潘潔莉，高麗娜，趙雙雙，劉巧，郁吉峰，何一君，李美芽

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氯化鈉處理對原殼小球藻生長及油脂積累的影響

潘潔莉1，高麗娜2，趙雙雙2，劉巧3，郁吉峰2，何一君2，李美芽1

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)分析測試中心，浙江杭州 310053 2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310053 3 浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江杭州 310053

潘潔莉, 高麗娜, 趙雙雙, 等. 氯化鈉處理對原殼小球藻生長及油脂積累的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(7): 1101–1108.Pan JL, Gao LN, Zhao SS, et al. Effect of sodium chloride on growth and lipid accumulation of Chlorella protothecoides CS-41. Chin J Biotech, 2017, 33(7): 1101–1108.

采用Basal培養(yǎng)基，通過光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡以及尼羅紅染色定量等方法研究了不同濃度氯化鈉 (0、150、300、600 mmol/L) 對小球藻屬原殼小球藻的生長狀態(tài)、脂滴分布、總脂含量的影響。結(jié)果表明，添加不同濃度的氯化鈉對原殼小球藻的生長有明顯的影響，隨著氯化鈉濃度的增加，小球藻的生長速度受到明顯的抑制，600 mmol/L氯化鈉處理時(shí)生長幾乎完全被抑制。在顯微鏡下觀察，可見氯化鈉濃度的增加會(huì)導(dǎo)致小球藻聚集成團(tuán)，這種現(xiàn)象在150 mmol/L和300 mmol/L氯化鈉培養(yǎng)下比較明顯；通過電子顯微鏡下觀察，可以發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)初期，隨著氯化鈉濃度的增加，小球藻細(xì)胞壁增厚，脂滴增多。通過尼羅紅染色對脂含量進(jìn)行定量，處理初期脂滴的合成量在600 mmol/L時(shí)最高，但到后期，隨著藻生物量的增加，150 mmol/L和300 mmol/L處理下脂合成量逐漸升高，而對照小球藻脂合成量基本不變。穩(wěn)定期后，從生物量 (干重) 和脂總量來看，300 mmol/L氯化鈉培養(yǎng)處理的小球藻雖然生物量只有對照的73.55%，但是總脂含量卻是對照的2.22倍，可見一定濃度的氯化鈉處理一定時(shí)間可顯著提高原殼小球藻的油脂含量。

氯化鈉，原殼小球藻，脂滴

微藻生物能源作為新一代生物能源，基于其綠色、環(huán)保、可再生的特性，近年來備受關(guān)注。小球藻屬于綠藻門、綠球藻目卵囊藻科小球藻屬，是第一種被人工分離并培養(yǎng)的單細(xì)胞微藻[1]。原殼小球藻是小球藻的一種，而且也是目前研究較多的一種小球藻，關(guān)于原殼小球藻最早的研究是在1967年，Katayama等研究了其在光照和黑暗條件下的光合作用效率以及油酸含量的變化[2]。原殼小球藻既可以自養(yǎng)也可以異養(yǎng)培養(yǎng)[3-4]，異養(yǎng)培養(yǎng)只需要提供葡萄糖以及一些有機(jī)化合物作為營養(yǎng)來源，即可以獲得較高的生物量和高的油脂含 量[5-6]。Miao等研究發(fā)現(xiàn)只提供葡萄糖作為碳源，對原殼小球藻進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)，可以使其油脂含量比光合自養(yǎng)高出4倍[5,7]。目前，原殼小球藻主要用作飼料和醫(yī)藥材料的重要來源，近年來，也是合成生物能源的一個(gè)非常好的來源[6,8]。

