李華祥，陸震鳴，朱青，耿燕，史勁松，許正宏,，馬延和

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鈣離子調(diào)控樟芝深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢及其分子機(jī)制

李華祥1，陸震鳴1，朱青1，耿燕1，史勁松1，許正宏1,2，馬延和2

1 江南大學(xué)藥學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122 2 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過(guò)程工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

李華祥, 陸震鳴, 朱青, 等. 鈣離子調(diào)控樟芝深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢及其分子機(jī)制. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(7): 1124–1135.Li HX, Lu ZM, Zhu Q, et al. Effect of calcium on sporulation of Taiwanofungus camphoratus in submerged fermentation. Chin J Biotech, 2017, 33(7): 1124–1135.

樟芝是原產(chǎn)于臺(tái)灣的珍稀藥用真菌，具有保肝、抗癌等活性。樟芝在深層發(fā)酵過(guò)程中能夠產(chǎn)生大量無(wú)性孢子，但是目前對(duì)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢的影響因素及其分子機(jī)制尚不明確。本研究報(bào)道了樟芝發(fā)酵培養(yǎng)基中Ca2+濃度能夠有效調(diào)控樟芝無(wú)性產(chǎn)孢的現(xiàn)象；采用雙向電泳 (2-DE) 技術(shù)，對(duì)不添加Ca2+培養(yǎng)(對(duì)照) 的菌絲體、添加1 mmol/L Ca2+培養(yǎng) (促進(jìn)產(chǎn)孢) 的菌絲體及添加200 mmol/L Ca2+培養(yǎng) (抑制產(chǎn)孢) 的菌絲體進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定了參與Ca2+/鈣調(diào)素信號(hào)通路的CaM蛋白和HSP90蛋白，以及參與FluG調(diào)控產(chǎn)孢信號(hào)通路的AbaA蛋白；進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)了Ca2+/鈣調(diào)素和FluG介導(dǎo)的樟芝無(wú)性產(chǎn)孢信號(hào)通路模型圖；采用實(shí)時(shí)定量PCR (RT-qPCR) 技術(shù)，對(duì)該通路上23個(gè)功能基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了受Ca2+調(diào)控最為靈敏的7個(gè)產(chǎn)孢相關(guān)功能基因：、、、、、及。本研究結(jié)果為解析樟芝無(wú)性產(chǎn)孢機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

樟芝，無(wú)性產(chǎn)孢，分子機(jī)制，鈣離子，鈣調(diào)蛋白

樟芝又名牛樟芝、牛樟菇，是一種原產(chǎn)于臺(tái)灣地區(qū)的藥用真菌，具有保肝護(hù)肝、抗炎癥、抗癌癥、抗乙肝病毒等多種生物活性[1]。由于野生數(shù)量少、生長(zhǎng)緩慢等原因，樟芝子實(shí)體長(zhǎng)期供不應(yīng)求。目前，深層發(fā)酵技術(shù)由于其周期短、效率高、成本低、易于規(guī)模化等優(yōu)點(diǎn)，已成為樟芝規(guī)模化生產(chǎn)的重要方式[1]。已有研究通過(guò)培養(yǎng)基組成優(yōu)化[2-3]、環(huán)境因素優(yōu)化[4-5]、發(fā)酵工藝優(yōu)化[6-7]或添加前體物質(zhì)[8-9]等提高深層發(fā)酵樟芝活性物質(zhì)的產(chǎn)量。

本課題組報(bào)道了樟芝在深層發(fā)酵后期合適的環(huán)境條件下會(huì)大量產(chǎn)生無(wú)性節(jié)孢子的現(xiàn)象[10]，并發(fā)現(xiàn)以樟芝無(wú)性節(jié)孢子作為接種物，可有效縮短樟芝發(fā)酵周期，節(jié)約種子制備的時(shí)間及成本，提高發(fā)酵過(guò)程可控性與批次穩(wěn)定性[11]。隨后，建立了基于無(wú)性繁殖過(guò)程的樟芝循環(huán)發(fā)酵工藝，有利于樟芝活性代謝產(chǎn)物的高效穩(wěn)定生產(chǎn)，同時(shí)可免去不同發(fā)酵批次種子制備的步 驟[12]。但是目前對(duì)于樟芝無(wú)性產(chǎn)孢的分子機(jī)制尚不明確，對(duì)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢過(guò)程無(wú)法實(shí)現(xiàn)有效控制。

