白 雪，李 慧，張 月，彭 揚，何 平

MicroRNA在山楂酸誘導A549細胞凋亡中的作用研究

白 雪，李 慧，張 月，彭 揚，何 平*

目的 探討MicroRNA在山楂酸誘導肺癌細胞A549凋亡過程中發(fā)揮的生物學作用。方法 將人的肺癌細胞系A549經過山楂酸干預，并提取處理后A549細胞的總RNA,通過AFFX miRNA表達譜芯片，檢測山楂酸作用前后A549細胞中miRNA表達差異情況。通過生物信息學，分析預測miRNA作用的靶蛋白。結果 山楂酸作用前后肺癌細胞A549中59個miRNA表達差異顯著，其中23個miRNA的表達上調，36個miRNA的表達下調。生物信息學分析預測，由miRNA調控的細胞增殖相關靶蛋白400余個，細胞凋亡相關靶蛋白300余個，其中XIAP是miR-630下游調控的靶蛋白。結論 山楂酸可能通過調控miRNA的表達發(fā)揮對A549細胞的抑制作用。

肺癌；MicroRNA；山楂酸

0 引言

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內源性非編碼小分子單鏈RNA，具有高度的物種保守性[1]。目前，有1 000多種miRNA已被命名，盡管在人類基因組中所占比例極小，但miRNA調控著人體內超過1/3的基因表達[2]。miRNA在轉錄后調控基因表達時起負性調節(jié)作用，其主要的調控方式是通過與目標mRNA結合進而抑制其翻譯或使其降解，達到干擾靶mRNA翻譯，從而調控靶mRNA基因的表達，在細胞周期的各個階段，包括腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲、轉移、凋亡中起重要作用[3-5]。

中草藥單體多從天然植物中提取，與西藥化療藥物相比毒副作用小，已成為近年來抗腫瘤藥物研究的熱點[6-9]。山楂酸是從油橄欖、紅棗、山楂等植物中提取出來的天然有機化合物單體，已有研究表明,山楂酸對某些腫瘤細胞有較強的抗腫瘤活性[10]。目前,對于中藥抗腫瘤的機制，主要是關于編碼蛋白表達調控的研究，而非編碼miRNA表達調控的研究較少。近年來已有研究顯示，在中藥抗腫瘤的過程中，miRNA可能作為癌基因或抑癌基因參與其中。中藥作用后，作為抑癌基因的miRNA表達增加，可通過促進其靶基因(原癌基因)降解或抑制靶基因(原癌基因)的翻譯來下調原癌基因的表達，從而實現(xiàn)中藥抗腫瘤的作用；同樣，作為癌基因的miRNA表達減少，亦可通過對其靶基因(抑癌基因)翻譯后水平的負調控作用來上調抑癌基因的表達，進而達到抗腫瘤的目的[11]。這些為深入研究中藥抗腫瘤機制開辟了新的方向。

本實驗擬通過AFFX miRNA表達譜芯片篩選山楂酸作用于A549細胞前后miRNA的表達變化。通過生物信息學分析預測，篩選出miRNA所調控的細胞增殖相關靶蛋白及細胞凋亡相關靶蛋白，在miRNA水平研究山楂酸抑制A549細胞的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器 人肺癌細胞系A549購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，RPMI-1640培養(yǎng)基購于Gibco公司，胎牛血清購于天津索萊寶生物工程有限公司，胰蛋白酶購于以色列Biological Industries公司，Trizol購于大連寶生物工程公司，離心機購于德國Eppendorf公司，超凈工作臺(SW-CJ-1FD型)購于蚌埠凈化設備廠，倒置顯微鏡(Olympus CKX31)購于日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肺癌A549細胞用10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基置于37 ℃、飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞呈單層貼壁生長狀態(tài)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗，將細胞濃度調整為0.5-1×106/mL。接種細胞后培養(yǎng)過夜，當細胞進入對數(shù)生長期后，開始進行藥物干預。

1.2.2 miRNA表達差異檢測方法 AFFX miRNA表達譜芯片檢測山楂酸作用前后A549細胞中miRNA表達差異。①細胞處理：將對數(shù)生長期細胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜，并加入終濃度為18 μg/mL的山楂酸溶液，采用等量RPMI-1640的培養(yǎng)基作為陰性對照，置于37 ℃、飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。②細胞總RNA提取：樣品經過PBS緩沖液漂洗后，加入1 mL Trizol溶液，室溫靜置5 min。加200 μL氯仿于混合液中，將混合液進行離心，加入異丙醇(體積比為1∶1)，充分混勻后離心(4 ℃，12 000 r/min，30 s)，棄上清，獲取總RNA。③樣本RNA處理:取1 μg樣本總RNA，加入500 μL 1 mmol Tris Cl，1 μL ATP mix充分混勻并置于冰上。添加2 μL RNA Spike Control Oligos，5 μL Poly(A) Tailing Mix，輕彈管壁數(shù)次使其充分混勻，快速離心(5 s)收集溶液于管底，37 ℃溫育15 min。④生物素標記MicroRNA:添加4 μL 5X FlashTag Ligation Mix Biotin，2 μL T4 DNA Ligase于上述體系，并于25 ℃溫育30 min。添加2.5 μL Stop Solution終止反應，瞬時離心(5 s)，收集溶液于管底，置于冰上。⑤芯片雜交和掃描:取出芯片并使芯片溫度平衡至室溫，將雜交液加入到標記好的miRNA體系中瞬時離心(5 s),收集溶液于管底，99 ℃溫育5 min，45 ℃溫育5 min?；旌弦河陔x心機最大轉速離心5 min，除去雜交混合液中的不溶性物質。芯片中注入100 μL雜交液并放置于雜交爐中，48 ℃、60 r/min旋轉雜交16 h。雜交結束后吸棄雜交液，加入100 μL Array Holding Buffer，將芯片進行清洗染色，最后進行掃描。

