祁怡馨，謝立科，郝曉鳳，張志芳，侯樂，肖文崢，孫會蘭

逍生散顆粒對干眼杯狀細胞影響的臨床研究

祁怡馨，謝立科，郝曉鳳，張志芳，侯樂，肖文崢，孫會蘭

目的評價逍生散對杯狀細胞的影響。方法符合納入標準的30例（60只眼）干眼患者，隨機分為對照組和中藥組。對照組使用玻璃酸鈉滴眼液，每次1滴，每日3次；中藥組使用逍生散顆粒劑：柴胡、白芍、當歸、黨參、五味子、麥冬等。每日2次，每次1袋，溫水沖服。觀察并記錄患者治療前及治療4周后的自覺癥狀、淚液分泌、淚膜破裂時間、熒光素鈉染色、結膜印跡細胞學檢查。結果中藥組患者在自覺癥狀、淚膜破裂時間、淚液分泌及角膜熒光染色、杯狀細胞數量及等級方面具有較為明顯的改善，與治療前相比，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。對照組在自覺癥狀、角膜熒光染色、杯狀細胞數量方面有改善作用，與治療前相比，差異具有統計學意義（P＜0.05），而在淚液分泌、淚膜破裂時間、杯狀細胞等級方面雖有所改善，但差異無統計學意義（P＞0.05）。治療后將中藥組與對照組在自覺癥狀、淚膜破裂時間、淚液分泌、角膜熒光染色、杯狀細胞數量及等級方面進行比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論逍生散顆粒劑可明顯改善患者的自覺癥狀，增加淚液分泌量，延長淚膜破裂時間，提高淚膜穩(wěn)定性，減少杯狀細胞凋亡，減輕眼表損傷等作用。

干眼；逍生散；杯狀細胞；免疫相關性炎癥

干眼是由淚液量、質或流體動力學異常引起淚膜的不穩(wěn)定，可伴有眼表的損害，從而出現眼部的不適，以及視功能障礙之疾病。2007年國際干眼研討小組總結報告目前世界范圍干眼發(fā)病率約在5.5%-33.7%，美國流行病學調查得出48歲以上人群之中14.4%的人群有干眼，日本地區(qū)發(fā)病率約為17.0%，而澳大利亞地區(qū)發(fā)病率約為10.3%。目前我國尚未見干眼流行病學明確的調查研究，基于我國醫(yī)療衛(wèi)生條件及環(huán)境狀況，保守估計目前我國干眼患者大約在1億以上。本病是眼科常見的眼表疾病，主要癥狀為眼干燥感、不適感、異物感，畏光流淚以及視物模糊等，重者可引起角膜炎，嚴重影響患者生活及生存質量。

逍生散為謝立科主任醫(yī)師總結多年臨床經驗，遵循眼科古籍，針對當今發(fā)病之病因病機，以逍遙散、生脈飲作為基本用藥形成的經驗方。逍遙散是疏肝健脾要方，生脈飲是養(yǎng)陰生津良劑，二方合用可潤目生津，疏肝養(yǎng)陰，使肝氣條達，陰津充盛，睛珠滑順，目竅得養(yǎng)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本觀察病例來自于中國中醫(yī)科學院眼科醫(yī)院2015年6月至2016年2月的門診患者，完成該試驗干眼患者共計30例（60只眼），其中女18例（36只眼），男12例（24只眼）；患者年齡在22-56歲；病程2個月到6年。對照組女8例，男7例，試驗組女10例，男5例，兩組患者在性別、年齡及病程等方面差異均無統計學意義（P＞0.05），組間具有可比性。

1.2 診斷、納入及排除標準

診斷標準：參考干眼臨床診療專家共識（2013）：（1）眼部有干燥感、異物感等自覺癥狀；（2）BUT＜5秒；（3）SIT＜5mm/5分鐘；（4）熒光素鈉染色，角膜上皮見散在點狀著色。證型標準：患者具有肝郁陰虛表現，即眼部干澀、不適、異物、燒灼、疲勞感，偶眼紅刺癢、畏光流淚、視物模糊等癥狀；同時伴有情緒煩躁或低落、胸悶脅脹、咽干口苦，五心煩熱等，舌干紅少苔，脈弦細等。

納入標準：（1）符合干眼診斷標準；（2）辨證為肝郁陰虛證者；（3）無嚴重心腦血管及全身疾??；（4）治療期內未進行其他治療；（5）所有納入者均需簽署知情同意書，且通過倫理委員會審核。

