張雷雷，夏靜，關(guān)書會(huì)，張京, 張巖(.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 石家莊 05009；.河北冠卓檢測(cè)科技有限公司，河北 石家莊 05009)

超高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定金屬罐內(nèi)壁涂層中三聚氰胺及其類似物遷移檢測(cè)技術(shù)研究

張雷雷1，夏靜1，關(guān)書會(huì)1，張京2, 張巖1
(1.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 石家莊 050091；2.河北冠卓檢測(cè)科技有限公司，河北 石家莊 050091)

本研究建立了金屬罐體內(nèi)層涂料中三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺的超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)技術(shù)。通過(guò)對(duì)不同提取溶液模擬金屬灌裝飲料的生產(chǎn)流程，對(duì)其中模擬物進(jìn)行測(cè)試，采用正離子掃描和負(fù)離子掃描的方式進(jìn)行儀器條件研究，確定了三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺的監(jiān)測(cè)模式和特征離子對(duì)，并進(jìn)行了MRM模式定性定量分析。該方法的檢出限為5.0～25μg/L; 線性范圍0.5～200μg/ L內(nèi)，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，灌裝飲料使用的金屬罐在特定條件下會(huì)發(fā)生三聚氰胺的遷移，存在食品安全風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)未檢出其類似物的存在。

三聚氰胺；三聚氰胺類似物；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

引言：

自“三鹿”事件以來(lái)，對(duì)于奶制品乃至食品中三聚氰胺的分析方法已出現(xiàn)了很多種[1]，但國(guó)內(nèi)對(duì)于三聚氰胺的分析方法大多集中在對(duì)三聚氰胺單一化合物的分析[2-4]。隨著西方發(fā)達(dá)國(guó)家在對(duì)寵物食品產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果表明除三聚氰胺以外[5]，其類似物——三聚氰胺二酰胺、三聚氰胺一酰胺及三聚氰酸的存在也會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物及人體受到健康威脅[6]。研究表明除去人為添加因素，目前唯一能直接帶入到食品中的途徑是通過(guò)食品包裝材料。發(fā)生這一現(xiàn)象的原因與三聚氰胺在工業(yè)上被廣泛應(yīng)用有關(guān)[7]。世界各國(guó)特別是美國(guó)、歐盟、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家的分析與研究結(jié)果表明，與食品接觸的器皿、餐廚具和包裝容器以及包裝材料中有害元素、有害物質(zhì)會(huì)遷移至食品中，這一現(xiàn)象已成為人們對(duì)食品安全一個(gè)新的關(guān)注點(diǎn)[8]。針對(duì)這一事實(shí)，歐盟早在2002年就在DirectiveECNo2002/72中規(guī)定，三聚氰胺及其類似物在食品接觸材料中的遷移量不超過(guò)30mg/kg[9]，我國(guó)于2009年9月1日實(shí)行的GB9690-2009《食品容器、包裝材料用三聚氰胺-甲醛成型品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定三聚氰胺單體遷移量為0．2mg/dm2(條件為4%乙酸水，60℃，2h)[10]。而我國(guó)目前針對(duì)食品容器中三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰胺二酰胺的有關(guān)報(bào)道很少，多集中在對(duì)三聚氰胺的遷移進(jìn)行的報(bào)道[11-13]。

本研究依據(jù)GB23296.1-2009中規(guī)定的四種食品模擬物進(jìn)行三聚氰胺及其類似物的遷移試驗(yàn)[14]。通過(guò)試驗(yàn)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，如果嚴(yán)格按照相關(guān)國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)條件對(duì)包裝容器進(jìn)行檢測(cè)，一般不會(huì)發(fā)生三聚氰胺遷移或遷移量很小，但是如果按照食品生產(chǎn)過(guò)程中要使用的溫度條件對(duì)同樣的包裝材料進(jìn)行前處理，會(huì)發(fā)生三聚氰胺遷移，而且采用不同的提取溶劑其遷移量會(huì)有不同程度的變化，這將為食品行業(yè)帶來(lái)一定的安全隱患。因此本試驗(yàn)結(jié)果不僅可以為食品包裝材料生產(chǎn)企業(yè)、食品生產(chǎn)加工企業(yè)提供一定的技術(shù)支持，而且為食品中三聚氰胺及其類似物的非人為添加來(lái)源研究提供最新試驗(yàn)數(shù)據(jù)，為相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)改進(jìn)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和試劑

高效液相色譜儀：LC-30AD型，日本島津公司；

三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：8030型，日本島津公司；

高速冷凍離心機(jī)：RT15T高速冷凍離心機(jī)，上海天美公司；

氮吹儀：美國(guó)Organomaion Assiciates公司；

超聲波水浴器：德國(guó)IKA公司。

甲醇、乙腈、乙酸、乙醇：色譜純；

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自瑞士Fluka公司，純度≥99.0%;