真菌無(wú)性產(chǎn)孢受諸多環(huán)境因素的影響，包括碳源、氮源、碳氮比、光照、溶氧、鈣離子 (Ca2+) 及pH等[13]，其中Ca2+對(duì)絲狀真菌無(wú)性產(chǎn)孢具有顯著調(diào)控作用，且具有明顯的濃度依賴性[14]。Roncal等[15]報(bào)道，培養(yǎng)基中添加1?10 mmol/L的Ca2+時(shí)，能顯著促進(jìn)多種青霉深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢；Li等[16]報(bào)道，50 mmol/L的Ca2+對(duì)白僵菌的生長(zhǎng)有抑制作用；Soriani等[17]用200 mmol/L的CaCl2對(duì)煙曲霉進(jìn)行10 min的短脈沖處理，發(fā)現(xiàn)及等無(wú)性產(chǎn)孢相關(guān)基因的表達(dá)量受到顯著影響；Schumacher等[18]發(fā)現(xiàn)當(dāng)CaCl2濃度大于300 mmol/L時(shí)，對(duì)灰霉病菌突變株有毒性作用。但目前對(duì)于Ca2+調(diào)控絲狀真菌無(wú)性產(chǎn)孢的分子機(jī)制尚缺乏深入研究。本文首先考察Ca2+濃度對(duì)樟芝深層發(fā)酵過(guò)程中無(wú)性產(chǎn)孢的影響；其次，通過(guò)雙向電泳 (2-DE) 技術(shù)，鑒定與樟芝無(wú)性產(chǎn)孢過(guò)程相關(guān)的功能基因，預(yù)測(cè)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢信號(hào)通路；進(jìn)一步通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR (RT-qPCR) 技術(shù)評(píng)價(jià)不同Ca2+--濃度調(diào)控下產(chǎn)孢信號(hào)通路中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平差異，探究Ca2+促進(jìn)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢的分子機(jī)制，以期為解析樟芝無(wú)性產(chǎn)孢分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程中可控產(chǎn)孢奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器

葡萄糖、酵母粉、KH2PO4、MgSO4、HCl、丙酮、三氯乙酸 (TCA)、甘油及磷酸等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán) (上海)；三羥甲基氨基甲烷 (Tris)、尿素、十二烷基硫酸鈉 (SDS)、二硫蘇糖醇 (DTT)、碘乙酰胺 (IAM)、IPG膠條 (24 cm，pH 3?10)、兩性電解液 (pH 3?10)、低熔點(diǎn)覆蓋瓊脂糖、甘氨酸、過(guò)硫酸銨 (APS) 及四甲基乙二胺 (TEMED) 等購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司 (Bio-Rad)；考馬斯亮藍(lán)R-250、溴酚藍(lán)、苯甲基磺酰氟 (PMSF)、30% (/) 丙烯酰胺/甲叉雙丙稀酰胺溶液 (29:1)、2D電泳樣品提取液III、改良型Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒、M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒及引物合成等均購(gòu)自生工生物工程有限公司 (上海)；A-氰基-4羥基肉桂酸，三氟乙酸及乙腈等質(zhì)譜分析所用購(gòu)置于Sigma公司；SYBR熒光染料購(gòu)自Life Technologies公司；等電聚焦儀 (Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit)、垂直電泳設(shè)備 (Ettan DALTsix Electrophoresis Unit) 及掃描儀 (Imagescanner) 購(gòu)自GE Healthcare公司；質(zhì)譜分析儀 (Ultra flex MALDI-TOF/TOF mass spectrometer) 購(gòu)自Bruker-Daltonics公司；NanoDrop 2000C分光光度計(jì)購(gòu)自Thermo Scientific公司；RT-qPCR儀 (CFX Connect Optics Module Real-Time System) 購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.1.2 菌株

樟芝菌株來(lái)自美國(guó)模式菌種保藏中心 (American Type Culture Collection，USA)，保藏編號(hào)為ATCC 200183。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；

