馮穩(wěn) 吳新新 郭永軍 常玉喜 夏慶欣

·臨床研究與應(yīng)用·

結(jié)直腸癌中微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與PD-L1表達(dá)的關(guān)系及臨床意義

馮穩(wěn)①吳新新②郭永軍②常玉喜②夏慶欣①

目的：研究PD-L1在結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）中的表達(dá)及臨床意義。方法：選取2015年1月至2016年1月在鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受CRC根治性手術(shù)的患者210例，分為微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（high-frequency microsatellite instability，MSI-H）、微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定（low-frequency microsatellite instability，MSI-L）、微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stable，MSS）3個(gè)組，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組織標(biāo)本中細(xì)胞程序性死亡配體1（Programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）的表達(dá)，分析PD-L1在各型CRC中的表達(dá)特點(diǎn)。結(jié)果：PD-L1在低分化CRC中的表達(dá)高于中、高分化CRC（P＜0.05），PD-L1在MSI-H的CRC中陽(yáng)性率為75.8%，在MSIL/MSS中的陽(yáng)性率為9.3%，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：PD-L1在部分CRC癌組織中陽(yáng)性表達(dá)，尤其是在MSIH的CRC陽(yáng)性率顯著高于MSI-L及MSS的CRC。PD-L1阻斷劑對(duì)MSI-H的CRC患者療效可能更好。

PD-L1 結(jié)直腸癌 免疫組織化學(xué) 臨床意義

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性腫瘤之一，目前其發(fā)病率居全球所有惡性腫瘤的第3位，在中國(guó)的發(fā)病率也呈逐步上升趨勢(shì)［1-2］。除了傳統(tǒng)的手術(shù)和放化療，近年來(lái)分子靶向治療在特定患者人群中表現(xiàn)出顯著的療效。細(xì)胞程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）能夠抑制T細(xì)胞的活化與增殖，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，從而維持機(jī)體的免疫平衡，避免自身的免疫損傷［3-4］。PD-L1抗體可用于治療多種惡性腫瘤如非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌等［4-6］。本研究探討PD-L1在CRC中的表達(dá)及臨床意義，以期為PD-L1在結(jié)直腸癌個(gè)體化精準(zhǔn)治療的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 收集2015年1月至2016年1月在鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受CRC根治性手術(shù)的患者210例臨床資料，手術(shù)前均未接受任何治療，排除標(biāo)準(zhǔn)：遺傳性腺瘤性息肉病及遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌患者。入組患者手術(shù)石蠟組織標(biāo)本，包括210例腫瘤組織、50例癌旁正常組織（距離癌變組織邊緣直徑＞5 cm，術(shù)后切緣病理未見(jiàn)腫瘤細(xì)胞）。本研究得到鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意書(shū)。入組患者的基本資料：男性118例，女性92例；年齡31～85歲，平均年齡63.5歲；右半結(jié)腸（升結(jié)腸和右半橫結(jié)腸）43例，左半結(jié)腸（左半橫結(jié)腸，降結(jié)腸和乙狀結(jié)腸）32例，直腸135例。病理分期標(biāo)準(zhǔn)按照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）/國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）結(jié)直腸癌第7版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)［7］。

1.1.2 取材和病理切片的制備 手術(shù)切除新鮮結(jié)直腸組織標(biāo)本后送病理科，每例患者留取癌組織及癌旁組織標(biāo)本各一塊，以10%福爾馬林固定溶液固定24 h以上，制備石蠟包塊，制作連續(xù)切片厚度4 μm，分別常規(guī)以蘇木素-伊紅（HE）染色、PD-L1免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2 方法