為了獲得高產(chǎn)油脂的藻株，研究者們嘗試各種方法，包括從不同地方分離、篩選高產(chǎn)油脂藻株[9]；對藻株施行基因改造或外界刺激從而獲得高產(chǎn)油脂且生長快速的藻株[10-13]。鹽脅迫是最常見的一種環(huán)境刺激。在微藻細(xì)胞中，鹽脅迫可以影響脂類的合成，微藻在一定程度上都可以耐受一定的鹽濃度[14-18]，但是過量的鹽脅迫也會(huì)影響光合作用進(jìn)而影響生物量和脂合成量。對于海洋微藻鹽脅迫的影響研究較多，如杜氏鹽藻sp.[19]、微擬球藻[20]等，但對于淡水藻的研究則較少。氯化鈉是非常廉價(jià)的鹽類，同時(shí)也是營養(yǎng)的組成部分，通過調(diào)整培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度達(dá)到不影響生物量同時(shí)增加脂含量，可以大大降低生產(chǎn)成本。Xia等[21]研究了不同的鈉鹽對鏈帶藻油脂積累的影響，結(jié)果表明氯化鈉是一種有效的脂類積累的誘導(dǎo)劑。經(jīng)過改變衣藻ArM0029A培養(yǎng)基中的氯化鈉濃度，其脂類特別是不飽和脂肪酸的含量有顯著的提高[22]。Hounslow等[23]在萊茵衣藻的氯化鈉脅迫研究中發(fā)現(xiàn)，萊茵衣藻可以耐受100 mmol/L濃度氯化鈉，而200 mmol/L以上則會(huì)導(dǎo)致衣藻死亡，但是不論是低濃度長時(shí)間處理還是高濃度短時(shí)間處理，衣藻中的軟脂酸和亞麻酸含量均有極顯著的提高。前人的研究[5-7]已經(jīng)表明原殼小球藻能合成較高的脂質(zhì)，隨著鹽堿化程度的日益嚴(yán)重和淡水資源的日益匱乏，發(fā)掘鹽脅迫下小球藻的特色作用必然有重要的理論和經(jīng)濟(jì)意義。

本研究以原殼小球藻為研究對象，在基本培養(yǎng)基中添加不同濃度的氯化鈉進(jìn)行鹽脅迫的處理，對其生長速度進(jìn)行測定，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板以及光學(xué)顯微鏡等對其生長狀態(tài)進(jìn)行觀察，并采用尼羅紅染色定量的方法測定其不同生長階段的生物量以及油脂含量，采用電子顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡對其脂滴進(jìn)行觀察，總結(jié)其在含不同濃度氯化鈉的培養(yǎng)基中的生長情況和油脂合成規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 藻種

實(shí)驗(yàn)所用小球藻藻株CS-41由上海交通大學(xué)史賢明教授饋贈(zèng)。

1.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基為改良的Basal培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖9.0，KNO31.25，KH2PO41.25，MgSO4·7H2O 1.0，EDTA 0.5，H3BO30.144 2，CaCl2·2H2O 0.088 2，MnCl2·4H2O 0.014 2，MoO30.007 1，CuSO4·5H2O 0.015 7，Co(NO3)2·6H2O 0.004 9，pH 6.1。

培養(yǎng)裝置：美國NBS公司搖床 (型號(hào)Innova@42)。

培養(yǎng)條件：溫度28 ℃，光照4 000 lux，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min。

1.3 方法

1.3.1 原殼小球藻不同鹽濃度下的培養(yǎng)

配制含NaCl終濃度分別為0、150、300和600 mmol/L的小球藻低糖培養(yǎng)基。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的藻液作為藻種，以5%的接種量接種到含不同鹽濃度的液體培養(yǎng)基中，采用混養(yǎng)的培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)。從接種的當(dāng)天開始，每隔24 h取一次樣，參考崔妍等[24]的研究方法，分別采用細(xì)胞計(jì)數(shù)以及干重法繪制小球藻生長曲線。每處理樣品測定進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3.2 光學(xué)顯微鏡觀察原殼小球藻生長情況

取在含不同濃度NaCl的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的藻細(xì)胞，每24 h取樣1次，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況。

1.3.3 電子顯微鏡觀察原殼小球藻細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)

將原殼小球藻收集到1.5 mL離心管中， 5 000 r/min離心5 min收集藻體。棄上清后，用無菌水洗滌2次，然后加入2.5%戊二醛固定過夜，瓊脂包埋，1%鋨酸再固定，脫水、切片后，采用日立H-7650透射電子顯微鏡觀察小球藻的微觀結(jié)構(gòu)變化。