種子培養(yǎng)基 (/)：葡萄糖2%、酵母粉0.1%、KH2PO40.3%、MgSO40.15%，pH 4.5；

發(fā)酵培養(yǎng)基 (/)：葡萄糖2%、酵母粉0.4%、KH2PO40.3%、MgSO40.15%，pH 4.5。

1.2 方法

1.2.1 樟芝發(fā)酵培養(yǎng)

將PDA斜面上的樟芝菌絲接種到種子培養(yǎng)基中，于26 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)13 d，再將發(fā)酵液于無(wú)菌條件下用4層紗布過(guò)濾，所得濾液 (即孢子懸浮液) 作為種子以1.0×106孢子/mL的接種量接種到裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，26 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)11 d。

Ca2+影響產(chǎn)孢實(shí)驗(yàn)：于發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加1、5、10、50及200 mmol/L的CaCl2，并將培養(yǎng)基初始pH調(diào)為4.5，振蕩培養(yǎng)8 d，其余條件及操作同上。

1.2.2 產(chǎn)孢量及生物量檢測(cè)

將培養(yǎng)一定時(shí)間的發(fā)酵液用4層紗布過(guò)濾，所得濾液用血球計(jì)數(shù)板于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)并計(jì)算產(chǎn)孢量；所得菌絲體用去離子水清洗3遍后，烘干稱重并計(jì)算生物量。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3 總蛋白及RNA提取

將發(fā)酵8 d的樟芝發(fā)酵液經(jīng)4層紗布過(guò)濾，收集樟芝菌絲體，用TE緩沖液 (pH 8.0) 洗滌至濾液澄清后，保存于液氮中待用。

參照相關(guān)文獻(xiàn)[19-20]采用TCA/丙酮沉淀法提取樟芝菌絲體中的總蛋白，用改良型Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)總蛋白進(jìn)行定量。用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取樟芝菌絲體中的總RNA，用NanoDrop 2000C分光光度計(jì)對(duì)總RNA進(jìn)行濃度及質(zhì)量檢測(cè)。

1.2.4 雙向電泳及質(zhì)譜分析

每個(gè)樣品的蛋白上樣量為600 μg，2-DE操作條件根據(jù)文獻(xiàn)方法[19-20]略作修改：1) 膠條主動(dòng)水化12 h后進(jìn)行等電聚焦，程序?yàn)椋??50 V 30 min，50?100 V 30 min，100?250 V 1 h，250?500 V 1 h，500?1 000 V 1.5 h，1 000?5 000 V 2 h，5 000?10 000 V 2 h，維持10 000 V 9.5 h；2) 依次用平衡液I (尿素36%，SDS 2%，30%甘油 20%，DTT 2%，pH 8.8的Tris-HCl 50 mmol/L) 和平衡液II (尿素36%，SDS 2%，30%甘油20%，IAM 2.5%，pH 8.8的Tris-HCl 50 mmol/L) 分別平衡15 min；3) 將膠條轉(zhuǎn)移到12%的SDS-PAGE凝膠上，用低熔點(diǎn)覆蓋瓊脂糖覆蓋后進(jìn)行恒功率垂直電泳分離，程序?yàn)椋? W/gel 1 h，14 W/gel 5 h。每個(gè)樣品做3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，電泳實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

電泳結(jié)束后，凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，脫色處理后用掃描儀采集圖像。每個(gè)樣品選擇分離效果較好的3張圖像，并用PDQuest 8.0軟件進(jìn)行蛋白點(diǎn)定量及比較分析，將差異蛋白點(diǎn) (表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào)或下調(diào)2倍以上的點(diǎn)) 從凝膠上切下后，參照文獻(xiàn)[19-20]進(jìn)行相應(yīng)的處理及質(zhì)譜分析。獲得的肽段信息分別與樟芝基因組數(shù)據(jù)庫(kù)[21]及下載自NCBI的樟芝EST序列數(shù)據(jù)庫(kù) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/) 進(jìn)行匹配，蛋白得分≥30被認(rèn)為匹配成功。