1.3 結果分析 對miRNA的差異表達進行篩選：在實驗中檢測結果顯示變化方向和程度一致。靶基因預測：使用3種預測方法分析miRNA的靶基因。具體預測算法為：targetScan，picTar，miRanda。將所有的靶基因進行GO(Gene Ontology)功能注釋分析，然后將分別與細胞增殖和凋亡的基因篩選出來，整理成列表形式。

2 結果

2.1 山楂酸作用于A549細胞前后miRNA的表達變化 AFFX miRNA表達譜芯片篩選山楂酸作用于A549細胞前后miRNA的表達變化,軟件分析結果發(fā)現(xiàn),59個miRNA表達差異顯著(10倍以上改變)，其中23個miRNA的表達上調，36個miRNA的表達下調。見表1。

表1 部分篩查表達差異的miRNA

2.2 miRNA靶基因預測 生物信息學分析結果表明,由上述miRNA調控的細胞增殖相關靶蛋白400余個，細胞凋亡相關靶蛋白300余個，其中XIAP是miR-630下游調控的靶蛋白(見表2)。

3 討論

miRNA最早是由Lee在線蟲體內發(fā)現(xiàn)的，后期科學家們證實，其在哺乳動物體內亦廣泛存在，通過調控基因表達參與了多種生物功能的調節(jié)。其主要作用方式是在翻譯后水平調控靶基因的表達，具體機制為通過與靶mRNA 的3′UT互補配對，從而促進靶mRNA 的降解或抑制其翻譯[12-13]。研究表明，miRNA幾乎參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個階段，具有癌基因或抑癌基因雙重作用[14-15]。增強或抑制抑癌基因性或癌基因性miRNA的表達，可以抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲。目前已經有超過40種miRNA被證實與肺癌有關，如Let-7、miR-13、miR-34、miR-145及miR-126等[16-19]，它們通過在肺癌細胞中表達上調或下調，調節(jié)轉錄后翻譯，發(fā)揮其癌基因或抑癌基因作用，影響肺癌的發(fā)展進程。

miRNA是基因表達的關鍵調節(jié)分子，在腫瘤細胞的增殖、凋亡中起重要的調控作用。miRNA及其調控對象，都可能成為藥物作用靶點。目前的研究發(fā)現(xiàn)，一些藥物能改變腫瘤細胞miRNA的表達，其表達的變化可能與藥物抗腫瘤作用相關[20-21]。miRNA可能作為抗腫瘤藥物作用靶點，為抗腫瘤藥物的開發(fā)提供新的策略和思路。目前在miRNA分子水平研究中藥治療腫瘤作用機制的報道較少，有待于進一步探索和發(fā)現(xiàn)。

本實驗通過AFFX miRNA表達譜芯片篩選山楂酸作用于A549細胞前后miRNA的表達變化，發(fā)現(xiàn)包括miR-630在內的59個miRNAs表達有顯著差異(差異改變均大于10倍)，其中23個miRNA表達上調，36個miRNA表達下調。生物信息學分析預測，由上述miRNA調控的細胞增殖相關靶蛋白400余個，細胞凋亡相關靶蛋白300余個，其中XIAP是miR-630下游調控的靶蛋白。有研究表明，miR-630參與調節(jié)順鉑誘導肺癌A549細胞死亡，順鉑作用后伴隨miR-630表達升高[23]。通過上述文獻結合生物信息學軟件分析，我們初步判定miR-630表達上調可能參與了調控山楂酸誘導A549細胞凋亡過程。

本實驗結果表明，山楂酸可能通過調控miRNA的表達發(fā)揮對A549細胞的抑制作用。本研究初步探討了miRNA在山楂酸抑制肺腺癌系A549細胞中的作用，為中藥抗腫瘤的機制研究提供了新的方向和理論依據(jù)，為進一步在山楂酸抑制肺癌A549細胞miRNA調控水平的深入研究奠定了基礎。

表2 部分miRNA靶基因預測

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Effect of microRNA on apoptosis induced by maslinic acid in lung cancer cell line A 549

BAI Xue,LI Hui,ZHANG Yue,PENG Yang,HE Ping*

(Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To investigate the biological effect of microRNA on apoptosis induced by maslinic acid in lung cancer cell line A549.Methods A549 cells were treated with maslinic acid and the total RNA was extracted.Expression pattern of microRNA was examined in A549 cells treated with maslinic acid using AFFX miRNA expression microarray.Target proteins were predicted using bioinformatic methods.Results Totally 59 miRNAs were involved in the inhibition effect of maslinic acid on lung cancer cell,of which 23 miRNAs were significantly up-regulated and 36 miRNAs were down-regulated.Bioinformatic analysis predicted that miRNA regulated more than 400 proliferation-related target proteins and more than 300 apoptosis-related target proteins.XIAP is one of target proteins regulated by miR-630.Conclusion Maslinic acid may inhibit A549 cells growth through the regulatory effect of miRNA expression.

Lung cancer;MicroRNA;Maslinic acid

2016-12-23

中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院,沈陽 110004

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201705004