1.3.4 激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞中脂滴

尼羅紅染料(N3013，-Aldrich公司) 用50%的DMSO (/) 配成1 μg/mL工作濃度，染色時(shí)，在一定體積的藻液中加入等體積的 1 μg/mL尼羅紅染料進(jìn)行染色，使得染料和DMSO終濃度分別為0.5 μg/mL和25% (/)，混合均勻黑暗條件下室溫放置30 min備用。

采用萊卡SP5激光共聚焦顯微鏡，用63倍的油鏡對尼羅紅染色后的小球藻進(jìn)行觀察，在激發(fā)光488 nm，發(fā)射光560–600 nm處捕獲尼羅紅熒光信號(hào)，在激發(fā)光620 nm，發(fā)射光620–700 nm處捕獲葉綠體熒光信號(hào)。獲得的圖像采用萊卡激光共聚焦圖像處理軟件進(jìn)行融合分析。

1.3.5 尼羅紅定量小球藻中總脂含量

通過采用尼羅紅熒光染料對小球藻細(xì)胞進(jìn)行染色，測定熒光強(qiáng)度從而對單位細(xì)胞中的脂含量進(jìn)行定量。測量前需對小球藻進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后采用1.3.4相同的方法對小球藻進(jìn)行尼羅紅染色，染色后用SpectraMax M3酶標(biāo)儀測定發(fā)射波長530 nm吸收波長570 nm的熒光值。以Triolein (Supelco，PA，USA) 作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算不同培養(yǎng)時(shí)期一定數(shù)量小球藻中的脂含量，并結(jié)合小球藻不同階段的細(xì)胞濃度以及細(xì)胞干重分別計(jì)算單位體積小球藻中的脂含量以及單位重量小球藻中的脂含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 原殼小球藻生長曲線的繪制

分別采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法和干重法繪制小球藻的生長曲線，見圖1。可以發(fā)現(xiàn)原殼小球藻在接種后第3天開始進(jìn)入對數(shù)生長期，對數(shù)生長期可持續(xù)3–4 d，然后進(jìn)入穩(wěn)定期。氯化鈉的添加影響了小球藻的生長，添加氯化鈉的培養(yǎng)基中的小球藻細(xì)胞濃度明顯小于對照組 (圖1A)，干重同樣要小(圖1B)。

2.2 顯微鏡觀察添加不同濃度氯化鈉培養(yǎng)下的小球藻

采用光學(xué)顯微鏡觀察了在添加不同濃度氯化鈉培養(yǎng)基培養(yǎng)的小球藻，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，在含有氯化鈉的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小球藻開始聚集成團(tuán)，靜置時(shí)這些細(xì)胞也更容易沉降。圖2顯示了培養(yǎng)6 d的小球藻的狀態(tài)，在含有氯化鈉的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小球藻聚團(tuán)明顯，隨著鹽濃度的提高，細(xì)胞生長減緩，單個(gè)細(xì)胞的輪廓更清晰，特別是在含600 mmol/L的氯化鈉培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小球藻，細(xì)胞周圍有黑色暈圈，形態(tài)類似厚壁孢子。

圖2 顯微鏡下培養(yǎng)6 d的小球藻生長狀態(tài) (40 ×)

2.3 電鏡下觀察脂滴在小球藻中的分布情況

采用透射電鏡觀察分析了不同濃度NaCl處理下小球藻中脂滴分布情況。圖3顯示的是培養(yǎng)第3天的狀態(tài)，從圖中可以看出，隨著鹽濃度的提高，小球藻中的脂滴明顯增多，并且脂滴出現(xiàn)聚合情況，600 mmol/L氯化鈉培養(yǎng)下的小球藻中脂滴含量明顯高于其他組，并且隨著鹽濃度升高，小球藻細(xì)胞壁增厚，這與光學(xué)顯微鏡下得到的結(jié)果相似。

2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察小球藻中的脂滴

通過激光共聚焦顯微鏡可直觀地看到脂滴在小球藻細(xì)胞中的狀態(tài)以及分布情況。圖4顯示了不同鹽濃度處理3 d后藻細(xì)胞中的脂滴，高濃度的氯化鈉處理下，脂滴較多，呈現(xiàn)較強(qiáng)的黃色熒光，細(xì)胞也比對照大。