1.2.5 生物信息學(xué)分析

通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù) (https://www. ncbi.nlm.nih.gov/) 檢索等方式，收集與絲狀真菌無(wú)性產(chǎn)孢相關(guān)的蛋白并構(gòu)建本地蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。將2-DE分析所得的差異蛋白序列與該本地蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，以驗(yàn)證Ca2+誘導(dǎo)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢的相關(guān)信號(hào)通路。進(jìn)一步將文獻(xiàn)報(bào)道的樟芝基因組蛋白序列[21]分別與本地蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得樟芝無(wú)性產(chǎn)孢及Ca2+/鈣調(diào)素信號(hào)通路相關(guān)的蛋白或基因，E value值≤10–6被認(rèn)為匹配成功。選擇所預(yù)測(cè)的樟芝Ca2+/鈣調(diào)素信號(hào)通路及FluG介導(dǎo)產(chǎn)孢信號(hào)通路上23個(gè)功能基因，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上的樟芝EST序列及文獻(xiàn)報(bào)道的樟芝全基因組序列和氨基酸序列[21]，獲得相應(yīng)的cDNA序列并采用Beacon Designer 7.0軟件設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的RT-qPCR引物，各引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物列表

1.2.6 RT-qPCR分析

通過(guò)NanoDrop分光光度計(jì)檢測(cè)，選擇質(zhì)量較佳 (2.0<260/280<2.1) 的總RNA，稀釋到50 ng/μL后用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA模板。RT-qPCR反應(yīng)體系如下：SYBR染料8.5 μL，正向引物0.425 μL，反向引物0.425 μL，cDNA模板1.25 μL，ddH2O 6.4 μL；反應(yīng)程序如下：50 ℃ 2 min，95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，45個(gè)循環(huán)。以樟芝18 rRNA序列為內(nèi)參，不添加CaCl2的樟芝菌絲體樣品為對(duì)照，用2?ΔΔCt計(jì)算法[22]對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Ca2+對(duì)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢的影響

首先對(duì)樟芝產(chǎn)孢量及生物量在該發(fā)酵過(guò)程中隨發(fā)酵時(shí)間的變化情況進(jìn)行了考察 (圖1A)。結(jié)果表明：0?3 d為適應(yīng)期，生物量較低；4?8 d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體快速生長(zhǎng)，生物量快速增加；9 d為穩(wěn)定期，生物量達(dá)到最大值；10 d之后為衰亡期，菌體自溶，生物量下降。發(fā)酵0?5 d不產(chǎn)孢；發(fā)酵6 d開(kāi)始產(chǎn)孢；7?9 d為快速產(chǎn)孢期，大量產(chǎn)孢 (圖1B)；發(fā)酵10 d產(chǎn)孢量達(dá)到最大值 (4.29×106spores/mL)。由于發(fā)酵8 d的樟芝菌絲體處于快速產(chǎn)孢期，產(chǎn)孢速度最快，同時(shí)發(fā)酵8 d尚處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期及穩(wěn)定期前期，菌體活性較強(qiáng)，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以發(fā)酵8 d的菌絲體作為研究對(duì)象。

參考相關(guān)文獻(xiàn)[15-18]，我們選擇在培養(yǎng)基中添加0?200 mmol/L的CaCl2，并在發(fā)酵8 d時(shí)取樣進(jìn)行產(chǎn)孢量檢測(cè)，來(lái)考察Ca2+對(duì)樟芝深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢的影響，結(jié)果如表2所示。在 0?50 mmol/L范圍內(nèi)，Ca2+--濃度對(duì)樟芝發(fā)酵生物量及pH沒(méi)有顯著影響 (>0.05)。但是低濃度的Ca2+(1?10 mmol/L) 能夠顯著促進(jìn)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢，而高濃度的Ca2+(>50 mmol/L) 則顯著抑制樟芝產(chǎn)孢 (< 0.05)。當(dāng)Ca2+添加濃度為1 mmol/L時(shí)，促進(jìn)產(chǎn)孢效果最為顯著，發(fā)酵8 d時(shí)產(chǎn)孢量與對(duì)照組相比提高了4倍以上；當(dāng)Ca2+添加濃度為200 mmol/L時(shí)，抑制產(chǎn)孢效果最為顯著，發(fā)酵8 d時(shí)尚未產(chǎn)孢。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15-18]。