三聚氰酸標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自瑞士Fluka公司，純度≥98.0%;

三聚氰酸一酰胺標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，純度≥99%;

三聚氰酸二酰胺標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自瑞士Fluka公司，純度≥97.7%。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的儲(chǔ)備液：分別稱量10.0mg(精確到0.1mg)的標(biāo)準(zhǔn)品，三聚氰胺(MEL)、三聚氰酸(CYA)、三聚氰酸一酰胺(ADE)和三聚氰酸二酰胺(ANE)用二乙胺+水(20+80)溶液進(jìn)行溶解，并用乙腈水(50+50)溶液配成濃度均為1000μg/mL的溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：分別移取四種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0mL于100mL容量瓶中，用提取劑定容，充分搖勻，配制濃度為10.0μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)液的中間溶液。0℃～4℃冷藏避光保存，有效期1個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線：用流動(dòng)相將三聚氰胺及其類似物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成濃度為10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用混合溶液，再逐級(jí)稀釋得到三聚氰胺濃度為0.5μg/L，1.0μg/L，5μg/L，10μg/L，20μg/L，50μg/L，；三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺濃度為1.0μg/L，5.0μg/L，10μg/L，20μg/L，50μg/L，100μg/L；三聚氰酸二酰胺濃度為2μg/L，10μg/L，20μg/L，40μg/L，80μg/L，160μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品

空白罐體由兩個(gè)廠家提供,均為金屬罐體。

1.2.2 食品模擬物的選擇

本實(shí)驗(yàn)中選取了水、65%乙醇水、4%乙酸水及橄欖油標(biāo)準(zhǔn)品作為食品模擬物。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 浸泡條件

本次試驗(yàn)中選取水、65%乙醇水、4%乙酸及橄欖油作為食品模擬物，各取四種模擬物250mL于金屬罐中，將金屬罐放于生產(chǎn)流水線中密封并模擬生產(chǎn)過(guò)程，其后選取裝有橄欖油的金屬罐置于95℃下浸泡24h，其他三種模擬物的金屬罐置于70℃下浸泡2h。之后取出各種提取液待測(cè)。

1.3.2 樣品前處理

將1.3.1中得到的水、65%乙醇水、4%乙酸三種模擬物混勻后用0.22μm的有機(jī)濾膜直接過(guò)膜進(jìn)樣品瓶中，待分析；準(zhǔn)確稱取橄欖油模擬提取物5.0g，先加入5mL異辛烷，充分混合，后加入5mL10%異丙醇，70℃水浴振蕩40min，離心，分層，取下層，過(guò)0.22μm的有機(jī)濾膜，裝入樣品瓶中待測(cè)。

1.3.3 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC柱(50mm×2.1mm，1.7μm);流動(dòng)相:10mmol/L乙酸銨水溶液+乙腈，洗脫條件見(jiàn)表1，為梯度洗脫，流速為0.3mL/min;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:1μL。

表1 HPLC梯度洗脫條件

1.3.4 質(zhì)譜條件

實(shí)驗(yàn)采取電離方式是電噴霧電離，掃描方式是正離子模式和負(fù)離子模式同時(shí)掃描：離子噴霧電壓:4kV;霧化氣和干燥氣均為氮?dú)?，霧化氣壓力為0．28MPa;干燥氣流速:15L/min，霧化器流速：3L/min；溫度400℃;碰撞氣為氮?dú)猓瑝毫?．2MPa;掃描方式為多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件優(yōu)化

三聚氰胺及其類似物的相對(duì)分子質(zhì)量較小，而且分子結(jié)構(gòu)均含有氨基，具有較強(qiáng)的極性和親水性，因此很難在傳統(tǒng)的C8和C18反相色譜柱有所保留，而對(duì)于常用來(lái)分離三聚氰胺的強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱利用的是陽(yáng)離子交換和反相保留的機(jī)理，但也僅對(duì)三聚氰胺類陽(yáng)離子化合物有很強(qiáng)的保留，對(duì)于三聚氰酸不能保留[16]。親水作用分離色譜是一種能夠針對(duì)極性化合物分離的理想的方法，在親水色譜系統(tǒng)中，有機(jī)溶劑為弱洗脫溶劑，水溶劑為強(qiáng)洗脫溶劑[17]。該實(shí)驗(yàn)則采用了Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC柱、選取乙酸銨緩沖溶液作為水相，乙腈作為有機(jī)相進(jìn)行分離優(yōu)化，并通過(guò)降低乙腈的比例來(lái)實(shí)現(xiàn)親水色譜柱對(duì)于物質(zhì)的保留，而結(jié)果顯示，三聚氰酸因其結(jié)構(gòu)特性會(huì)最先出峰，隨著乙腈比例的不斷變化，三聚氰胺和三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺的分離峰形尖銳。因此得到的梯度洗脫條件可以在1.5分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)四種物質(zhì)的分離。其TIC總離子流圖可見(jiàn)圖1所示。

