范素芳，馬俊美，俞婧，王娟，劉紅冉，李強(qiáng)，張巖(河北省食品檢驗(yàn)研究院 河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050004)

固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定植物油中苯并(a)芘

范素芳，馬俊美，俞婧，王娟，劉紅冉，李強(qiáng)，張巖
(河北省食品檢驗(yàn)研究院 河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050004)

本實(shí)驗(yàn)建立了基于固相萃取的高效液相色譜法測(cè)定植物油中苯并(a)芘含量。樣品用正己烷溶解，經(jīng)Cleanert BAP-3固相萃取小柱凈化，采用C18色譜柱分離，以乙腈/水=80/20(V/V)為流動(dòng)相，經(jīng)熒光檢測(cè)器檢測(cè)。結(jié)果表明苯并(a)芘在0. 50 μg /L ～ 50 μg /L濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0. 9999，方法檢出限為0. 1 μg /kg，樣品加標(biāo)回收率為89.00% ～ 94.46%，RSD為1.0% ～ 2.2%。該方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，可用于植物油中苯并芘的檢測(cè)。

固相萃取；高效液相色譜法；植物油；苯并(a)芘

苯并(a)芘又稱3,4-苯并芘，是由苯環(huán)和芘分子結(jié)合而成的多環(huán)芳烴類化合物[1]，具有高度脂溶性[2]，并且性質(zhì)穩(wěn)定, 不易降解，是常見(jiàn)的高活性間接致癌物的一種，苯并(a)芘具有致畸、致突變作用[3]。植物油是人類食用頻率最高的食物之一，在油料作物的種植、加工、運(yùn)輸和烹調(diào)的過(guò)程中，容易污染苯并(a)芘[4-5]，雖然含量通常較低，但其毒性較大，對(duì)油脂的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和人體健康都造成的不容忽視損害。因此，許多國(guó)家和地區(qū)都規(guī)定了食用油脂中苯并(a)芘的最大殘留限量，歐盟629/2008號(hào)文件規(guī)定苯并(a)芘的最大殘留限量為2μg/kg，我國(guó)GB2716-2005《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定為10μg/kg[6]。

近年來(lái)，食用植物油中苯并(a)芘超標(biāo)的食品安全事件時(shí)有發(fā)生[7-9]，引發(fā)了政府和公眾對(duì)食用植物油中苯并(a)芘食用安全問(wèn)題的強(qiáng)烈關(guān)注。目前，植物油中苯并(a)芘含量的檢測(cè)方法主要有薄層層析法、熒光分光光度法、高效液相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[10-15]。其中，薄層層析法和熒光分光光度法操作步驟繁多且靈敏度較低；氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的分離效果及色譜重現(xiàn)性好，但對(duì)儀器要求比較高，不利于推廣[16]。高效液相色譜法的分離效果好，靈敏度高，且容易推廣，近年來(lái)我國(guó)制定的標(biāo)準(zhǔn)GB/T22509-2008中也是采用高效液相色譜法，但其存在成本高，耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，重現(xiàn)性差等問(wèn)題，因此建立一種科學(xué)快速且準(zhǔn)確可靠的檢驗(yàn)方法是十分必要的。

本實(shí)驗(yàn)采用Cleanert BAP-3固相萃取柱對(duì)植物油進(jìn)行提取凈化，再用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)，簡(jiǎn)化了處理步驟，降低了實(shí)驗(yàn)成本和有機(jī)試劑排放量，實(shí)現(xiàn)了植物油中苯并(a)芘的快速精確測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-30AD超高效液相色譜儀(日本SHIMADZU公司) ；12位固相萃取儀(Agilent 公司)；IKA Vortex Genius 3旋渦混合器(德國(guó)IKA公司)；Bond Elut ENV固相萃取柱(500 mg/6 mL，Agilent公司) ；Cleanert BAP-3固相萃取柱(500 mg /6 mL，博納艾杰爾公司)；FLorisil PR(1000 mg/6 mL，北京振翔工貿(mào)有限公司) ；C18固相萃取柱、硅膠固相萃取柱、HLB固相萃取柱均購(gòu)自美國(guó)Waters公司。

色譜純乙腈、正己烷和二氯甲烷(美國(guó)Merck 公司) ；苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)品(純度99. 3% ，美國(guó)Supelco公司)。水為實(shí)驗(yàn)室自制的二級(jí)水，符合GB/T6682規(guī)定。

1.2 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國(guó)Waters公司)；流動(dòng)相：乙腈:水=80:20；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：1μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：Ex:384 nm，Em:406 nm。

1.3 樣品的前處理

1.3.1 試樣提取

稱取0.5g食用植物油試樣(精確到0.001g)于15mL離心管中，加入3mL正己烷，渦旋充分混勻，待凈化。

1.3.2 試樣凈化

將Cleanert BAP-3固相萃取柱用5 mL二氯甲烷，5 mL正己烷活化，將待凈化液上樣，以2 mL 正己烷潤(rùn)洗樣品管，保證完全上樣，再用10 mL正己烷淋洗固相萃取柱，最后用5 mL二氯甲烷洗脫，收集洗脫液，于40 ℃下氮?dú)獯蹈桑?. 00 mL乙腈定容，超聲10 s，過(guò)0. 22μm有機(jī)系微孔濾膜，供液相色譜熒光檢測(cè)法檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相萃取柱的選擇

食用油中的苯并(a)芘的萃取常采用混合溶劑，但由于苯并(a)芘的脂溶性較強(qiáng)導(dǎo)致萃取時(shí)提取效率不高；另一種方法是在油脂中加入堿性溶液，經(jīng)皂化反應(yīng)除脂后再用溶劑提取，但皂化反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，一般2 h 以上，導(dǎo)致樣品檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。為簡(jiǎn)化操作，提高檢測(cè)效率，考慮將植物油樣品溶解后，直接進(jìn)行固相萃取凈化。