排除標準：（1）患有嚴重全身疾病患者、孕婦；（2）血、尿常規(guī)及肝腎功能嚴重異常者；（3）眼部先天性疾病、活動性眼病（如急慢性眼表炎癥、急慢性淚囊炎等）、眼外傷等、眼部手術史。

1.3 分組及治療方法

將符合納入標準的30例（60眼）患者通過隨機數字表分為對照組和試驗組，每組15例。對照組予0.1%玻璃酸鈉滴眼液點眼（日本參天株式會社生產），每日早中晚各1次，每次0.3ml，共用4周；中藥組予逍生散顆粒劑（北京康仁堂藥業(yè)配制），溫水沖服至200ml，早晚兩次空腹溫服，共服藥4周。

1.4 觀察指標

癥狀評分：（1）主要癥狀：眼部干澀。無：0分，偶爾：2分，經常：4分，難忍：6分，總分為0~6分。（2）次要癥狀：包括異物感、疼痛感、畏光流淚、視物疲勞、眼紅、眼癢及分泌物7項。每個癥狀為0~3分，共0~ 21分（表1）。將患者首次及末次就診的癥狀問卷評分進行統計分析。

表1 干眼次要癥狀計分標準

淚膜穩(wěn)定性：為避免其他檢查對本檢查造成干擾，當首行BUT。將患者下穹窿部滴入1%熒光素鈉，于鈷藍光濾光鏡下進行觀察，采用秒表計時。裂隙燈下見淚膜首個黑斑出現就標志淚膜破裂，連續(xù)檢查3次，取其平均值并記錄。

淚液分泌：檢查當在暗室內進行，分表面麻醉前、麻醉后兩步來檢查，具體方法為：5mm×35mm淚液檢測濾紙，將一端折出5mm，放置于下穹隆部中外1/3交界結膜囊內，囑患者雙眼瞼自然閉合，5分鐘后觀察濾紙濕潤長度。之后于結膜囊內滴入1-2滴鹽酸奧布卡因滴眼液，進行表面麻醉，5分鐘后進行檢測，方法同上。分別觀察表面麻醉前后試紙浸濕長度，并進行記錄及存檔。

角膜熒光素染色：采用熒光素鈉眼科檢測試紙，將浸潤熒光素鈉部分蘸濕，將蘸濕部分輕輕接觸受試者角膜或結膜，于鉆藍濾光片下進行觀察。評分采用16分法。將角膜分成4個象限，每個象限單獨計分，無染色為0分，1-30個點狀著色為1分，＞30個點狀著色，但染色未融合為2分，彌散點狀著色為3分，角膜點狀著色出現融合、見絲狀物或潰瘍等為4分。將四個象限分數相加，共計得分為0~16分。

結膜印跡細胞學檢查：（1）濾紙準備：孔徑0.22μm的醋酸纖維素濾紙，將其剪為4mm×5mm梯形小紙片，蒸餾水浸洗4 h，消除濾紙表面活性。室溫晾干后高壓滅菌干燥待用。（2）取材方法：患者坐位或平臥位，鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉3-5min，采用消毒無齒鑷輕夾醋酸纖維素濾膜一角，將粗糙面置于鼻側球結膜，稍加壓5-10 S后取下，放置于95%乙醇中最少固定1小時后行PAS染色。

杯狀細胞數量：目前采取公認的Nelson’s分級方法，其鱗狀上皮細胞之化生分為四個等級；0級（正常）：上皮細胞小而圓，易分辨，核漿比例為1∶1~ 1∶2，杯狀細胞數>500個/mm2。I級（輕度）：上皮細胞多形，較大，較易分辨，其細胞間距較0級大，核漿比例為1∶3，杯狀細胞數為350-500個/mm2。II級（中度）：上皮細胞較大，多形，其分辨較差，細胞間距較大，核漿比例為1∶4~1∶5，杯狀細胞為100-350/mm2。Ⅲ級（重度）：上皮細胞大，多形，多見孤立，核漿比例＞1：6，杯狀細胞的數量嚴重下降甚至消失。于高倍鏡下任意選擇5個觀察視野，0級為0分，I級為1分，II級為2分，Ⅲ級為3分，計算杯狀細胞數目，取其平均數。

1.5 療效指數及分級標準

參考《中醫(yī)病證診斷療效標準》，療效分為顯效、有效、無效三級。顯效：SchirmerⅡ測試3次平均值＞5mm/5分鐘，且療效指數＞70%。有效：淚液分泌較前增加但＜5mm，且療效指數為30%-69%。無效：淚液分泌未見明顯增加，且療效指數＜30%。

1.6 統計分析

使用spss20.0軟件進行統計分析。計量資料描述均采用x±s表示。組間比較采取配對資料t檢驗。計數資料組間的比較采取單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 癥狀評分

