王聰磊, 馬明波, 潘璐璐, 董鎖拽, 唐志榮, 周文龍

(1.浙江理工大學(xué) 材料與紡織學(xué)院，杭州 310018；2.浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局 絲類檢測(cè)中心，杭州 310012)

研究與技術(shù)

鮮繭生絲多酚微量組分提取方法

王聰磊1, 馬明波1, 潘璐璐2, 董鎖拽2, 唐志榮1, 周文龍1

(1.浙江理工大學(xué) 材料與紡織學(xué)院，杭州 310018；2.浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局 絲類檢測(cè)中心，杭州 310012)

為對(duì)鮮繭生絲微量組分的提取方法進(jìn)行探究，文章通過(guò)高效液相色譜(HPLC)研究了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇/水溶液的提取溶劑和提取條件(溫度、時(shí)間和浴比)對(duì)鮮繭生絲多酚微量組分提取效率的影響，并采用正交試驗(yàn)優(yōu)選出較佳提取條件。結(jié)果表明，不同溶劑鮮繭生絲提取物的HPLC圖有明顯差異，表現(xiàn)為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，色譜峰強(qiáng)度越低，組分含量越低。不同提取條件對(duì)保留時(shí)間為10～16 min組分含量均有影響，其中以溫度的影響最為顯著。同時(shí)研究表明，純水是鮮繭生絲多酚微量組分最佳提取溶劑，以純水為提取溶劑的較佳提取條件為：溫度40 ℃，時(shí)間90 min，浴比1︰25。

生絲；鮮繭；多酚；提??；高效液相色譜

由于鮮繭繅絲法工序少，能夠節(jié)省能耗，繅絲成本低，且蠶蛹更可有效利用，故鮮繭生絲的綜合效益比繅制干繭生絲好，越來(lái)越多的繅絲企業(yè)開(kāi)始生產(chǎn)鮮繭生絲。但是，據(jù)絲綢企業(yè)反映，鮮繭生絲的織造性能不如干繭生絲，綢面易出現(xiàn)質(zhì)量問(wèn)題[1]。目前市場(chǎng)上并沒(méi)有對(duì)鮮繭生絲進(jìn)行標(biāo)注，很重要的原因是還沒(méi)有一種有效的方法可鑒別鮮繭生絲和干繭生絲。雖然國(guó)內(nèi)已報(bào)道了多個(gè)可鑒別鮮繭生絲和干繭生絲的方法，其依據(jù)均是基于生絲白度、含膠率、單絲強(qiáng)度等物理性能的差異[2-4]。這些方法有一定的科學(xué)性，但不同產(chǎn)地繅制的生絲質(zhì)量差異較大，因此并不具有普遍性。Gulrajani等[5]認(rèn)為繭絲中除絲膠、絲素外，還有少量的蠟質(zhì)、色素、多酚類小分子和無(wú)機(jī)物等物質(zhì)。Chikara Hirayama等[6]從桑蠶繭絲中發(fā)現(xiàn)了槲皮素、山柰酚等多種黃酮類化合物。這些多酚類小分子物質(zhì)附著在絲膠上，熱穩(wěn)定性差，在干繭繅絲的烘繭、煮繭工序中，受到高溫很容易變性或發(fā)生降解，導(dǎo)致這些小分子在繭絲中的含量減少。有研究表明，利用高效液相色譜對(duì)鮮繭生絲和干繭生絲中多酚微量組分進(jìn)行分析，對(duì)兩者進(jìn)行鑒別是可行的[7]。為了進(jìn)一步優(yōu)化該方法，需要對(duì)樣品中多酚微量組分的提取方法進(jìn)行詳細(xì)研究。