圖1 樟芝產(chǎn)孢量和生物量隨發(fā)酵時(shí)間變化曲線(A) 及節(jié)孢子形態(tài)(B)

表2 不同濃度Ca2+對(duì)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢的影響

Note: the cultivations were conducted in 500 mL Erlenmeyer flasks containing 100 mL of fermentation medium, which was composed of 20 g/L of glucose, 4 g/L of yeast extract, 3.0 g/L of KH2PO4, 1.5 g/L of MgSO4, with initial pH of 4.5 and inoculum size of 1.0×106spores/mL, then incubated for 8 d at 26 ℃ by shaking at 150 r/min. Means in a column followed by different letters are significantly different (<0.05) by ANOVA test.

2.2 雙向電泳及蛋白鑒定

為了解Ca2+促進(jìn)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢可能的調(diào)控基因或蛋白，本實(shí)驗(yàn)選擇不添加Ca2+培養(yǎng)8 d的菌絲體 (對(duì)照樣品，記為“CK”)、添加1 mmol/LCa2+培養(yǎng)8 d的菌絲體 (促進(jìn)產(chǎn)孢效果最顯著樣品，記為“1 mmol/L”) 及添加200 mmol/L Ca2+培養(yǎng)8 d的菌絲體 (抑制產(chǎn)孢效果最顯著樣品，記為“200 mmol/L”) 進(jìn)行2-DE分析，結(jié)果如圖2所示。“CK”樣品共分離到316個(gè)蛋白點(diǎn)，“1 mmol/L”樣品共分離到366個(gè)蛋白點(diǎn)，“200 mmol/L”樣品共分離到293個(gè)蛋白點(diǎn)。通過(guò)圖像分析，挖取了28個(gè)表達(dá)量差異的蛋白點(diǎn) (圖2，箭頭所示) 進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

將質(zhì)譜分析獲得的肽段信息分別與樟芝基因組序列[21]及下載自NCBI的樟芝EST序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，結(jié)果28個(gè)蛋白點(diǎn)全部鑒定成功。進(jìn)一步采用本地蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)與產(chǎn)孢功能相關(guān)的蛋白 (6 832、2 249和 1 813)。其中，蛋白點(diǎn)6 832匹配上的EST序列 (DR027428.1) 與迷孔菌屬L-15 889的熱休克蛋白HSP90高度同源 (E value值為7E-146，同源性87%，覆蓋率99%)，蛋白點(diǎn)2 249是Ca2+/鈣調(diào)素信號(hào)通路上的關(guān)鍵蛋白CaM，而蛋白點(diǎn)1 813則是FluG介導(dǎo)產(chǎn)孢信號(hào)通路上的關(guān)鍵蛋白AbaA。CaM是鈣調(diào)蛋白 (又名鈣調(diào)素)，通過(guò)與Ca2+結(jié)合而被激活，進(jìn)而激活鈣調(diào)磷酸酶[23]；AbaA是FluG介導(dǎo)的產(chǎn)孢信號(hào)通路上關(guān)鍵蛋白之一，它與BrlA和WetA構(gòu)成了該信號(hào)通路中的中心調(diào)控途徑[24]。據(jù)此結(jié)果，我們推測(cè)Ca2+影響樟芝無(wú)性產(chǎn)孢主要是通過(guò)Ca2+/鈣調(diào)素信號(hào)通路以及FluG介導(dǎo)的產(chǎn)孢信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

2.3 RT-qPCR分析

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的Ca2+/鈣調(diào)素信號(hào)通路圖[14]及FluG介導(dǎo)的產(chǎn)孢信號(hào)通圖[24]，我們將樟芝基因組蛋白庫(kù)[21]與利用絲狀真菌無(wú)性產(chǎn)孢相關(guān)蛋白構(gòu)建的本地蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，在樟芝中獲得了目前文獻(xiàn)報(bào)道的參與上述兩條信號(hào)通路中除FlbE和GpgA外的所有蛋白。于是，我們選擇在Ca2+/鈣調(diào)素信號(hào)通路和FluG介導(dǎo)的產(chǎn)孢信號(hào)通路中較為關(guān)鍵的23個(gè)基因 (、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、及) 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析。