治療后對照組及中藥組的自覺癥狀均有所改善，其中對照組由治療前的（14.03±4.01）分降為（10.36±3.94）分（P=0.001），中藥組由治療前（16.06± 3.50）分降為（8.43±2.66）分（P＜0.001），差異均具有統計學意義。中藥組治療后的自覺癥狀積分較對照組低，P=0.03，差異具有統計學意義。

2.2 淚液分泌、淚膜破裂時間、角膜熒光染色（表2）

治療后對照組及中藥組麻醉后的淚液分泌量均有所增加。對照組淚液分泌較前有所增加，但經配對t檢驗，差異無統計學意義（P=0.161＞0.05）；中藥組淚液分泌較治療前增加明顯，差異有統計學意義（P＜0.001）。治療后兩組淚液分泌比較，中藥組淚液分泌較對照組有所增加，差異具有統計學意義（P＜0.001）。兩組治療前后淚膜破裂時間均有所延長，差異均具有統計學意義（P＜0.001）。治療后兩組淚膜破裂時間比較，中藥組淚膜破裂時間較對照組時間有所延長，差異具有統計學意義（P=0.002）。治療后兩組角膜熒光染色情況較治療前均有明顯好轉，差異有統計學意義（P＜0.001）。治療后兩組角膜熒光染色比較，中藥組角膜熒光染色分數較對照組稍低，但差異不具有統計學意義（P=0.128＞0.05）。

表2 兩組干眼患者治療前后淚液分泌、淚膜破裂時間、角膜熒光染色的比較（±s）

表2 兩組干眼患者治療前后淚液分泌、淚膜破裂時間、角膜熒光染色的比較（±s）

注：組內比較采用配對t檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗。

淚液分泌（mm）淚膜破裂時間（S）角膜熒光染色（分）組別眼數（只）治療前治療后治療前治療后治療前治療后對照組30 3.01±1.20 3.47±1.34 3.53±1.18 3.81±1.32 3.13±1.16 1.23±0.85中藥組30 2.83±0.92 4.76±1.11 2.95±1.05 4.85±1.20 3.03±1.18 1.80±0.61 t值1.237-4.033 2.169-3.173 1.072-2.254 P值0.765 0.000 0.826 0.002 0.579 0.286

2.3 結膜印跡細胞學

結膜印跡細胞學檢查可見杯狀細胞深紅色著染，分為分泌端及基底部，其中分泌端為較模糊端（圖1）。治療后對照組及中藥組杯狀細胞數量較治療前均有所增加，對照組數量由（103.10±8.20）個增加為（159.83±9.54）個，中藥組數量由（104.16±6.92）個增加為（191.33±8.10）個，采用配對t檢驗，差異均具有統計學意義（P＜0.001），治療后中藥組杯狀細胞數量較對照組有所增加，差異具有統計學意義（P＜0.001）。在杯狀細胞分級方面，對照組分級由（1.96± 0.80）級降低為（1.56±0.81）級，差異均具有統計學意義（P=0.062），中藥組由（2.03±0.99）級降低為（0.66± 0.60）級，差異均具有統計學意義（P＜0.001），治療后中藥組杯狀細胞等級較對照組有所降低（圖2），差異具有統計學意義（P＜0.001）。

2.4 療效評價

根據自覺癥狀積分和各項檢查結果，得出對照組和中藥組治療后療效指數分別為（29.97±12.98）%及（41.93±14.11）%，中藥組療效指數高于對照組，經獨立樣本t檢驗，P＜0.001，差異有統計學意義。對照組顯效3.33%，有效75.0%，無效21.66%，中藥組顯效6.66%，有效83.33%，無效10.00%。

圖1 光鏡下杯狀細胞形態(tài)，可見細胞深紅色著染，箭頭所指為分泌端。圖2光鏡下結膜印跡學細胞檢查，杯狀細胞分級（0-3級）a：正常組，杯狀細胞結構完整，數量正常；b：輕度干眼，杯狀細胞結構不規(guī)整，數量稍減少；c：中度干眼杯狀細胞結構破壞，數量減少；d：重度干眼，杯狀細胞結構破壞明顯，數量明顯減少（× 400）

3 討論

3.1 杯狀細胞在干眼發(fā)病中的作用及機理

杯狀細胞改變：本試驗中的30例患者，根據Nelson’s分級方法，多為2級-3級之間，其數量為100個/mm2左右，且均存在杯狀細胞損害。治療后對照組Nelson's級別下降，多為1級-2級之間，杯狀細胞數量增多，為159個/mm2左右，仍存在杯狀細胞損害。治療后中藥組Nelson’s級別明顯下降，多在0級-1級之間，杯狀細胞數量明顯增多，為191個/mm2左右，與對照組相比，差異均具有統計學意義。