圖3 小球藻不同處理培養(yǎng)3 d的電子顯微鏡觀察結(jié)果(CW：細(xì)胞壁；LP：脂滴)

圖4 激光共聚焦顯微鏡觀察氯化鈉處理3 d后的小球藻(紅色為葉綠素?zé)晒猓S色為尼羅紅熒光)

2.5 小球藻中總脂含量的變化

采用尼羅紅染色的方法對不同生長階段的小球藻中的脂含量進(jìn)行了定量和動(dòng)態(tài)監(jiān)測。結(jié)合不同時(shí)期的細(xì)胞濃度進(jìn)行分析，從圖5A中可以看出，與對照相比，在含氯化鈉 (150、300 mmol/L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小球藻油脂總量在培養(yǎng)初期明顯低于對照組，但進(jìn)入穩(wěn)定期后，則呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，到第8天明顯高于對照組，高鹽濃度 (600 mmol/L) 由于嚴(yán)重限制了藻的生長，所以油脂含量一直偏低。結(jié)合不同時(shí)期的細(xì)胞干重進(jìn)行分析，如圖5B所示，在培養(yǎng)初期，高鹽可以刺激小球藻合成脂滴，在600 mmol/L氯化鈉培養(yǎng)下的小球藻中總脂含量明顯高于其他組，隨著時(shí)間的延長，總脂含量持續(xù)下降。而300 mmol/L氯化鈉培養(yǎng)下的小球藻中總脂含量則明顯上升，雖然生長速度有所限制，但是脂含量依然有顯著的提高。綜合兩種分析方法可以看出，300 mmol/L氯化鈉培養(yǎng)下的小球藻中總脂含量是最高的，而且趨勢明顯。

3 討論

微藻的生長受環(huán)境因素的影響，其中主要有光照、溫度、培養(yǎng)基的成分及pH等。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)條件改變時(shí)，微藻細(xì)胞代謝途徑也會(huì)受到影響。通過改變微藻培養(yǎng)的環(huán)境壓力，能刺激細(xì)胞代謝向有利于目標(biāo)的方向變化，從而達(dá)到提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的目的。許多生長條件對微藻細(xì)胞脂質(zhì)含量的積累都可以產(chǎn)生影響[17]，如pH、氮素的缺乏、光照、溫度等培養(yǎng)條件，以及自養(yǎng)、異養(yǎng)和混養(yǎng)等培養(yǎng)方式。微藻種類及菌株的不同也會(huì)有很大的差異。微藻的脂質(zhì)含量可占其干重的1%–7%，通常認(rèn)為，在一定的環(huán)境壓力下，微藻細(xì)胞分裂減緩或者停止，能導(dǎo)致細(xì)胞切換到脂質(zhì)合成模式，以作為能量儲(chǔ)存，從而導(dǎo)致了脂質(zhì)含量的提高，最高可達(dá)到80%–90%，例如氮元素缺乏[18]、磷酸鹽限制[14,18]或高鹽度[14]等都能提高微藻的脂質(zhì)含量，但是其生長速度往往受到不良影響，常常導(dǎo)致了細(xì)胞生長減緩或者停止，雖然脂質(zhì)含量相對增加，但是微藻的生物量會(huì)大大減少，造成總脂質(zhì)產(chǎn)量降低。因此摸索這些外界壓力和細(xì)胞增殖以及脂質(zhì)合成的一個(gè)平衡點(diǎn)，既可以讓小球藻生長不受太大影響，同時(shí)也能獲得較高的脂質(zhì)含量。