本實(shí)驗(yàn)考察了添加量為10 μg/kg時(shí)Bond Elut ENV 、Cleanert BAP-3、FLorisil PR、C18、硅膠和HLB固相萃取柱對(duì)苯并芘的保留和凈化能力，結(jié)果如圖1。研究表明Cleanert BAP-3固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行前處理，回收率最高，且干擾較小。Cleanert BAP-3是一種以聚苯乙烯二乙烯苯高聚物為填料的新型固相萃取柱，利用了高聚物苯環(huán)和苯并芘之間的π-π作用，能對(duì)樣品起到很好的凈化效果。故選擇Cleanert BAP-3固相萃取柱為凈化小柱。Cleanert BAP-3柱凈化色譜圖如圖2所示。

圖1 不同固相萃取柱對(duì)苯并芘的回收率

圖2 陽(yáng)性樣品的Cleanert BAP-3柱凈化色譜圖

2.2 稱樣量的選擇

在考察稱樣量時(shí)，通過(guò)加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)確定稱樣量對(duì)回收率的影響。加標(biāo)量為10 μg/kg，計(jì)算稱樣量分別為0.2 g、0. 5 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g時(shí)苯并芘的回收率，結(jié)果(圖3)表明，稱樣量大于0.5 g時(shí)，稱樣量對(duì)回收率有顯著影響，稱樣量提高，回收率降低，原因可能是固相萃取柱的承載量有限，稱樣量過(guò)大，會(huì)造成萃取柱過(guò)載，從而造成回收率偏低；稱樣量小于0.5 g時(shí)，稱樣量對(duì)回收率影響較小，考慮到適當(dāng)?shù)脑龃蠓Q樣量，可以減少因稱量設(shè)備精度等造成的誤差，故本實(shí)驗(yàn)稱樣量選為0.5 g。

圖3 不同稱樣量對(duì)苯并芘的回收率

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和檢出限

苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品用甲苯溶解后，用乙腈配成10 mg/L儲(chǔ)備液，分取儲(chǔ)備液再稀釋成0. 5、1. 0、5. 0、10. 0、20.0、50.0μg /L，將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)(X)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸 ，苯并芘在0. 5～50.0 μg/L濃度范圍內(nèi)有良好的線性，回歸方程為Y=12723.3X-2730.22，R2=0. 9999。以儀器信噪比(S/N) 為3時(shí)所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為儀器的檢出限，根據(jù)前處理方法計(jì)算方法的檢出限為0.1μg /kg。

2. 4 回收率和精密度

在植物油樣品中添加苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平分別為1μg/kg、5μg/kg和10μg/kg，每個(gè)濃度做6個(gè)平行，回收率及精密度數(shù)據(jù)如表1 所示，加標(biāo)回收率在89.00%～94.46%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不高于2.2%，滿足殘留檢測(cè)的要求。

表1 樣品回收率及精密度

2. 5 實(shí)際樣品測(cè)定

利用本方法對(duì)市售的食用植物油樣品30批進(jìn)行測(cè)定，包括花生油、大豆油、棉籽油、香油等樣品，檢測(cè)時(shí)均無(wú)干擾，色譜分離良好，其中16批樣品未檢出苯并芘，13批樣品檢出苯并芘，含量不超過(guò)10. 0μg /kg，1批樣品檢出含量超過(guò)10μg/kg，為12.81μg/kg，用GB/T 22509-2008規(guī)定的方法對(duì)此樣品進(jìn)行了測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果與本方法結(jié)果一致，證明本方法準(zhǔn)確可靠、適用性強(qiáng)。

3 結(jié)論

建立了固相萃取-高效液相色譜熒光檢測(cè)器測(cè)定食用油中苯并芘的方法。樣品過(guò)Cleanert BAP-3固相萃取柱凈化，采用C18反相色譜柱分離，回收率及精密度均獲得滿意結(jié)果，該法方便、快捷、靈敏，可滿足日常檢測(cè)要求，有較大的推廣應(yīng)用前景。

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Determination of the benzo(a) pyrene in vegetable oil by high performance liquid chromatography based on solid phase extraction

FAN Su-fang, MA Jun-mei, YU Jing,Wang Juan, LIU Hong-ran,LI Qiang, ZHANG Yan
(HebeiFoodInspectionandResearchInstitute,KeyLaboratoryofFoodSafetyofHebei,ShijiazhuangHebei050004,China)

In this experiment, a high performance liquid chromatography method was built to determine benzo(a) pyrene in vegetable oil based on solid phase extraction. Samples were extracted with hexane，then cleaned-up using Cleanert BAP-3 solid phase extractionl column，and separated on an C18 column using a mobile phase consisting of acetonitrile and water(V/V=80:20) by gradient elution. Finally the benzo( a) pyrene was detected with FLD.The benzo(a) pyrene showed good linearity in the range of 0. 50μg/L～50 μg/L(R2=0.9999).The limit of detection was 0.1 1μg/kg.The recoveries were 89.00%～94.46%，and the RSD was 1.0%～2.2%.The method was rapid，accurate，sensitive and simple，it could be applied to the quantification of benzo(a) pyrene in vegetable oil.

Solid phase extraction; High performance liquid chromatography; Vegetable oil; Benzo(a) pyrene

2017-04-28

范素芳(1985-)，女，博士，工程師，研究方向?yàn)槭称窓z驗(yàn).

張 巖(1979-)，男，博士，正高級(jí)工程師，研究方向?yàn)槭称钒踩?

1001-9383(2017)02-0047-05

O657

A