圖2 添加不同濃度Ca2+培養(yǎng)的樟芝菌絲體蛋白2-DE分離結(jié)果及鑒定點(diǎn)

將菌絲體樣品“CK”、“1 mmol/L”和 “200 mmol/L”中的總RNA反轉(zhuǎn)錄后，以18S rRNA為內(nèi)參，樣品“CK”為對(duì)照，分析上述23個(gè)基因在樣品“1 mmol/L”和“200 mmol/L”中的表達(dá)情況 (圖3)。結(jié)果表明，除了基因和在添加低濃度Ca2+(1 mmol/L) 和高濃度Ca2+(200 mmol/L) 時(shí)表達(dá)量較對(duì)照上調(diào)外，其余21個(gè)基因均呈現(xiàn)出在添加低濃度Ca2+(促進(jìn)產(chǎn)孢) 的菌絲體樣品中表達(dá)量上調(diào)，添加高濃度Ca2+(抑制產(chǎn)孢) 的菌絲體樣品中表達(dá)量下調(diào)的趨勢(shì)。其中，以、、、、、及7個(gè)基因的表達(dá)量變化最為顯著：在促進(jìn)產(chǎn)孢的菌絲體中表達(dá)量上調(diào)約3?9倍，在抑制產(chǎn)孢的菌絲體樣品中表達(dá)量下調(diào)約25?80倍。因此，可以推測(cè)這7個(gè)基因在Ca2+影響樟芝深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢的過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用。

Crz1是一個(gè)鈣調(diào)磷酸酶響應(yīng)的鋅指蛋白，含有一個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，可以通過(guò)結(jié)合在鈣調(diào)磷酸酶依賴基因的啟動(dòng)子區(qū)域來(lái)激活處于Ca2+/鈣調(diào)素信號(hào)通路下游的基因，是Ca2+/鈣調(diào)素信號(hào)通路中極其重要的1個(gè)轉(zhuǎn)錄因子[16]；熱激蛋白是生物體在脅迫條件下大量合成的一類蛋白，HSP90是其中一員，其序列高度保守，是真菌中1種重要的分子伴侶，參與真菌細(xì)胞壁成分合成、無(wú)性產(chǎn)孢及侵染等[14,25]；FlbB是1個(gè)bZip (Basic leucine zipper) 類轉(zhuǎn)錄因子，也是FluG介導(dǎo)的產(chǎn)孢信號(hào)通路中的上游調(diào)節(jié)因子之一，其主要作用是激活基因，而FlbD為激活所必需[26]；FadA是G蛋白三聚體中的α亞基，其主要作用是通過(guò)抑制的表達(dá)[24]；基因編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，是FluG介導(dǎo)的產(chǎn)孢信號(hào)通路中心調(diào)控途徑的第一個(gè)基因，它主要編碼兩個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，并通過(guò)該鋅指結(jié)構(gòu)激活[24]；基因也編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，由BrlA所激活，其編碼的蛋白AbaA含有一個(gè)ATTS/TEA DNA結(jié)合域，為激活所必需[27]；是FluG介導(dǎo)的產(chǎn)孢信號(hào)通路中心調(diào)控途徑中的最后一個(gè)基因，由AbaA所激活，直接誘導(dǎo)產(chǎn)孢行為的發(fā)生，并參與細(xì)胞壁中海藻糖的合成，促進(jìn)孢子成熟[24]。

圖3 添加不同濃度Ca2+對(duì)相關(guān)基因表達(dá)量的影響

2.4 樟芝無(wú)性產(chǎn)孢信號(hào)通路模型圖的預(yù)測(cè)

