潘開瑞，崔 琳，張振巍，劉衛(wèi)紅

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2.解放軍第一五五醫(yī)院，河南 開封 475000)

·實驗研究·

遠志酊對小鼠腦神經(jīng)遞質(zhì)及氧化應(yīng)激作用的研究*

潘開瑞1，崔 琳1，張振巍2，劉衛(wèi)紅1

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2.解放軍第一五五醫(yī)院，河南 開封 475000)

目的：通過觀察遠志酊對小鼠腦神經(jīng)遞質(zhì)及氧化應(yīng)激作用，探討其抗抑郁作用機制。方法：取小鼠隨機分為正常對照組，鹽酸氟西汀組，遠志酊低、中、高劑量組5組，每組10只。遠志酊低、中、高劑量組依次10，20，40 μL/g，鹽酸氟西汀組給藥劑量15 mg/g，正常對照組給予等容積生理鹽水(20 μL/g)。連續(xù)灌胃給藥7 d，在末次給藥30 min后進行強迫游泳實驗和強迫懸尾實驗；采用酶聯(lián)免疫法測定小鼠5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量。結(jié)果：①與鹽酸氟西汀組對比，遠志酊高劑量組小鼠強迫游泳實驗、懸尾實驗不動時間差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，遠志酊中、低劑量組則差別明顯(P<0.05)。②與正常對照組對比，鹽酸氟西汀組和遠志酊高、中劑量組SOD活性升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；遠志酊低劑量組SOD含量低于正常對照組，說明該劑量對抑郁小鼠腦組織SOD活性作用稍弱。與正常對照組對比，各藥物組MDA含量下降，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。③與正常對照組對比，除遠志酊低劑量組外，鹽酸氟西汀組、高劑量組和中劑量組小鼠腦組織中NE、5-HT、DA含量均有顯著性差別(P<0.05)；與鹽酸氟西汀組對比，高劑量組小鼠腦組織NE、5-HT含量差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，DA則明顯偏低(P<0.05)；中、低劑量組小鼠腦組織NE、5-HT、DA 3個指標(biāo)含量與鹽酸氟西汀組對比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：遠志酊有抗抑郁作用，且與劑量呈依賴關(guān)系；其抗抑郁作用機制可能與增加腦組織內(nèi)單胺神經(jīng)遞質(zhì)含量有關(guān)，可校正腦組織自由基系統(tǒng)失衡。

遠志酊/藥效學(xué)；抗抑郁；單胺類神經(jīng)遞質(zhì)；抗氧化

遠志為臨床常用中藥，為遠志科(Polygalaceae)遠志屬(Polygala)植物遠志(Polygalatenuifolia)或卵葉遠志(PolygalasibiricaL.)的干燥根。遠志酊為遠志流浸膏經(jīng)加工制成的酊劑，而遠志流浸膏為600 mL/L乙醇滲濾提取濃縮而得，流浸膏和酊劑兩個品種均被2010版《中國藥典》一部中成藥目錄所收載，其臨床適應(yīng)證為祛痰藥。筆者在臨床使用中發(fā)現(xiàn)，含有遠志酊的復(fù)方制劑有抗抑郁作用。經(jīng)文獻查閱，有關(guān)遠志醇提物的抗抑郁作用確有報道[1,2]，并有研究顯示遠志蔗糖酯類、寡糖酯類、皂苷類等組分50%醇提物有明顯的抗抑郁作用[3]?！吨袊幍洹分羞h志酊采用600 mL/L乙醇提取、濃縮制成流浸膏，再用600 mL/L乙醇稀釋而成。為進一步考察遠志酊劑的抗抑郁作用。本研究采用抑郁模型對其抗抑郁藥效進行評價，以期為進一步考察其抗抑郁活性成分提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動 物

昆明種小鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量17～22 g，由河南省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(豫)2013-0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

遠志酊，廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司產(chǎn)品，批號KS40017；鹽酸氟西汀，上海中西制藥有限公司產(chǎn)品，批號140826。試劑均為分析純。多巴胺(DA)檢測試劑盒(批號20140721)、5-羥色胺(5-HT)檢測試劑盒(批號20140205)、去甲腎上腺素(NE)檢測試劑盒(批號20140205)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(批號20131216)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(批號20140217)，均為美國R&D公司產(chǎn)品。梅特勒-托利多AB135-S雙量程電子天平，產(chǎn)地瑞典；AB10200ADT超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；HH恒溫水浴鍋，江蘇金壇市中大儀器廠產(chǎn)品。

