畢潔，暢晶晶，李妙霞，余純應(yīng)

（1.北京明正司法鑒定中心，北京 100191；2.公安部物證鑒定中心，北京 110000）

20723例親子鑒定中19個(gè)STR基因座的突變分析

畢潔1，暢晶晶2，李妙霞1，余純應(yīng)1

（1.北京明正司法鑒定中心，北京 100191；2.公安部物證鑒定中心，北京 110000）

目的觀察并分析肯定親權(quán)關(guān)系的案件，探索STR基因座的突變規(guī)律。方法采用Goldeneye 20A試劑盒對(duì)20723例肯定親權(quán)關(guān)系的案件篩選等位基因突變事件，統(tǒng)計(jì)各基因座的突變率和突變等位基因的來源、片段大小、突變步數(shù)及重復(fù)單位的增加或減少情況，分析突變相關(guān)因素的特點(diǎn)。結(jié)果19個(gè)STR基因座共發(fā)現(xiàn)548例突變，觀察到557個(gè)突變事件，基因座的突變率為0.07‰～2.23‰。父系突變與母系突變的比例為3.06∶1。突變以一步突變?yōu)橹?，增加與減少重復(fù)單位的情況相當(dāng)；二步以上（含二步）突變更易出現(xiàn)重復(fù)單位減少。突變主要發(fā)生于中等位基因，重復(fù)單位增減比例相當(dāng)，長(zhǎng)等位基因突變中重復(fù)單位減少顯著多于增加。父系突變出現(xiàn)重復(fù)單位增加與減少的比例相當(dāng)，母系突變重復(fù)單位減少較增加多見。結(jié)論各基因座的突變率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，當(dāng)出現(xiàn)1～2個(gè)基因座不符合遺傳規(guī)律時(shí)，應(yīng)當(dāng)加測(cè)其他檢測(cè)系統(tǒng)，并結(jié)合突變基因座的信息計(jì)算PI值，以進(jìn)一步明確鑒定意見。

法醫(yī)遺傳學(xué)；親子關(guān)系；短串聯(lián)重復(fù)序列；DNA突變分析

短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）基因座是目前最常用的親權(quán)鑒定遺傳標(biāo)記，具有多態(tài)性高、個(gè)體識(shí)別能力強(qiáng)、非父排除概率高、突變率高等特點(diǎn)[1]。其中，STR發(fā)生突變可能使親權(quán)鑒定面臨錯(cuò)判的風(fēng)險(xiǎn)，因而有必要對(duì)STR基因座的突變規(guī)律與特點(diǎn)有所認(rèn)識(shí)。本研究通過大量樣本檢測(cè)，對(duì)目前常用的Goldeneye 20A檢測(cè)系統(tǒng)中觀察到的突變規(guī)律及特點(diǎn)進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 樣本

本中心日常檢案中肯定親權(quán)的案件20 723例，均為北方漢族人群，樣本類型有血斑、口腔拭子、帶毛囊的毛發(fā)、羊水、精斑、組織等。

1.2 DNA提取和STR分型

采用Chelex-100法提取樣本DNA，經(jīng)Goldeneye 20A試劑盒［基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司］擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件按試劑盒說明書進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物在3130xl型基因分析儀（美國Thermo Fisher公司）上進(jìn)行電泳，采用GeneMapper?ID-X軟件進(jìn)行基因分型。