圖1 三聚氰胺及其類似物的TIC總離子流圖

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別對(duì)三聚氰胺及其類似物在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行了母離子全掃描，仔細(xì)分析所得到的一級(jí)質(zhì)譜圖分析得出，三聚氰胺正離子模式下的離子峰強(qiáng)度比負(fù)模式下離子峰強(qiáng)度高出2-3個(gè)數(shù)量級(jí)，而三聚氰酸則不同，三聚氰酸一酰胺和三聚氰胺二酰胺在正負(fù)模式下的分子離子峰的強(qiáng)度相差不大，于是最終選定在正模式下進(jìn)行試驗(yàn)。三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰胺二酰胺的母離子峰分別為m/z 127.1、m/z 127.85、m/z 129.1、m/z128.1，再分別對(duì)母離子進(jìn)行子離子掃描，選擇豐度最強(qiáng)的碎片離子m/z85.00、m/z41.90、m/z87.00、m/z86.00作為定量離子，其MRM圖2中所示。具體的質(zhì)譜分析多反應(yīng)檢測(cè)條件見(jiàn)表2所示：

表2 三聚氰胺及其類似物的MRM監(jiān)測(cè)條件

圖2 三聚氰胺及其類似物的MRM質(zhì)譜圖及子離子掃描圖

2.3 線性方程與檢出限

配制三聚氰胺及其衍生物系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，并按照前述方法進(jìn)行處理和測(cè)定。以被分析目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，分別得到MEL，ANE，ADE和CYA的檢出限、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和線性方程，詳見(jiàn)表3中。

表3 不同模擬物中三聚氰胺及其衍生物的檢出限及線性方程

2.4 提取溶劑的選擇與實(shí)際罐體的測(cè)定

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB9690-2009、GB/T23296.1-2009的遷移實(shí)驗(yàn)列表中，選取了四種模擬物(水、65%乙醇水、4%乙酸水及橄欖油)于70℃浸泡2h的替代試驗(yàn)條件，而由于三聚氰胺單體的遷移量，尤其在橄欖油中的遷移量較低，使用已有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)食品模擬物中的三聚氰胺單體分析時(shí)，測(cè)定下限較高，大部分的遷移測(cè)定結(jié)果都處于未檢出的狀態(tài)，為了更好的研究金屬罐中三聚氰胺及其類似物的遷移研究，將橄欖油中遷移實(shí)驗(yàn)的浸泡溫度升至95℃并延長(zhǎng)浸泡溫度至24h，通過(guò)對(duì)四種溶劑中三聚氰胺及類似物的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3所示，可以得出65%乙醇水在對(duì)罐體中對(duì)三聚氰胺及其類似物的提取效果最好，可以用來(lái)對(duì)金屬罐體進(jìn)行篩選研究。

通過(guò)65%乙醇水對(duì)金屬罐體中三聚氰胺及其類似物的提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，金屬罐體的內(nèi)壁三聚氰胺涂層中可以檢出有微量的三聚氰胺，而并未檢出三聚氰酸和三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺，從而可以推斷出食品用帶三聚氰胺涂層的金屬罐體在生產(chǎn)的過(guò)程中不會(huì)產(chǎn)生三聚氰胺的類似物。而三聚氰胺的遷移量也因生產(chǎn)廠家不同，含量有所不同。

表4 不同提取溶劑對(duì)實(shí)際金屬罐中三聚氰胺及其類似物的測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：N.D.表示未檢出,當(dāng)檢驗(yàn)結(jié)果低于檢出限時(shí)均為未檢出。

3 結(jié)論

通過(guò)應(yīng)用本方法針對(duì)金屬罐內(nèi)層涂料的三聚氰胺及其類似物進(jìn)行檢測(cè)，找到了適合檢測(cè)的最佳提取試劑，并發(fā)現(xiàn)確實(shí)存在三聚氰胺的遷移，而其它其類似物并未發(fā)現(xiàn)有殘留，這不僅說(shuō)明了市售飲料灌裝用的金屬罐存在著將三聚氰胺遷移至飲料中的危險(xiǎn)，同時(shí)也印證了飲料生產(chǎn)過(guò)程由于不存在三聚氰胺向類似物轉(zhuǎn)化的條件而并未檢出三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺。因此，可提醒廣大飲料企業(yè)在選擇金屬罐的過(guò)程中要關(guān)注涂層中三聚氰胺的含量，并應(yīng)該嚴(yán)格控制生產(chǎn)過(guò)程中的各個(gè)環(huán)節(jié)，防止三聚氰酸等類似物的出現(xiàn)進(jìn)而危害消費(fèi)者的健康。

[1] TSAI I L,SUN S W,LIAO H W,et al.Rapid analysis of melamine in infant formula by sweeping micellar electrokinetic chromatography[J].J Chromatogr A, 2009,1216(47):8296-8303.