1.2.1 MSI的檢測(cè) 本研究使用MSI檢測(cè)試劑盒檢測(cè)貝斯塔遺傳標(biāo)記（Bethesda Marker）：Bat25、Bat26、D5S346、D2S123和D17S250共5個(gè)位點(diǎn)，正向引物標(biāo)記熒光，對(duì)同一患者的腫瘤組織和正常黏膜組織的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用毛細(xì)管電泳檢測(cè)擴(kuò)增的產(chǎn)物，判斷檢測(cè)的腫瘤組織和正常黏膜組織是否存在微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。5對(duì)引物來(lái)自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）基因庫(kù)，上游引物5'端分別作3種不同顏色的熒光標(biāo)記。相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)采用美國(guó)ABI公司的GS-500LIZ Size Standard內(nèi)標(biāo)。同色引物擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度有別，可同時(shí)對(duì)多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行片段分析，引物序列見(jiàn)表1。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色法 切除的組織標(biāo)本用甲醛溶液固定，石蠟包埋，組織切片的厚度為4 μm，將其置于玻璃片上，用二甲苯脫蠟，在梯度乙醇內(nèi)水化，在900 W微波加熱2 s，進(jìn)行抗原修復(fù)后，于0.3%的H2O2液中浸泡30 min阻斷內(nèi)源性抗原，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗3次，用10%正常的血清阻斷背景非特異性的染色，加一抗置于濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜。一抗為兔抗人PD-L1單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），1:100稀釋。生物素包被的鼠抗兔抗體孵育30 min后使用PBS洗3次，再用親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物孵育30 min，然后使用蘇木素復(fù)染。以正常小鼠的IgG代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn) 本研究使用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)PD-L1在CRC癌組織中的表情況，參考楊軍等［8］的免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果判讀方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷統(tǒng)計(jì)。免疫組織化學(xué)切片由病理科醫(yī)師判讀，PD-L1定位于腫瘤細(xì)胞膜或細(xì)胞漿，當(dāng)所觀察指標(biāo)定位部位出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。直接計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（或面積）占視野下或整張切片內(nèi)同類細(xì)胞數(shù)（或面積）的百分比進(jìn)行分級(jí)。陰性（0）：無(wú)著色；弱陽(yáng)性（+）：任何比例的細(xì)胞呈現(xiàn)微弱、不完整膜著色；陽(yáng)性（++）：＞10%的細(xì)胞呈現(xiàn)弱至中等強(qiáng)度、完整但不均勻膜棕黃著色；強(qiáng)陽(yáng)性（+++）：＞30%的細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)、完整膜棕褐著色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定性資料分析方法主要使用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSI在CRC中的檢測(cè)結(jié)果

與正常結(jié)直腸黏膜對(duì)比，210例CRC癌組織標(biāo)本中MSI-H的發(fā)生率為13.3%，MSI-L的發(fā)生率為0.9%，MSS的發(fā)生率為85.7%，其中28例MSI-H的CRC同時(shí)存在Bat26與Bat25的位點(diǎn)改變，10例存在D2S123位點(diǎn)的改變，11例存在D17S250位點(diǎn)的改變，4例存在D5S346位點(diǎn)的改變，只有2例5個(gè)位點(diǎn)均存在改變（表2）。

2.2 PD-L1在CRC癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)

PD-L1在CRC癌組織的陽(yáng)性率為18.6%，對(duì)照組的50例癌旁正常黏膜PD-L1陽(yáng)性率為6.0%，統(tǒng)計(jì)分析顯示PD-L1在CRC中腫瘤組織的陽(yáng)性率高于癌旁正常組織（P＜0.05，表3，圖1）。

表1 MSI引物及特征Table 1 MST primers and characteristics

表1 MSI引物及特征（續(xù)表1）Table 1 MSI primers and characteristics

表2 CRC的MSI檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection of MSI in CRC

表3 PD-L1在CRC中腫瘤組織與癌旁組織中的表達(dá)Table 3 Expression of PD-L1 in cancer and paracancer tissues of CRC

2.3 PD-L1與CRC臨床病理特征的相關(guān)性

分析顯示PD-L1在CRC中的表達(dá)與性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤部位、組織學(xué)類型、浸潤(rùn)深度和病理分期之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；僅在分化程度上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4，P＜0.05）。

2.4 PD-L1在MSI-H的CRC和MSI-L/MSS的CRC中的表達(dá)情況

在MSI-H的CRC中，PD-L1陽(yáng)性率為75.8%；在MSI-L/MSS的CRC中，PD-L1陽(yáng)性率為9.3%，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表5，P＜0.05）。

圖1 PD-L1在CRC癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)Figure 1 Expression of PD-L1 in cancer and paracancer tissues of CRC

表4 PD-L1與CRC的臨床病理特征關(guān)系Table 4 Relationship of PD-L1 with clincopathological characteristics of CRC

表4 PD-L1與CRC的臨床病理特征關(guān)系（續(xù)表4）Table 4 Relationship of PD-L1 with clincopathological characteristics of CRC

表5 PD-L1在MSI-CRC中的表達(dá)Table 5 Expression of PD-L1 in MSI-CRC

3 討論

CRC是全球常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，與西方國(guó)家相比，CRC在中國(guó)的發(fā)病率相對(duì)較低，但是隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、生活環(huán)境的改變、人民生活習(xí)慣的變化等，該病在國(guó)內(nèi)的發(fā)病率逐年上升，且趨于年輕化［9］。因此，研究CRC的發(fā)病機(jī)制、治療和預(yù)防，對(duì)降低CRC的發(fā)病具有重要的臨床價(jià)值。近幾年來(lái)，隨著對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究不斷深入，對(duì)癌基因和抑癌基因的進(jìn)一步了解，CRC的治療已經(jīng)從外科治療為主、放化療為輔的綜合治療轉(zhuǎn)向了精準(zhǔn)化、個(gè)體化治療理念，應(yīng)運(yùn)而生的生物治療、基因治療、免疫治療越來(lái)越受到重視［10-13］。