本研究選擇高鹽處理淡水小球藻，通過對其不同階段的生長狀態(tài)和油脂含量的測定，發(fā)現(xiàn)氯化鈉的處理可以顯著提高小球藻中油脂含量，但對其生長也有一定的影響。從生長曲線來看，在第2–3天進(jìn)入對數(shù)生長期，第6–7天進(jìn)入平臺(tái)期，在前期 (未進(jìn)入對數(shù)生長期之前) 高濃度 (600 mmol/L) 的氯化鈉處理的小球藻油脂含量明顯提高，但是嚴(yán)重限制了藻的生長。對數(shù)生長期，沒有氯化鈉的培養(yǎng)基中的小球藻生長旺盛，而含氯化鈉培養(yǎng)基中的小球藻生長較緩慢，并且呈現(xiàn)聚集現(xiàn)象，顯微鏡下可以觀察到細(xì)胞成團(tuán)，而且有些處于未分裂的狀態(tài)，細(xì)胞個(gè)體比起對照組要大一些。此外，細(xì)胞壁明顯增厚，如圖3所示，含300 mmol/L氯化鈉的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小球藻細(xì)胞壁明顯厚于含150 mmol/L氯化鈉的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小球藻。說明高濃度的鹽使小球藻啟動(dòng)了應(yīng)激模式，加固了防御屏障。從脂滴合成來看，除600 mmol/LNaCl處理的小球藻中油脂呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢外，其他濃度處理的小球藻均持續(xù)上升，只是幅度有所不同，對照組中上升幅度較低，將細(xì)胞生物量干重與油脂總量與對照進(jìn)行相對比較分析見圖5B，可以發(fā)現(xiàn)，進(jìn)入平臺(tái)期后150 mmol/L和300 mmol/L氯化鈉處理的小球藻中油脂含量持續(xù)上升，300 mmol/L氯化鈉處理的小球藻中油脂含量上升幅度最大。穩(wěn)定后期 (大于8 d) 細(xì)胞聚集明顯，計(jì)數(shù)困難，因此沒有繼續(xù)進(jìn)行油脂含量的測定。從培養(yǎng)相同天數(shù)的細(xì)胞干重和總脂含量來看，穩(wěn)定期300 mmol/L氯化鈉處理的小球藻細(xì)胞干重雖然只有對照的73.55%，但是總脂含量卻提高了2.22倍。按細(xì)胞濃度與總脂含量來分析，每毫升藻液中油脂含量比對照增加了58.78%。綜合分析，300 mmol/L氯化鈉處理的小球藻中油脂含量有明顯的提高。

通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)一定濃度的氯化鈉脅迫雖然減緩了小球藻的生長，但能顯著提高小球藻中的油脂積累，培養(yǎng)時(shí)間和處理濃度與小球藻中油脂積累呈現(xiàn)一定的規(guī)律。Wan等[15]研究了鐵鹽對中油脂合成的影響，發(fā)現(xiàn)油脂合成從12%增加到了33%，并且通過Q-PCR發(fā)現(xiàn)鐵鹽的添加對脂代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)有一定的影響。結(jié)合我們的研究結(jié)果，鈉鹽的添加是否也是影響原殼小球藻脂合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)從而影響小球藻脂質(zhì)合成的差異，還有待進(jìn)一步研究。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Effect of sodium chloride on growth and lipid accumulation ofCS-41

Jieli Pan1, Li’na Gao2, Shuangshuang Zhao2, Qiao Liu3, Jifeng Yu2, Yijun He2, and Meiya Li1

1,,310053,,2,,310053,,College of Medical TechnologyZhejiang Chinese Medical UniversityHangzhouZhejiangChina

With basal medium, we studied the growth status, lipid droplet distribution, total lipid content ofCS-41 treated with different concentrations of sodium chloride (0, 150, 300 and 600 mmol/L) by optical microscopy, electron microscopy, confocal laser focusing and Nile red staining. Results show that the addition of NaCl affected the growth ofCS-41. With the increase of NaCl concentration, the growth rate ofwas inhibited.cell wall became thicker, and lipid droplets increased. At the early stage, the amount of lipid droplets in the 600 mmol/L NaCl culture was the highest, but at the late-log stage, the amount of lipid droplets increased with the increase of the biomass of culture in 150 and 300 mmol/L NaCl culture. At the stable stage, biomass (dry weight) in 300 mmol/L NaCl culture was 73.55% of that in the control, but the total lipid content was 2.22 times higher than that in the control. A certain concentration of sodium chloride treatment can significantly increase the lipid content ofCS-41.

sodium chloride,CS-41, lipid droplet

December 13, 2016; Accepted:May 10, 2017

Meiya Li. Tel: +86-571-86613589; Fax: +86-571-86633176; E-mail: lmeiya@126.com

Supported by:Science and Technology Project of Zhejiang Province (No. 2015C32084).

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. 2015C32084) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-05-17

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