Ca2+/鈣調(diào)素信號(hào)通路在真菌的應(yīng)激反應(yīng)、抗藥性、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、形態(tài)控制、無(wú)性產(chǎn)孢及侵染等過(guò)程中起著重要作用[14]。Ca2+/鈣調(diào)素信號(hào)通路主要包括鈣通道蛋白 (Cch1和Mid1)、鈣調(diào)素/鈣調(diào)蛋白 (Calmodulin，CaM)、鈣調(diào)磷酸酶 (Calcineurin)、熱激蛋白 (如HSP90) 及轉(zhuǎn)錄因子 (如Crz1) 等[14,17]。其中，鈣調(diào)蛋白會(huì)與細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+結(jié)合形成復(fù)合體，它是主要的Ca2+信號(hào)傳感器[23]；鈣調(diào)磷酸酶是1個(gè)高度保守的蛋白，也是目前真菌中唯一被鑒定的受Ca2+和CaM調(diào)控的磷酸化酶，其主要受體是Crz1。當(dāng)細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+濃度增加時(shí)，鈣調(diào)磷酸酶被Ca2+/CaM復(fù)合體激活[14,28]。鈣調(diào)磷酸酶被激活時(shí)，調(diào)節(jié)亞基CnaB參與激活催化亞基CnaA，而催化亞基CnaA是鈣調(diào)蛋白CaM的結(jié)合位點(diǎn)[17]。

FluG介導(dǎo)的產(chǎn)孢信號(hào)通路是真菌中一條常見(jiàn)的產(chǎn)孢信號(hào)通路，該通路主要由兩部分組成，即上游調(diào)控途徑 (FluG、FlbA、FlbB、FlbC、FlbD及FlbE等) 和中心調(diào)控途徑 (BrlA、AbaA及WetA) 組成[24]。FluG在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段逐漸積累，當(dāng)積累到一定濃度或受產(chǎn)孢信號(hào)誘導(dǎo)時(shí)，便通過(guò)移除阻遏因子SfgA的形式來(lái)激活上游調(diào)節(jié)因子FlbA、FlbB或FlbC[29]。隨后，F(xiàn)lbA通過(guò)抑制G蛋白調(diào)控信號(hào)通路間接促進(jìn)表達(dá)，而FlbB進(jìn)一步激活，F(xiàn)lbD和FlbC共同作用激活，從而進(jìn)入FluG介導(dǎo)的產(chǎn)孢信號(hào)通路中心調(diào)控途徑并最終導(dǎo)致產(chǎn)孢[24]。

根據(jù)上述2-DE和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[14,17-18,23-24,26,29-30]，我們預(yù)測(cè)了樟芝Ca2+/鈣調(diào)素和FluG介導(dǎo)的樟芝無(wú)性產(chǎn)孢信號(hào)通路模型圖，如圖4所示。環(huán)境中的Ca2+通過(guò)鈣通道蛋白 (Cch1和Mid1) 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)與鈣調(diào)蛋白 (CaM) 結(jié)合形成Ca2+-CaM復(fù)合體后激活鈣調(diào)磷酸酶，同時(shí)熱休克蛋白大量合成。后續(xù)作用機(jī)制可由RT-qPCR分析結(jié)果推測(cè)：1) 基因的表達(dá)量變化極為顯著 (上調(diào)8倍以上或下調(diào)70倍以上)，激活的上游基因編碼2個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，而轉(zhuǎn)錄因子也編碼1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，因此，我們認(rèn)為的作用與類似，可直接激活；2) 基因和的表達(dá)量變化也較為顯著 (上調(diào)6倍以上或下調(diào)28倍以上)，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16-17]，、和都是或的下游基因，因此，我們認(rèn)為鈣調(diào)磷酸酶直接或間接地作用于、和并促進(jìn)其表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到促進(jìn)表達(dá)的目的。因此，我們認(rèn)為表達(dá)量的顯著變化不是鈣調(diào)磷酸酶直接作用的結(jié)果，而是由//表達(dá)量的變化所致；3) G蛋白α亞基基因表達(dá)量變化亦較為顯著 (上調(diào)3倍以上或下調(diào)25倍以上)。因?yàn)楹偷淖饔檬窍喾吹模虼?，我們認(rèn)為鈣調(diào)磷酸酶是通過(guò)促進(jìn)表達(dá)來(lái)抑制G蛋白調(diào)節(jié)信號(hào)通路，最終減弱該通路抑制產(chǎn)孢的作用而達(dá)到促進(jìn)產(chǎn)孢的效果；4) 基因的表達(dá)量變化也極為顯著 (上調(diào)6倍以上或下調(diào)80倍以上)，但由于直接受調(diào)控，因此，我們認(rèn)為基因表達(dá)量的顯著變化是由表達(dá)量的變化引起的。此外，WetA參與合成細(xì)胞壁組成成分且與孢子成熟有關(guān)，HSP90也與細(xì)胞壁的完整性有關(guān)，因此，我們認(rèn)為HSP90和WetA一樣，也起到促進(jìn)孢子成熟的作用。