1.3 突變等位基因的確定

從有下述特點(diǎn)的案例中識(shí)別突變的等位基因：19個(gè)STR基因座中檢出1～2個(gè)不符合孟德爾遺傳定律的基因座，增加檢測(cè)STRtyper-10G試劑盒[2]（珠海科登生物技術(shù)有限公司），未再出現(xiàn)新的不符合遺傳規(guī)律的基因座，且累積親權(quán)指數(shù)（CPI）大于 10000；出現(xiàn)新的不符合遺傳規(guī)律的基因座，增加檢測(cè)Goldeneye 22NC試劑盒［基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司］，若被檢子代為女性，對(duì)被檢父母與女孩再增加檢測(cè)Goldeneye 17X試劑盒［基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司］，若被檢子代為男性，對(duì)被檢父與男孩增加檢驗(yàn)Yfiler Plus試劑盒（美國Thermo Fisher公司），未再出現(xiàn)不符合遺傳規(guī)律的基因座，且CPI值大于10000。在滿足上述條件下，對(duì)于不符合孟德爾遺傳規(guī)律的基因座，視為突變基因座，并判斷突變的來源。對(duì)于親代和子代均為純合子的突變基因座，換用其他試劑盒（如Globalfiler系統(tǒng)）進(jìn)行復(fù)核，以排除無效基因并驗(yàn)證分型。

參照文獻(xiàn)[3-5]將每個(gè)基因座等位基因按片段大小（取決于重復(fù)次數(shù)的多少）從小到大排列，排列在前面25%的判斷為短等位基因，中間50%判斷為中等位基因，后面25%判斷為長(zhǎng)等位基因。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì)突變基因座的數(shù)量、突變來源、突變步數(shù)、突變等位基因的片段大小及重復(fù)單位的增加或減少進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，通過直接計(jì)數(shù)法得到突變基因座的突變率；分析突變來源、突變步數(shù)、突變等位基因片段大小在整體突變事件中所占比例，并通過SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析上述突變相關(guān)因素之間的關(guān)系，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

20723例肯定親子關(guān)系的案例中，三聯(lián)體7957例，父子二聯(lián)體7463例，母子二聯(lián)體5303例，共觀察到28680次減數(shù)分裂。548例案例發(fā)生了557次突變，其中539例存在單個(gè)基因座的父源性或母源性突變，2例父源性和母源性同時(shí)突變（D18S51：父14/15，子16/23，母20/ 22；D13S317：父11/14，子10/15，母11/12），7例存在2個(gè)基因座的父源性或母源性突變。

2.2 突變率和突變來源

19個(gè)STR基因座的突變情況見表1。其中Penta E基因座的突變率最高，TPOX基因座最低，19個(gè)STR基因座的平均突變率為1.02‰。19個(gè)基因座的突變率經(jīng)χ2檢驗(yàn)，χ2=206.793，P＜0.05，提示各基因座的突變率之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 19個(gè)基因座在20723例肯定親子關(guān)系案例（28680次減數(shù)分裂）中發(fā)生突變的次數(shù)和突變率（N=28680）

548例突變案例中，三聯(lián)體為311例（319次突變），父子二聯(lián)體為188例（189次突變），母子二聯(lián)體為49例（49次突變）。311例三聯(lián)體中來自父系的突變205次，來自母系突變67次，47次不能確定突變來源（表2）。父系突變與母系突變的比例為3.06∶1。

2.3 突變步數(shù)及重復(fù)單位增減分析

557次突變事件中，545次（97.84%）為一步突變，7次（1.26%）為二步突變，5次（0.90%）為三步突變。

突變表現(xiàn)為重復(fù)單位增加的有213次，重復(fù)單位減少的有232次，不能明確重復(fù)單位增減的有112次（表3）。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，χ2=4.810，P＜0.05，提示一步突變與二步及以上突變中出現(xiàn)重復(fù)單位增加和減少的情況之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，一步突變中重復(fù)單位增加和減少的次數(shù)相當(dāng)，二步及以上突變中重復(fù)單位減少的次數(shù)明顯多于增加的次數(shù)。