繭絲微量組分存在于繭絲內(nèi)部[8]，提取這些組分需先將繭絲剪碎。常規(guī)的提取方法如普通浸提和回流提取均存在效率低、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)[9-10]，為提高提取效率、縮短提取周期，采用超聲波輔助提取技術(shù)對(duì)鮮繭生絲進(jìn)行提取[11]。為探索鮮繭生絲多酚微量組分的最佳提取方法并提取到穩(wěn)定的組分，本研究采用正交試驗(yàn)法對(duì)超聲波輔助提取條件進(jìn)行探索。通過(guò)改變提取溶劑和超聲波輔助提取條件(溫度、時(shí)間和浴比)，對(duì)提取物的HPLC圖進(jìn)行分析，比較各種提取條件對(duì)微量組分的提取效率的影響，并通過(guò)UV光譜法對(duì)提取物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析。為鮮繭生絲和干繭生絲的商業(yè)鑒別、性能分析、產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供借鑒。

1 試 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

材料：桑蠶鮮繭生絲(浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局)，去離子水、超純水、乙醇為分析純(杭州高晶精細(xì)化工有限公司)，甲醇為色譜純(杭州高晶精細(xì)化工有限公司)。

儀器：R201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器有限公司)，JP-100S型超聲清洗機(jī)(深圳潔盟超聲清洗機(jī)有限公司)，DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司)，OHRUS電子分析天平(AR124CN，奧豪斯儀器上海有限公司)，TU-1950雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)，Waters-E2695高效液相色譜儀(美國(guó)沃特斯科技有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 乙醇/水溶劑體系對(duì)鮮繭生絲組分的提取

將鮮繭生絲剪碎或粉碎，精確稱量鮮繭生絲粉末5.0 g置于250 mL燒杯中，按浴比1︰25(g/mL)分別加入一定比例的乙醇/水溶液，并在40 ℃超聲波清洗機(jī)中，300 W超聲波輔助提取90 min，抽濾。將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，加入1 mL一定比例的乙醇/水溶液置于超聲波清洗機(jī)中超聲1～2 min加速溶解提取物，將提取液經(jīng)0.45 μm的過(guò)濾膜過(guò)濾后，轉(zhuǎn)移至樣品瓶中備用。

1.2.2 超聲條件對(duì)鮮繭生絲組分提取的影響

稱取鮮繭生絲粉末5.0 g，采用單因素試驗(yàn)分別在不同溫度、時(shí)間和浴比條件下進(jìn)行超聲波輔助提取，抽濾，按照1.2.1方法濃縮制樣，備用。

1.2.3 正交試驗(yàn)

經(jīng)1.2.2單因素試驗(yàn)確定每個(gè)影響因素的三個(gè)水平，以保留時(shí)間為10～16 min組分的提取效率為考察目標(biāo)，用L9(34)正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)[12]。

1.2.4 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)

采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)1.2.1所得濾液進(jìn)行檢測(cè)，空白樣為去離子水，檢測(cè)波長(zhǎng)為200～800 nm。

1.2.5 HPLC測(cè)試

采用Waters-E2695高效液相色譜儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。HPLC檢測(cè)條件：色譜柱Spursil C18(250×4.6 mm,3.5 μm),柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。流動(dòng)相為甲醇(A相)、水(B相)，梯度洗脫，流動(dòng)相配比：0 min(15%A，85%B)；17 min(100%A，0%B)；20 min(100%A，0%B)；30 min(15%A，85%B)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇/水溶劑體系對(duì)鮮繭生絲組分的提取

2.1.1 鮮繭生絲提取物的UV光譜分析

繭絲中含有微量的來(lái)源于桑葉的天然多酚類化合物，多酚類化合物極性較大，易溶于水、甲醇、乙醇等極性溶劑，考慮到安全性，選擇乙醇/水溶劑體系作為鮮繭生絲組分的提取溶劑。圖1為鮮繭生絲不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇/水溶液提取液，各提取液均濃縮至一定體積。從圖1可以看出，純水和30%乙醇/水溶液提取出的物質(zhì)顏色為淡黃色，50%和70%乙醇/水溶液提取出的物質(zhì)顏色很淺，當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高到90%和100%時(shí)，提取物幾乎呈無(wú)色透明狀。說(shuō)明在本研究選用的溶劑體系下溶劑極性越大，越有利于鮮繭生絲中色素類物質(zhì)的提取。總體來(lái)說(shuō)，乙醇/水溶劑體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，不利于多酚類物質(zhì)的提取。

圖1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇/水溶液鮮繭生絲提取物Fig.1 Extracts from fresh raw silk with ethanol/water solution of different mass fractions