圖4 Ca2+/鈣調(diào)素和FluG介導(dǎo)的樟芝無(wú)性產(chǎn)孢信號(hào)通路模型圖

3 結(jié)論

本文報(bào)道了Ca2+濃度顯著影響樟芝深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢的現(xiàn)象，且具有明顯的濃度依賴性，當(dāng)添加濃度為1 mmol/L時(shí)，發(fā)酵8 d產(chǎn)孢量較對(duì)照提高4倍以上。通過(guò)對(duì)添加不同濃度Ca2+培養(yǎng)的樟芝菌絲體進(jìn)行2-DE分析，獲得了HSP90、CaM及AbaA 3個(gè)產(chǎn)孢功能相關(guān)蛋白；采用RT-qPCR技術(shù)，對(duì)Ca2+/鈣調(diào)素信號(hào)通路及FluG介導(dǎo)無(wú)性產(chǎn)孢信號(hào)通路上23個(gè)功能基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了受Ca2+調(diào)控最為靈敏的7個(gè)產(chǎn)孢相關(guān)功能基因：、、、、、及。進(jìn)而預(yù)測(cè)了Ca2+促進(jìn)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢的信號(hào)通路模型：環(huán)境中的Ca2+通過(guò)鈣通道蛋白 (Cch1和Mid1) 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)與鈣調(diào)蛋白 (CaM) 結(jié)合形成Ca2+-CaM復(fù)合體并激活鈣調(diào)磷酸酶，同時(shí)熱休克蛋白大量合成。轉(zhuǎn)錄因子編碼基因被鈣調(diào)磷酸酶激活后直接作用于基因并促進(jìn)其表達(dá)；鈣調(diào)磷酸酶或HSP90直接或間接地促進(jìn)產(chǎn)孢上游調(diào)控途徑中的、和基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)基因表達(dá)或抑制G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路，最終達(dá)到促進(jìn)產(chǎn)孢的效果；HSP90和WetA參與細(xì)胞壁組分的合成，都能促進(jìn)孢子成熟。本研究結(jié)果為解析樟芝無(wú)性產(chǎn)孢機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Effect of calcium on sporulation ofin submerged fermentation

Huaxiang Li1, Zhenming Lu1, Qing Zhu1, Yan Geng1, Jinsong Shi1, Zhenghong Xu1,2, and Yanhe Ma2

1 Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education, School of Pharmaceutical Science, National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 Tianjin Key Laboratory for Industrial Biological Systems and Bioprocessing Engineering, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

Taiwanofungus camphoratus is a valuable and rare medicinal mushroom with various bioactivities, such as liver protection and anti-cancer. T. camphoratus can produce many arthroconidia at the end of submerged fermentation, but molecular mechanism underlying this submerged conidiation remains unknown. In this study, we found that Ca2+ concentration in culture medium significantly affected the arthroconidium production of T. camphoratus. Then, we identified two proteins (CaM and HSP90) involved in Ca2+/calmodulin signaling pathway and one protein (AbaA) involved in FluG-mediated conidiation pathway by two-dimensional electrophoresis analyses. Furthermore, we proposed a Ca2+/calmodulin- and FluG-mediated signaling pathway by bioinformatics analysis. By real-time quantitative PCR analyses of 23 key genes in the Ca2+/calmodulin- and FluG-mediated conidiation pathway, we found that expression levels of 7 genes (crz1, hsp90, flbB, brlA, abaA, wetA and fadA) showed significant responses to Ca2+ concentration in fermentation medium. Our research is beneficial for elucidating the underlying mechanism of submerged fermentation conidiation for T. camphoratus.

, conidiation,molecular mechanism, calcium ion, calmodulin

January 3, 2017; Accepted:February 24, 2017

Zhenghong Xu. Tel/Fax: +86-510-85918206; E-mail: zhenghxu@jiangnan.edu.cn Yanhe Ma. E-mail: ma_yh@tib.cas.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31401931).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31401931) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-03-29

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170329.1026.002.html