 (No. 2016YFC1306300)，國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃) (No. 2013CB530805)，北京自然科學(xué)基金 (Nos. 7173264, 7172076)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金 (No. 2015KJJCB21)，北京合作建設(shè)項目 (No. 11065113)，北京師范大學(xué) (No. 11100704) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017-04-18

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170418.1113.003.html