1.3 動物分組與給藥

參照文獻方法[4]。將小鼠隨機分為正常對照組，鹽酸氟西汀組，遠志酊低、中、高劑量組5組，每組10只。給藥劑量由人臨床常規(guī)用量換算成小鼠用量：遠志酊低、中、高劑量組依次10，20，40 μL/g，鹽酸氟西汀組15 mg/g，正常對照組給予等容積生理鹽水(20 μL/g)。連續(xù)灌胃7 d，1 d 1次。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 強迫游泳實驗

末次給藥30 min后，將小鼠放入水深10 cm的水桶(直徑30 cm、高50 cm)中，水溫(25±0.5) ℃。小鼠在其中游泳6 min。記錄后4 min小鼠不動的時間。小鼠在水中停止掙扎、漂浮狀態(tài)或僅有細小的肢體運動時的時長為小鼠的不動時間。

1.4.2 強迫懸尾實驗

強迫游泳結(jié)束后，小鼠適應(yīng)性間歇30 min，進行強迫懸尾實驗。將小鼠尾尖部約1 cm用膠布貼于懸尾箱(30 cm×30 cm×25 cm)支架上，使小鼠呈倒掛狀態(tài)，頭部離箱底約5 cm，懸掛時間為6 min。記錄后4 min內(nèi)懸尾累計不動時間。小鼠停止掙扎或無任何活動時的時長為小鼠的不動時間。

1.4.3 腦組織中5-HT、DA、NE、MDA、SOD含量

強迫懸尾實驗結(jié)束后，立即處死小鼠，在冰臺上迅速剝離全腦，以生理鹽水洗去表面血漬，精密稱定質(zhì)量，按3 mL/g加入生理鹽水，勻漿制成腦組織勻漿液，高速離心后，取上清液進行酶聯(lián)免疫吸附實驗，分別測定腦組織中的5-HT、DA、NE、MDA、SOD的含量，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠強迫游泳實驗、懸尾實驗對比

與正常對照組對比，各藥物組強迫游泳實驗、懸尾實驗不動時間均縮短，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與鹽酸氟西汀組對比，遠志酊高劑量組小鼠強迫游泳實驗、懸尾實驗不動時間差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而中、低劑量組差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表1。

組 別動物數(shù)強迫游泳實驗不動時間/s懸尾實驗不動時間/s正常對照組10108.06±6.58118.78±7.59鹽酸氟西汀組1063.15±5.73*47.75±3.87*遠志酊低劑量組1087.70±5.67#99.78±2.54*#遠志酊中劑量組1078.62±4.01*#71.63±5.36*#遠志酊高劑量組1066.86±4.82*52.17±5.24*

注：與正常對照組對比，*P<0.05；與鹽酸氟西汀組對比，#P<0.05。

2.2 各組小鼠MDA、SOD對比

與正常對照組對比，鹽酸氟西汀組和遠志酊高、中劑量組SOD活性升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而遠志酊低劑量組SOD含量低于正常對照組，說明該劑量對抑郁小鼠腦組織SOD活性作用稍弱。與正常對照組對比，各藥物組MDA含量下降，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。遠志酊3個劑量組呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，中、高劑量能改善腦組織SOD活性，糾正體內(nèi)清除自由基損害的系統(tǒng)平衡。見表2。

組 別動物數(shù)SOD/(U·mg-1)MDA/(μmol·g-1)正常對照組1049.87±5.9060.17±5.84鹽酸氟西汀組1074.50±4.25*25.87±2.26*遠志酊低劑量組1045.54±4.18#48.95±3.34*#遠志酊中劑量組1058.64±4.24*#36.91±1.94*#遠志酊高劑量組1069.21±0.72*#31.73±3.33*#

注：與正常對照組對比，*P<0.05；與鹽酸氟西汀組對比，#P<0.05。

2.3 各組小鼠NE、5-HT、DA對比

與正常對照組對比，除遠志酊低劑量組外，鹽酸氟西汀組、高劑量組和中劑量組小鼠腦組織中NE、5-HT、DA含量差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與鹽酸氟西汀組對比，遠志酊高劑量組小鼠腦組織NE、5-HT含量差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，DA則明顯降低(P<0.05)；中劑量組、低劑量組小鼠腦組織NE、5-HT、DA含量較之差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

組 別動物數(shù)NE/(μg·L-1)5-HT/(μg·L-1)DA/(μg·L-1)正常對照組1060.57±1.7975.67±3.9290.49±5.39鹽酸氟西汀組1089.72±4.63*113.89±6.00*121.75±4.30*遠志酊低劑量組1064.69±2.62#82.46±6.94#97.83±2.52*#遠志酊中劑量組1071.62±2.30*#91.59±1.47*#109.28±0.99*#遠志酊高劑量組1084.19±6.12*102.08±1.89*114.38±3.95*#