杯狀細胞損害與干眼相關性：基于免疫的炎癥反應、細胞凋亡、眼表改變、性激素降低，均為干眼發(fā)生及發(fā)展的主要因素[1]。黏蛋白為富含糖鏈的高分子糖蛋白，是淚膜主體，其被淚液中水分所水化，而水化粘液膠含有小分子的有機物、電解質、多種蛋白，脂質層覆蓋于外層[2]。目前共有17種上皮黏蛋白之基因序列可被測定。有研究表明，正常淚液分泌主要受到結膜杯狀細胞的影響，若結膜杯狀細胞功能正常而淚腺功能障礙，則淚液分泌一般不受影響，倘若結膜杯狀細胞功能出現異常，即使淚腺功能正常，淚液分泌也會受到明顯影響，眼部則將出現干燥癥狀[3-4]。Plugfelder等[5]發(fā)現水液缺乏型干眼患者杯狀細胞數量及黏蛋白表達出現明顯下降。有研究者應用高度敏感ELISA以及特異性的抗體，發(fā)現Sj?gren綜合征結膜上皮MUC5ACmRNA表達明顯低于常人，淚液中MUC5AC的蛋白量也較常人偏低[6]。多項研究均表明干眼患者淚膜完整性遭到破壞，黏蛋白分泌量下降[7-9]。因此對結膜杯狀細胞及調節(jié)因素的研究在干眼治療中成為重要內容。

杯狀細胞與干眼治療：當結膜上皮細胞發(fā)生炎癥反應，淋巴細胞所產生的炎癥因子刺激一個或多個信號傳導途徑，激活蛋白激酶C（PKC）致IκB出現磷酸化，并與NFκBp65解離后，p50亞基核定位信號暴露，NF-κB激活并進入細胞核，進而誘導產生基因產物，其協同作用可抑制TNF-α誘發(fā)caspase-8激活，從而可抑制淋巴細胞凋亡，保持淋巴細胞持續(xù)活化[10]。NF-κB活化可以促進炎性因子表達，然而炎性因子表達增強則反過來又可進一步增強NF-κB活性，從而導致炎癥進一步加重。有研究發(fā)現MAPK信號通路可通過激活各靶細胞NF-κB等轉錄因子，從而調控相應基因發(fā)生轉錄激活及產物表達[11]。因此，通過抑制結膜上皮細胞NF-κB活性，從而調控相關基因表達，減輕結膜上皮細胞炎癥反應，促進淋巴細胞凋亡，阻止杯狀細胞凋亡為干眼治療新的靶點之一。

3.2 逍生散釋義及可能作用機理

干眼屬于中醫(yī)學的“白澀癥”“神水將枯”范疇。其病因病機多為脾肺兩經郁熱內伏，津液敷布障礙，或外邪侵襲，致使肺衛(wèi)氣郁不舒，生燥傷津，肺陰不足，不可上榮于目，或因年老體虛，肝腎虧耗，目失濡養(yǎng)。干眼與神水關系密切，發(fā)病與肝郁及陰虛相關。《黃帝內經》曰“肝開竅于目”“目為肝之候”“肝在液為淚”。淚液的生成與肝之疏泄有密切的關系。肝所受藏之精血上輸于目，目受滋養(yǎng)，以維持淚膜正常的功能；反之肝郁不達，陰精化生不足，淚液匱乏，目失濡潤，則神水將枯。逍生散為逍遙散及生脈飲之合方加減，藥物有柴胡、當歸、白芍、五味子、黨參、麥冬等，方中逍遙散為疏肝健脾之首方，生脈飲為養(yǎng)陰生津之良劑，方中柴胡疏肝解郁為君；當歸養(yǎng)血和血，白芍養(yǎng)血斂陰，黨參益肺生津，五味子、生地、麥冬養(yǎng)陰生津共為臣；薄荷一則疏散肝經郁遏之氣，二以透達肝經郁熱，三以引諸藥入肝經，協同甘草調和諸藥以為佐使。全方疏肝養(yǎng)陰、潤目生津；陰津充盛，肝氣條達，則睛珠順滑，目竅得養(yǎng)。