[2] Wang jinyan, JIANG Lianmei,CHU Qingcui,et al. Residue analysis of melamine in milk products by micellar electrokinetic capillary chromatography with amperometric detection[J].Food Chemistry,2010,121(1):215-219.

[3] Dorne JL, Doerge DR,Vandenbroeck M,et.al.Rencent advances in the risk assessment of melamine and cyanuric acid in animal feed[J].Toxicol Appl Pharmacol,2013,270(3):218-229.

[4] Chik Z,Haron DE,Ahmad ED et al.Analysis of melamine migration from melamine food contact articles.[J].Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess,2011,28(7):967-973.

[5] HELLER DN, NOCHETTO CB.Simultaneous determination and confirmation of melamine and cyanuric acid in animal feed by witterionic hydrophilic interaction chromatography and tandem mass spectrometry[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,2008,22(22):3624-3632.

[6] EHLING S,TEFERA S,HO IP.High-performance liquid chromatographic method for the simultanous detection of the adulteration of cereal flours with melamine and related triazine by-products ammeline,ammelide,and cyanuric acid[J].Food Additives and Contaminants,2007,24(12):1319-1325.

[7] 井偉，陳旻實(shí),李小晶,等.HPLC同時(shí)檢測(cè)食品接觸材料中三聚氰胺與三聚氰酸單體遷移量[J].分析試驗(yàn)室，2011, 30(4): 34-38.

[8] 尹中,韋何雯.高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定灌裝飲料罐內(nèi)涂層中三聚氰胺的遷移量[J].化學(xué)分析計(jì)量,2011,20(4):86-88.

[9] 徐彥輝,陳戈,顧亮，等.金屬罐內(nèi)層涂料三聚氰胺遷移量的測(cè)定[J].包裝與食品機(jī)械,2011,29(3):66-68.

[10] 《食品容器、包裝材料用三聚氰胺-甲醛成型品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》GB9690-2009.

[11] Wu YN,Zhao YF,Li JG; A survey on occurrence of melamine and its analogues in tainted infant formula in China.[J].Biomed Environ Sci,2009,22(2):95-99.

[12] 王紅松, 陳燁,劉君峰.金屬食品包裝罐中三聚氰胺遷移規(guī)律的研究[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊,2011,21(8):2085-2086.

[13] 林華,陳長(zhǎng)虹,李小晶,等.食品及食品接觸材料中三聚氰胺及其類似物色譜檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)，2012, 33(23):380-388.

[14] 《食品接觸材料 塑料中受限物質(zhì) 塑料中物質(zhì)向食品及食品模擬物特定遷移試驗(yàn)和含量測(cè)定方法以及食品模擬物暴露條件選擇的指南》GB23296.1-2009.

Determination of melamine and analogues in Food contact materials by liquid chromatography tandom mass spectrometry

ZHANG Lei-lei，XIA Jing，GUAN Shu-hui，ZHANG Jing，ZHANG Yan
(1.HebeiFoodInspectionAndResearchInstitute，HebeiFoodSafetyKeyLaboratory，ShijiazhuangHebei050091,China;2.HebeiGuanzhuoDestingTechnologyCo,LtdShijiazhuangHebei050091,China)

A new method using liquid chromatography Tandom Mass Spectrometry to analyse migration of melamine, cyanuric acid, ammelide cyanuric acid amide in metal tank inner coatings.Through a series of experiments to simulate metal filling beverage production process with different extraction solution, we got a conclusion that it will cause migration of melamine in the food producing, packaging and sterilization.The electrospray ionization source in positive and negative ion mode was used for multiple reaction monitoing mode.These four componnts showed good liner relationships with the correlation coefficients more than 0.995.The limits of detection were all in the range of 5.0～25μg/L.These will bring food safety problem which can not be ignored.The experimental results showed that melamine can be detected but its analogues does not exsit in the tank.

Melamine; Melamine analogues; Liquid chromatography-tandem mass spectrometry

2017-05-12

張雷雷(1977-),男，山西長(zhǎng)治市人，主要從事食品安全檢測(cè)技術(shù)研究.

張 巖，E-mail:zhangyan@nepp.con.cn

1001-9383(2017)02-0052-09

O657.6

A