表2 三聯(lián)體突變來源觀察（次）

表3 突變步數(shù)與重復(fù)單位的增減（次）

2.4 突變等位基因片段大小及其與重復(fù)單位增減的關(guān)系

發(fā)生在短等位基因的突變有9次，中等位基因464次，長(zhǎng)等位基因56次，無法明確等位基因長(zhǎng)度的28次。各類等位基因突變?cè)黾踊驕p少重復(fù)單位的情況見表4。中、長(zhǎng)等位基因突變出現(xiàn)重復(fù)單位增加與減少經(jīng)χ2檢驗(yàn)，χ2=19.076，P＜0.05，即中、長(zhǎng)等位基因突變出現(xiàn)重復(fù)單位增減的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因發(fā)生在短等位基因上的突變次數(shù)較少，故沒有納入此次統(tǒng)計(jì)。

2.5 突變來源與重復(fù)單位增減的關(guān)系

三聯(lián)體中，來自父系突變205次，90個(gè)等位基因表現(xiàn)為重復(fù)單位的增加，89個(gè)等位基因表現(xiàn)為重復(fù)單位的減少，26個(gè)等位基因不能確定重復(fù)單位的增減；來自母系突變67次，17個(gè)等位基因表現(xiàn)為重復(fù)單位的增加，42個(gè)等位基因表現(xiàn)為重復(fù)單位的減少，8個(gè)等位基因不能確定重復(fù)單位的增減（表5）。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，χ2=8.324，P＜0.05，提示父源突變與母源突變中出現(xiàn)重復(fù)單位增加和減少的情況差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，父源突變中重復(fù)單位增加和減少的次數(shù)相當(dāng)，母源突變中重復(fù)單位減少的次數(shù)明顯多于增加的次數(shù)。

表4 突變等位基因片段大小與重復(fù)單位增減的關(guān)系（次）

表5 突變來源與重復(fù)單位增減的關(guān)系（次）

3 討論

3.1 突變率

本研究觀察到19個(gè)STR基因座的突變率在0.07‰～2.23‰，除Penta E、FGA、D12S391基因座外，其余16個(gè)基因座的突變率均小于2‰，各基因座的突變率之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以在使用突變率大于2‰的基因座進(jìn)行親權(quán)鑒定時(shí)，應(yīng)注意突變的問題。19個(gè)STR基因座的平均突變率為1.02‰，低于目前常用的平均突變率2‰[6]，結(jié)合各基因座的突變率計(jì)算PI值更為科學(xué)[4]。

重復(fù)單位數(shù)目多的基因座長(zhǎng)度較長(zhǎng)，其多態(tài)性一般較高，突變率也較高[1，7]。吳薇薇等[8]對(duì)中國28個(gè)省/區(qū)漢族人群41個(gè)STR基因座多態(tài)性數(shù)據(jù)分析顯示，Penta E的多態(tài)性最高（DP值0.9873，H值0.9140），TPOX的多態(tài)性最低（DP值0.5577，H值0.6141），本研究觀察到的突變率最高和最低的基因座與其一致。

3.2 突變來源分析

STR基因座的突變與性別有關(guān)，一般的規(guī)律是父方基因突變比母方多見。分析原因是男性精子細(xì)胞分化經(jīng)歷的細(xì)胞分裂次數(shù)比卵細(xì)胞多10倍，其次是精子染色體中堿基替換的累積比卵細(xì)胞快2倍[9]。本研究觀察三聯(lián)體的突變?yōu)?11例（319次突變），父系突變與母系突變的比例為3.06∶1，與文獻(xiàn)[7，9-11]報(bào)道的父系突變率是母系突變率3.5倍的結(jié)論相接近。但是本研究父系突變與母系突變的比例是聯(lián)合應(yīng)用19個(gè)STR基因座檢測(cè)得出的，就單個(gè)基因座而言，父系突變與母系突變的比例差異很大（表2）。

3.3 突變機(jī)制

STR基因座的突變是DNA復(fù)制滑動(dòng)的結(jié)果，即在DNA合成過程中，聚合酶會(huì)從模板上脫離，新合成的DNA鏈也與模板鏈發(fā)生暫時(shí)分離，并可能發(fā)生鏈的滑動(dòng)，再次互補(bǔ)結(jié)合時(shí)形成錯(cuò)配的突出環(huán)，從而使新合成的DNA鏈增加或減少一個(gè)或多個(gè)重復(fù)單位，即一步突變或幾步突變。90%以上STR基因座的突變均為增加或減少一個(gè)重復(fù)單位，即一步突變[1，9]。