現代藥理學研究顯示，柴胡有顯著抗炎作用，其所含之柴胡皂苷（SS）為抗炎有效成分。柴胡皂苷對滲出、炎癥介質釋放等許多炎癥過程等都具有明顯影響，對機體特異性及非特異性免疫功能均具有調節(jié)作用[12]。白芍有效成分為白芍總苷，可調節(jié)T、B淋巴細胞。近年來國內外多位學者研究發(fā)現白芍總苷可顯著降低大鼠脾淋巴細胞、滑膜細胞、腹腔巨噬細胞之TNF-α、IL-1、IL-2、NO、PGE2分泌。白芍總苷能顯著抑制前列腺素E（PGE）、IL-1、TNF-α、白三烯（LT）等與疼痛感覺相關細胞因子的表達，以達到抗炎效果[13]。生地減低毛細血管通透性，參與血管擴張，抑制血管內皮炎癥，促進淋巴細胞IL-2的產生，增強細胞免疫功能[14]。當歸可以促進TNF-γ、IL-2等細胞因子的表達，可達到抗炎、保肝利膽、保護腎臟、增強免疫功能、清除氧自由基等作用[15]。麥冬主要成分為麥冬皂苷以及麥冬多糖等，其中麥冬多糖有較高的免疫活性，可促進細胞、體液的免疫功能，從而提高血清溶血素抗體水平[16]。黨參中黨參多糖為其主要成分，可增強小鼠巨噬細胞吞噬活性，增強機體整體免疫反應[17]。五味子主要有效成分為五味子多糖，具有較好的免疫興奮作用，可增加免疫抑制小鼠胸腺及脾臟重量，并可明顯對抗環(huán)磷酰胺所導致小鼠白細胞減少，可促進淋巴細胞轉化[18]。薄荷主要有效成分有薄荷醇、薄荷酮及兒茶萘酚酸，均為有效抗炎成分，能抑制3α-羥類固醇脫氫酶表達，具有明顯抗炎作用[19]。

綜上所述，本研究中中藥組患者自覺癥狀有明顯改善，在淚液分泌、角膜染色、淚膜破裂時間及杯狀細胞數量等方面均好轉，且差異均具有統計學意義（P＜0.05）；而對照組在改善癥狀、角膜熒光素鈉染色、淚膜破裂時間、杯狀細胞數目改善方面有較好效果，差異具有統計學意義（P＜0.05）。說明逍生散在改善干眼患者的自覺癥狀、增加淚液分泌、杯狀細胞數量等方面優(yōu)于玻璃酸鈉滴眼液?？赡芘c逍生散顆粒劑具有抗炎作用，在淚膜穩(wěn)定性下降的早期，通過免疫調節(jié)作用[20]，降低或抑制炎性反應強度，減少促炎細胞因子釋放[21]，以影響眼表上皮細胞、淋巴細胞及淚腺之凋亡，并防止杯狀細胞之凋亡以發(fā)揮其藥理作用，從而達到抑制或延緩干眼形成[22-22]，但其具體作用機制尚需進一步研究證實。

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Effectof Xiaosheng Powder on goblet cells in dry eye patient

QIYixin,XIE Like,HAO Xiaofeng,etal.
Eye Hospital,China Academy ofChineseMedical Sciences,Beijing100040,China

OBJECTIVE To observe the efficacy of Xiaosheng Powder on goblet cells.METHODS A totalof 30 dry eye cases(60 eyes)were included and randomly divided into controlgroup and powder group.Patients in formergroup were treated by sodium hyaluronate eye drops,one drop each time,four timesa day.While participants in latter group were administrated with Xiaosheng Powder a bag each time,twice a day.This formulawasmainly consisted of Baishao,Chaihu,Dangshen,Danggui,Wuweizi,Maidong,etc.Symptoms,break up time(BUT),Schirmer’s test(SIT),fluorescein staining(FL),impression cytology(IC)ofpatientswere observed and documented before and 4 weeksafter treatment.RESULTS After the treatment,symptoms,and BUT,SIT,the number and grade ofgobletcell and FL of granule group improved significantly(P<0.05).For control group,improvementof symptoms,FL and the grade ofgoblet cellwere of statistical difference(P<0.05)，while SIT,BUT and the number ofgoblet cell showed no significant variation(P<0.05).Comparisons of these parameters listed above between two groups after treatmentall demonstrated statisticaldifference(P<0.05).CONCLUSIONS The Xiaosheng Powder relieved symptomsofdry eye, increased the tear secretion,prolonged BUT,elevated tear film stability,reduced apoptosis of goblet cell and alleviated ocularsurface damage.

dry eye;Xiaosheng Powder;gobletcells;immune-related inflammation

R777.34

A

1002-4379（2017）03-0163-06

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2017.03.006

國家自然科學基金（81273805）

中國中醫(yī)科學院眼科醫(yī)院，北京100040

謝立科，bjxielike@sina.com