圖2為不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇/水溶液的鮮繭生絲提取液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖。從圖2可以看出，各提取物在220、280 nm左右處含有芳香族化合物所具有的E帶及B帶紫外特征吸收，符合多酚類化合物的紫外吸收特征，說(shuō)明這些成分很可能是多酚類化合物[13]。不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇/水溶液提取物的紫外-可見(jiàn)吸收光譜比較相似，均在220 nm和280 nm左右處有最大吸收。但由于提取物在220 nm處有很強(qiáng)的檢測(cè)信號(hào)，液相色譜檢測(cè)時(shí)，以220 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，各提取物的HPLC圖差異并不顯著，而以280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，HPLC圖中的組分信息最顯著，因此選擇280 nm作為HPLC的檢測(cè)波長(zhǎng)。純水、30%乙醇、50%乙醇和70%乙醇溶液提取物在323 nm處有一較明顯的肩峰出現(xiàn)，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，肩峰越不明顯。當(dāng)用100%乙醇提取鮮繭生絲時(shí)，其提取物只在220 nm和280 nm處有最大吸收。即使是90%和100%乙醇溶液提取得到的無(wú)色提取物，其類別也和圖1中純水提取到的有色物質(zhì)相似。

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇/水溶液的鮮繭生絲 提取物的UV光譜圖Fig.2 UV spectrograms of extracts from fresh raw silk with ethanol/water solution of different mass fractions

2.1.2 鮮繭生絲提取物的高效液相色譜分析

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇/水溶液鮮繭生絲提取物的HPLC分離效果如圖3所示(檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm)。從圖3可以看出，在保證進(jìn)樣質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同時(shí)，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇/水溶液提取物有很大差異，表現(xiàn)為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，色譜峰強(qiáng)度越低，表明提取物含量越少。純水和30%乙醇/水溶液提取物在保留時(shí)間為2.37 min處均有很強(qiáng)的檢測(cè)信號(hào)，在保留時(shí)間為10～16 min內(nèi)有一系列的峰，且主要在保留時(shí)間為10.13、13.25 min和15.23 min處有中等強(qiáng)度的色譜峰，在保留時(shí)間為7.07 min和18.34 min處的檢測(cè)信號(hào)很弱。隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，這些色譜峰的強(qiáng)度均有不同程度的衰減。90%和100%乙醇/水溶液提取物僅在保留時(shí)間為2.37 min和10.13 min處有非常弱的色譜峰出現(xiàn)。分析認(rèn)為是因?yàn)楦街诮z膠上的多酚類物質(zhì)極性較大，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，越不利于這些物質(zhì)的提取。文獻(xiàn)[7]表明，鮮繭生絲和干繭生絲提取物的HPLC圖主要區(qū)別就在于是否含有保留時(shí)間為10～16 min組分色譜峰。為了更有效地鑒別鮮繭生絲和干繭生絲，必須保證保留時(shí)間為10～16 min組分的提取效率，因此選取純水作為提取溶劑。

圖3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇/水溶液鮮繭生絲提取物的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of extracts from fresh raw silk with ethanol/water solution of different mass fractions

2.2 超聲提取條件對(duì)鮮繭生絲多酚微量組分提取效果的影響

2.2.1 提取溫度對(duì)鮮繭生絲多酚微量組分提取效果的影響

普通浸提和回流提取法耗時(shí)長(zhǎng)，提取效率低，這對(duì)于生絲大批次鑒別是不合適的。超聲輔助提取能夠提高效率，縮短提取周期，因此，對(duì)鮮繭生絲組分的超聲波提取條件進(jìn)行了研究。不同溫度下鮮繭生絲提取物色譜圖(檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm)和提取溫度對(duì)保留時(shí)間為10～16 min組分提取效率的影響，分別如圖4和圖5所示。從圖5可以看出，隨著提取溫度的升高，保留時(shí)間為10～16 min組分的檢測(cè)信號(hào)逐漸增強(qiáng)，其峰面積占比也越來(lái)越大，說(shuō)明提取溫度對(duì)鮮繭生絲多酚微量組分的提取效率具有積極影響。但由于絲膠本身具有親水性，較高的溫度會(huì)促進(jìn)絲膠溶解，導(dǎo)致提取液中的絲膠含量增多。在HPLC檢測(cè)過(guò)程中，樣品液中的絲膠遇到高質(zhì)量分?jǐn)?shù)甲醇會(huì)發(fā)生變性而沉淀下來(lái)，最終導(dǎo)致色譜柱堵塞。因此在繭絲提取過(guò)程中，一般不宜選擇較高溫度。在保證具有較高提取效率的前提下，選擇30、40、50 ℃作為正交試驗(yàn)的三個(gè)水平。

