李永格

(南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部， 河南 南陽473000)

·實驗研究·

香菇多糖對肝癌細胞Huh7.5.1增殖的影響*

李永格

(南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部， 河南 南陽473000)

目的：探討香菇多糖對肝癌細胞Huh7.5.1增殖的影響及其機制。方法：采用MTT法檢測6.25，12.5，25，50，100 mg/L香菇多糖分別作用肝癌細胞24，48，72 h后，肝癌細胞增殖抑制率變化；qRT-PCR檢測100 mg/L香菇多糖處理肝癌細胞48 h后，微小RNA138(miR-138)表達變化。結(jié)果：細胞的增殖抑制率隨香菇多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增高、作用時間的延長呈依賴性升高；相同作用時間，12.5，25，50，100 mg/L香菇多糖組的細胞增殖抑制率較6.25 mg/L組明顯升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的香菇多糖組48 h、72 h的細胞增殖抑制率較同組內(nèi)24 h明顯升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；100 mg/L香菇多糖作用48 h后肝癌細胞抑制率為(50.36±5.13)%，作為后續(xù)實驗質(zhì)量分?jǐn)?shù)和作用時間。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，100 mg/L香菇多糖處理肝癌細胞48 h后，miR-138表達明顯高于對照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：香菇多糖能夠抑制肝癌細胞增殖，可能是通過提高肝癌細胞miR-138表達實現(xiàn)的。

香菇多糖/藥效學(xué)；肝癌；微小RNA138；細胞增殖抑制率

原發(fā)性肝癌是常見的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升，在我國每年新發(fā)生的肝癌病例約占總數(shù)的一半，病死率在惡性腫瘤中居第二位[1]。肝癌起病隱匿，確診時已到達疾病晚期或已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，治療困難。中藥在防治肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，改善中晚期患者癥狀，延長生存期方面具有明顯優(yōu)勢。香菇多糖(lentinan，LNT)為香菇子實體細胞壁的結(jié)構(gòu)成分，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗病毒等多種生物活性[2-3]。LNT已在肝癌治療中發(fā)揮作用，但作用機制尚不清楚。本研究通過LNT體外作用于Huh7.5.1肝癌細胞，觀察肝癌細胞增殖變化，qRT-PCR檢測miR-138表達，從微小RNA(microRNAS，miRNAs)角度探討LNT對肝癌作用機制，為LNT抗肝癌的作用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人肝癌細胞系Huh7.5.1購自上海中科院細胞庫，本課題組保存。

1.2 藥品、試劑及儀器

香菇多糖為南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校國家中藥分析實驗室惠贈，批號1541023。四甲基偶氮唑鹽(MTT)，購自美國Sigma公司，批號1602013；100 mL/L 胎牛血清(1600123)、DMEM培養(yǎng)基(1600123)，均為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；RIPA裂解液，南京生興生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號1605032；Hairpin-itTM miRNAs RT-PCR quantitation Kit(批號1603215)、U6 snRNA Real time RT-PCR nomallization Kit(批號1603215)，均為上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純。680酶聯(lián)檢測分析儀，美國伯樂公司產(chǎn)品；ABI7500熒光定量PCR儀，ABI公司產(chǎn)品。

1.3 細胞培養(yǎng)

將人肝癌細胞系Huh7.5.1培養(yǎng)在100 mL/L 胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、50 mL/L CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取生長良好并處于對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 MTT法檢測LNT對細胞增殖抑制率的影響

取處于對數(shù)生長期的肝癌細胞接種于96孔板中(2×103個/孔)，細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，分別用預(yù)先制備好的含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(100，50，25，12.5，6.25 mg/L)LNT的安全培養(yǎng)液200 μL孵育，設(shè)為LNT組，每個質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)5個復(fù)孔。對照組加不含LNT的DMEM培養(yǎng)液200 μL。分別孵育24，48和72 h后，每孔加20 μL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸去上清后，加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)溶液，水平振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀中，以波長為490 nm測定每孔光密度(D值)。重復(fù)測定4次，計算細胞生長抑制率。抑制率(%)=(1-DLNT組/D對照組)×100%

1.4.2 qRT-PCR檢測細胞miR-138表達量

根據(jù)1.4.1結(jié)果選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 mg/L LNT處理48 h肝癌細胞和對照組細胞，進行qRT-PCR實驗。Trizol法提取肝癌細胞總RNA，參照試劑盒說明書合成cDNA，其具體反應(yīng)體系為20 μL：2 μL總RNA，1.25 μL特異性莖環(huán)引物，0.5 μL逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV)，0.5 μL RNA酶抑制劑，1 μL dNTP以及4 μL逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，補DEPC水配成20 μL反應(yīng)體系。充分混勻后按17 ℃ 30 min，45 ℃ 30 min，85 ℃ 10 min體系進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后立即將cDNA產(chǎn)物快速置冰上冷卻。以cDNA為模板，利用miR-138特異性引物和染料分子SYBR Green進行PCR擴增。其反應(yīng)體系如下(20 μL)：2 μL cDNA模版，10 μL SYBR Green反應(yīng)緩沖液，1 μL正向引物(10 μmol/L)，1 μL反向引物(10 μmol/L)，6 μL ddH2O。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參，所有檢測結(jié)果均采用2-ΔCt的方法進行分析。反應(yīng)中所使用引物序列設(shè)計如表1。