注：與正常對照組對比，*P<0.05；與鹽酸氟西汀組對比，#P<0.05。

3 討 論

遠志的主要化學(xué)成分為三萜皂苷類，此外還含有少量的糖酯類、生物堿類、黃酮類、香豆素、木脂素類等。遠志酊為遠志藥材的醇提物，主要組分為皂苷類，其次有糖酯類、黃酮類等，其中糖酯類成分可影響抑郁大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因表達。如孫艷等[5]發(fā)現(xiàn)遠志醇提物在給予2.8～5.6 g/kg劑量范圍內(nèi)可通過提高慢性應(yīng)激大鼠海馬各區(qū)BDNF和TrkBmRNA的表達并誘導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，以促進慢性應(yīng)激、HPA軸亢進等所造成損失神經(jīng)元的修復(fù)，改善應(yīng)激抑郁大鼠的狀態(tài)，發(fā)揮抗抑郁作用。近幾年遠志的藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：遠志醇提物的藥理學(xué)活性強度與皂苷類成分相當(dāng)，而且糖酯類成分在遠志藥材中也占有較大比例；推測該類成分可能是抗抑郁作用的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[6]。張璐等[7]采用PK-PD-DI驗證方法對遠志3種提取物(水提物、醇提物、醇提富集物)進行抗抑郁作用對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)遠志的水提物的抗抑郁作用最強，分析可能是水提物中化學(xué)成分種類最多，指標(biāo)成分的含量比醇提及其富集物高，所產(chǎn)生的藥效活性強度最大。

抑郁癥的病因可能與腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)如5-HT、DA、NE等不足有關(guān)，但作用機制目前尚未明了。臨床常用的抗抑郁藥物主要是通過抑制5-HT的再攝取，從而增加突觸后膜部位的神經(jīng)遞質(zhì)濃度而發(fā)揮作用。鹽酸氟西汀為選擇性5-HT再攝取抑制劑，能抑制突觸前膜對5-HT釋放后的再攝取，提高突觸間隙的濃度而發(fā)揮抗抑郁效果。

強迫游泳實驗和懸尾實驗從不同角度為實驗動物的抗抑郁作用研究提供了行為學(xué)指標(biāo)[8]。小鼠在強迫游泳和懸尾實驗中的不動時間長短表現(xiàn)為藥物對抗抑郁的強度大小。兩種實驗條件中小鼠表現(xiàn)出來的不同狀態(tài)，反映了一種被稱之為“行為絕望和扭曲”或“對強壓環(huán)境適應(yīng)的失敗”狀態(tài)，這兩種行為絕望模型被廣泛應(yīng)用于篩選和觀察抗抑郁藥物。自主活動實驗是評價實驗動物運動活性和焦慮情緒的經(jīng)典方法，水平運動反應(yīng)了實驗動物的運動活性，垂直運動反應(yīng)了動物的探索活性[9]。

實驗中小鼠受外界環(huán)境刺激而應(yīng)激性使機體產(chǎn)生大量自由基，而過量的自由基會造成體內(nèi)抗氧化體系的失衡，產(chǎn)生神經(jīng)毒素。SOD是機體阻止自由基產(chǎn)生的重要防御酶，其活性的降低是體內(nèi)自由基防御系統(tǒng)失衡的關(guān)鍵因素。MDA作為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，為自由基損傷的標(biāo)志。因此本研究選擇SOD、MDA作為檢測指標(biāo)。抑郁癥患者的異常情緒均與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)如5-HT、DA、NE有關(guān)，故本研究選擇5-HT、DA、NE作為檢測指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示：從行為學(xué)實驗角度來看，遠志酊3個劑量組均可不同程度地縮短小鼠強迫游泳實驗、懸尾實驗的不動時間，高劑量組與鹽酸氟西汀組作用強度相當(dāng)，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而中、低劑量組較之差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。從腦組織MDA、SOD表達水平角度來看，遠志酊高、中劑量組可明顯升高小鼠腦組織SOD表達、降低MDA表達，提示遠志酊可調(diào)整腦組織中MDA、SOD表達水平，以維持MDA-SOD系統(tǒng)動態(tài)平衡。從腦組織神經(jīng)遞質(zhì)NE、5-HT、DA的表達水平來看，遠志酊可不同程度地回升小鼠腦組織NE、5-HT、DA的表達水平，提示遠志酊抗抑郁作用可能與調(diào)整腦神經(jīng)遞質(zhì)含量有關(guān)，并且該作用強度與遠志酊劑量呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢。

綜上所述，遠志酊可通過調(diào)節(jié)腦組織MDA-SOD氧化平衡系統(tǒng)和腦神經(jīng)遞質(zhì)的表達水平等多種作用途徑提高5-HT神經(jīng)元的興奮性從而達到抗抑郁效果[10]。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2017)05-0069-04

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.05.30

全軍后勤科研計劃(CJN12J005)

2017-01-16；

2017-04-11