圖4 不同溫度下鮮繭生絲提取物的HPLC圖Fig.4 HPLC chromatograms of extracts from fresh raw silk at different temperatures

圖5 提取溫度對(duì)鮮繭生絲多酚微量組分提取效率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction efficiency of polyphenols trace components in fresh raw silk

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)鮮繭生絲多酚微量組分提取效率的影響

圖6為不同提取時(shí)間鮮繭生絲提取物的HPLC圖(檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm)，圖7為提取時(shí)間與微量組分相對(duì)含量的關(guān)系。從圖7可以看出，隨著提取時(shí)間的增加，前5 min組分色譜峰基本不變，10～16 min組分的色譜峰強(qiáng)度逐漸升高，說(shuō)明提取時(shí)間越長(zhǎng)，提取物中多酚微量組分含量越多。在開(kāi)始提取的前90 min，微量組分相對(duì)含量提高較快，在90 min后，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚微量組分得率增加緩慢。考慮到生絲檢測(cè)的效率，將提取時(shí)間為60、90、120 min作為正交試驗(yàn)的三個(gè)水平。

圖6 不同時(shí)間鮮繭生絲提取物的HPLC圖Fig.6 HPLC chromatograms of extracts from fresh raw silk of different durations

圖7 提取時(shí)間對(duì)鮮繭生絲多酚微量組分提取效率的影響Fig.7 HPLC chromatograms of extracts from fresh raw silk of different durations

2.2.3 浴比對(duì)鮮繭生絲微量組分提取效率的影響

圖8和圖9分別為不同浴比鮮繭生絲提取物的HPLC圖(檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm)及浴比對(duì)多酚微量組分提取效率的影響。從圖8可以看出，浴比為1︰10和1︰20時(shí)，保留時(shí)間為10～16 min組分色譜峰強(qiáng)度較低，而浴比為1︰25及以上時(shí)，保留時(shí)間為10～16 min組分色譜峰的峰形明顯，說(shuō)明溶劑用量越多，提取到的多酚微量組分就越多。圖9反應(yīng)出微量組分提取效率隨著浴比的增加而升高，但是考慮到后續(xù)蒸發(fā)濃縮的耗時(shí)及檢測(cè)的效率，選定浴比1︰20、1︰25和1︰30作為正交試驗(yàn)的三個(gè)水平。

圖8 不同浴比鮮繭生絲提取物的HPLC圖Fig.8 HPLC chromatograms of extracts from fresh raw silk with different liquor ratios

圖9 浴比對(duì)鮮繭生絲多酚微量組分提取效率的影響Fig.9 Effect of liquor ratio on extraction efficiency of polyphenols trace components in fresh raw silk

2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取每個(gè)影響因素的三個(gè)水平做正交試驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，確定較佳的提取條件。采用L9(34)正交表，以溫度(A)、時(shí)間(B)和浴比(C)作為3個(gè)考察因素，選擇3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)(表1)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Tab.1 Factor level of orthogonal test