表1 miR-138以及內(nèi)參U6引物序列

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)LNT對Huh7.5.1細胞增殖的影響

LNT對Huh7.5.1細胞增殖有明顯抑制作用，且表現(xiàn)為量效、時間依賴性：在同一時間點，藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，細胞增殖抑制率越高；同一質(zhì)量分?jǐn)?shù)藥物作用，時間越長，細胞增殖抑制率越高。相同作用時間，12.5，25，50，100 mg/L香菇多糖組的細胞增殖抑制率較6.25 mg/L組明顯升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的香菇多糖組48 h、72 h的細胞增殖抑制率較同組內(nèi)24 h明顯升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；且100 mg/L LNT作用48 h后，細胞生長出現(xiàn)半抑制，故選擇100 mg/L LNT作用48 h來進行后續(xù)研究。見表2。

組 別細胞增殖抑制率24h48h72h香菇多糖6.25mg·L-1組10.51±2.5620.36±2.12#27.36±2.31##香菇多糖12.5mg·L-1組14.53±3.62*26.12±2.13*#36.21±4.32*##香菇多糖25mg·L-1組19.52±4.36**32.13±4.32**#46.35±5.23**##香菇多糖50mg·L-1組26.03±3.02**40.12±5.01**#57.18±6.28**##香菇多糖100mg·L-1組35.08±5.01**50.36±5.13**#70.13±6.96**##

注:與同一時間點香菇多糖6.25 mg·L-1組對比，*P<0.05，**P<0.01；與同組內(nèi)24 h作用時間對比，#P<0.05，##P<0.01。

2.2 LNT作用后miR-138表達量變化

100 mg/L LNT組Huh7.5.1細胞miR-138的相對表達量是對照組細胞(3.05±0.21)倍，顯著高于對照組細胞(P<0.05)。提示：100 mg/L LNT可提高Huh7.5.1細胞miR-138表達。

3 討 論

肝癌臨床治療以手術(shù)切除及肝臟移植為主要方法，但治療效果并不理想，術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是影響肝癌預(yù)后的重要因素，阻礙肝癌患者的長期生存，導(dǎo)致其5年生存率不足5%[4-5]。LNT為香菇的子實體中提取的一組多糖成分，在肝癌治療中已經(jīng)得到認(rèn)可。實驗研究[6-8]表明LNT對肝癌細胞增殖有抑制作用，其機制集中在免疫調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡；臨床研究[9-10]也表明LNT聯(lián)合5-Fu，LNT配合肝動脈化療塞仃都能明顯提高肝癌治療療效。本實驗通過MTT法檢測肝癌細胞增殖，發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)LNT對Huh7.5.1細胞增殖有明顯抑制作用，且表現(xiàn)為量效、時間依賴性，與其他學(xué)者研究結(jié)果相符。

miRNAs為一種內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，研究發(fā)現(xiàn)其與肝癌密切相關(guān)[11]。近年研究[12]表明miRNAs廣泛參與中藥抗腫瘤作用，因此本實驗選擇從miRNAs角度探討LNT對肝癌作用機制。miR-138是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類具有腫瘤抑制作用的miRNA，可通過靶向多個癌基因抑制腫瘤生長，如miR-138能夠靶向調(diào)控PDK1基因抑制人結(jié)腸癌SW620細胞侵襲抑制[13]；也能通過抑制靶基因hTERT蛋白的表達來抑制人胃腺癌細胞SGC-7901增殖能力[14]；這些結(jié)果表明，miR-138是一種重要抑癌miRNA。研究發(fā)現(xiàn)miR-138在肝癌患者腫瘤組織中表達水平下調(diào)[15]，且Huang[16]和Wang[17]等發(fā)現(xiàn)miR-138可通過靶向作用于cyclin D3誘導(dǎo)肝癌細胞周期阻滯，進而影響肝癌細胞生物學(xué)行為和臨床肝癌患者預(yù)后。說明miR-138在肝癌中也同樣可以發(fā)揮抑癌基因的作用。本實驗通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)LNT組肝癌細胞miR-138表達明顯高于對照組(P<0.05)，表明LNT可上調(diào)肝癌細胞miR-138表達，抑制細胞增殖。

綜上所述，香菇多糖能抑制肝癌細胞增殖作用，其機制可能是提高了肝癌細胞miR-138的表達。此為LNT治療肝癌提供了新思路。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2017)05-0072-03

R735.7

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.05.31

河南省高等學(xué)校重點科研項目計劃(13B310176)；南陽市科技攻關(guān)項目(2015KJGG020)

2017-03-14；

2017-05-03