本研究結(jié)果顯示，PD-L1在癌組織與正常組織之間表達(dá)存在顯著性差異，PD-L1在癌組織中均存在陽(yáng)性表達(dá)率升高。PD-L1在CRC表達(dá)的臨床病理特征僅與分化程度相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

PD-L1在MSS的CRC中，PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)與MSS的CRC有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P＞0.05），與病理分期無(wú)關(guān)（P＞0.05），但PD-L1在分化程度低的MSS的CRC中陽(yáng)性率顯著高于中、高分化組（P＜0.05）。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)PD-L1在MSS的CRC中陽(yáng)性表達(dá)率為9.3%，而Droeser等［14］研究顯示，PD-L1在MSS的CRC中表達(dá)率為37%，造成這種差異的原因，可能是入組病例數(shù)量過(guò)少，但在PD-L1表達(dá)與腫瘤的低分化，缺少淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征與本研究相同，而對(duì)于病理分期早的特點(diǎn)在本研究中并未得出相同的結(jié)論。

PD-L1是細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵抑制劑，腫瘤細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)可以被免疫微環(huán)境誘導(dǎo)，導(dǎo)致腫瘤的免疫逃避以及預(yù)后不良。Llosa等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在CRC的免疫微環(huán)境中富含活化的Th1、CTL（細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞），在錯(cuò)配修復(fù)中存在缺陷，為了平衡這種活性Th1/CTL的微環(huán)境，MSI CRC選擇性地上調(diào)某些免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)，其中就包括有PD-L1。Rosenbaum等［16］對(duì)結(jié)直腸癌的研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1抑制反應(yīng)與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性相關(guān)。本研究中，MSI-H的CRC患者癌組織中PD-L1中呈高表達(dá)（PD-L1陽(yáng)性為75.8%），與上述研究成果一致，同時(shí)進(jìn)一步證實(shí)了Li等［17］的研究結(jié)果，即PD-L1與CRC患者的預(yù)后有關(guān)。雖然目前國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究較少，但是本研究結(jié)果為這一設(shè)想提供了理論依據(jù)，且相關(guān)的臨床研究仍在繼續(xù)開(kāi)展中。

綜上所述，本研究對(duì)PD-L1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)進(jìn)行了初步研究，證實(shí)PD-L1在部分CRC癌組織中陽(yáng)性表達(dá)，尤其是在MSI-H的CRC患者中其陽(yáng)性率顯著高于MSI-L及MSS的CRC。根據(jù)本研究結(jié)果推論，在臨床實(shí)踐中，PD-L1阻斷劑對(duì)MSI-H的CRC患者療效可能更好。

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（2017-01-13收稿）

（2017-06-22修回）

Relationship between expression of PD-L1 and microsatellite instability of colorectal cancer and its significance

Wen FENG1,Xinxin WU2,Yongjun GUO1,Yuxi CHANG1,Qingxin XIA1

Qingxin XIA;E-mail:13838173710@139.com
1Department of Pathology,The Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450003,China;2Departrment of Molecular Pathology,The Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450003,China

Objective:To investigate the expression and clinical significance of PD-L1 in colorectal cancer(CRC).Methods:A total of 210 CRC patients who accepted radical surgery in our hospital from January 2015 to January 2016 were divided into three groups,namely,high-frequency microsatellite instability(MSI-H),low-frequency microsatellite instability(MSI-L),and microsatellite stable(MSS).The expression of PD-L1 was detected by immunohistochemistry,and the expression characteristics of PD-L1 in different types of CRC were analyzed.Results:CRC cases with low differentiation had a higher expression of PD-L1 than CRC patients with high differentiation(P＜0.05).PD-L1 had a positive rate of 75.8%in the MSI-H group and a rate of 9.3%in the MSI-L and MSS groups,wherein the difference between the two groups was statistically significant(P＜0.05).Conclusion:PD-L1 was positively expressed in some CRC tumor tissues,and its positive rate was significantly higher in MSI-H than in MSI-L and MSS.The therapeutic effect of a PD-L1 blocker for patients with MSI-H CRC might be preferable.

PD-L1,colorectal cancer,immunohistochemistry,significance

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.12.055

①鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（河南省腫瘤醫(yī)院）病理科（鄭州市450003）；②分子病理科

夏慶欣 13838173710@139.com

馮穩(wěn) 專業(yè)方向?yàn)橄篮托夭磕[瘤的病理研究與診斷。

E-mail：manfengwen@126.com