由表2中的極差R值可知，以保留時(shí)間為10～16 min組分的提取效率為指標(biāo)，各因素的影響大小依次為A>B>C，即溫度>時(shí)間>浴比。通過(guò)表3方差分析可知，三個(gè)因素中，A具有顯著影響，其他因素影響較小。通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)選出的提取方法為A3B3C3，即提取溫度50 ℃，時(shí)間120 min，浴比1︰30。由于提取時(shí)間和浴比不同水平之間的影響差異并不大，因此從提高生絲檢測(cè)效率和減少濃縮耗時(shí)角度考慮，選擇提取條件為：時(shí)間90 min、浴比1︰25。另外，較高的溫度會(huì)促進(jìn)絲膠溶解，在HPLC檢測(cè)時(shí)樣品液中的絲膠遇到高質(zhì)量分?jǐn)?shù)甲醇會(huì)因變性而沉淀，導(dǎo)致色譜柱堵塞，故選擇40 ℃作為提取溫度。綜上，確定較佳提取條件為：溫度40 ℃，時(shí)間90 min，浴比1︰25。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Design and result of orthogonal test

注：K1、K2、K3是三個(gè)因素同一水平的提取效率之和；k1、k2、k3是三個(gè)因素同一水平的平均提取效率。

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Result of variance analysis

注：F0.05(2,2)=19.00，F(xiàn)0.01(2,2)=99.00。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取一定量的鮮、干繭生絲粉末，分別在原方法[7]和上述條件下進(jìn)行提取，濃縮制樣過(guò)程同1.2.1，在保證進(jìn)樣質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同時(shí)經(jīng)HPLC檢測(cè)得到的色譜圖如圖10所示。從圖10可以看出，干繭生絲和鮮繭生絲的HPLC圖主要區(qū)別就在于是否含有保留時(shí)間為10～16 min組分色譜峰[7]。對(duì)比不同提取方法鮮繭生絲提取物HPLC圖可以發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)選后的條件下進(jìn)行提取，鮮繭生絲提取物HPLC圖具有更顯著的特征，即在保留時(shí)間為10～16 min組分的相對(duì)含量較高，這說(shuō)明本研究所確定的提取方法合理。

圖10 鮮繭生絲和干繭生絲提取物HPLC圖Fig.10 HPLC chromatograms of extracts from fresh raw silk and from dry raw silk

3 結(jié) 論

1)以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇/水溶液作溶劑時(shí)，鮮繭生絲多酚提取物組分有明顯的差異，表現(xiàn)為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)越低，色譜峰強(qiáng)度越高，組分含量越高，因此鮮繭生絲組分的最佳提取溶劑是純水。

2)超聲提取溫度、時(shí)間和浴比對(duì)鮮繭生絲多酚微量組分的提取均有一定的影響，其中溫度對(duì)多酚得率影響最大。綜合各因素，確定較佳的提取條件為：溫度40 ℃，時(shí)間90 min，浴比1︰25。

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Extraction method of polyphenols trace components in fresh raw silk

WANG Conglei1, MA Mingbo1, PAN Lulu2, DONG Suozhuai2, TANG Zhirong1, ZHOU Wenlong1

(1.College of Materials and Textiles, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China; 2.Silk Inspection Center,Zhejiang Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau, Hangzhou 310012, China)

To explore the extraction method of trace components in fresh raw silk, this paper is intended to study the effect of extraction solvents (ethanol/water solution) of different mass fractions and extraction conditions (temperature, time and liquor ratio) on extraction efficiency of polyphenols trace components in fresh raw silk via high performance liquid chromatography (HPLC), figure out the optimum extraction conditions via orthogonal test. The results indicate that the HPLC chromatograms of extracts from fresh raw silk with different solvents significantly differ. Specifically, with the mass fraction of ethanol is in negative correlation with both the intensity of chromatographic peaks and the content of components. All the extraction conditions have impact on the content of components having retained for 10 to 16 min, and the impact of temperature is most significant. Meanwhile, researches show that pure water is the best extraction solvent of polyphenols trace components in fresh raw silk, of which the optimum extraction conditions are: temperature of 40 ℃, duration of 90 min, and liquor ratio of 1︰25 (g/mL).

raw silk; fresh cocoon; polyphenols; extract; HPLC

10.3969/j.issn.1001-7003.2017.07.001

2016-11-08;

2017-05-25

國(guó)家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目(2016IK282)

王聰磊(1990-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樾滦图徔棽牧吓c綠色紡織品的研究。

周文龍，教授，wzhou@zstu.edu.cn。

TS102.1

A

1001-7003(2017)07-0001-06 引用頁(yè)碼: 071101