本研究觀察到一步突變占比97.84%，與大多數(shù)研究[4，7，10]結(jié)果一致，余2.16%為二步以上（含二步）突變。

3.4 突變步數(shù)、等位基因片段大小的突變率、突變來源與重復(fù)單位增減的分析

一步突變與二步以上（含二步）突變中，出現(xiàn)重復(fù)單位增減的情況差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。一步突變中，出現(xiàn)重復(fù)單位增加和減少的數(shù)目相當(dāng)；二步以上（含二步）突變中，重復(fù)單位減少的數(shù)目明顯多于增加的數(shù)目。

關(guān)于無法明確突變等位基因片段大小的情形，突變前的兩個(gè)等位基因距突變成的新等位基因步數(shù)相同、結(jié)構(gòu)相似，無法判斷突變等位基因來源；且能發(fā)生突變的兩個(gè)等位基因分別歸屬于不同長(zhǎng)度，例如父、子、母在CSF1PO基因座的分型分別為12/14、13/13和10/13，分析孩子的13由父親的12或14突變來，而按照短中長(zhǎng)等位基因的劃分，12屬于中等位基因，14屬于長(zhǎng)等位基因，由于12和14距離突變后的13來說，步數(shù)相同，結(jié)構(gòu)相似，都有可能是發(fā)生突變的等位基因，因此該類突變被定為無法明確等位基因長(zhǎng)度。

突變主要發(fā)生于中等位基因，約占突變總數(shù)的83.30%（464/557），且重復(fù)序列增加與減少接近，這與文獻(xiàn)[4，12]的研究結(jié)果相似。短等位基因及長(zhǎng)等位基因的突變率較低，長(zhǎng)等位基因突變減少明顯多于增加，與多數(shù)研究[4，13]一致。

不同來源的突變出現(xiàn)重復(fù)單位增加與減少的比例差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。父系突變出現(xiàn)重復(fù)單位增加與減少的比例相當(dāng)，母系突變中重復(fù)單位減少明顯較增加多見。

綜上，突變是導(dǎo)致親代與子代不符合遺傳規(guī)律的重要原因，隨著檢測(cè)的遺傳標(biāo)記越多，遇到突變的可能性也增加，因此有必要對(duì)STR基因座的突變規(guī)律及特點(diǎn)有所認(rèn)識(shí)。本研究通過對(duì)20723例肯定親權(quán)關(guān)系的案件中觀察到的突變情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析了突變相關(guān)因素之間的關(guān)系以供參考。對(duì)于出現(xiàn)1～2個(gè)基因座不符合遺傳規(guī)律的情形，應(yīng)當(dāng)加測(cè)其他檢測(cè)系統(tǒng)，并結(jié)合突變基因座的信息計(jì)算PI值，以進(jìn)一步明確鑒定意見。

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Mutation Analysis of 19 STR Loci in 20723 Cases of Paternity Testing

BI Jie1,CHANG Jing-jing2,LI Miao-xia1,YU Chun-ying1
（1.Beijing Mingzheng Forensic Identification Center,Beijing 100191,China;2.Institute of Forensic Science,Ministry of Public Security,PRC,Beijing 110000,China）

ObjectiveTo observe and analyze the confirmed cases of paternity testing,and to explore the mutation rules of STR loci.MethodsThe mutant STR loci were screened from 20 723 confirmed cases of paternity testing by Goldeneye 20A system．The mutation rates,and the sources,fragment length, steps and increased or decreased repeat sequences of mutant alleles were counted for the analysis of the characteristics of mutation-related factors.ResultsA total of 548 mutations were found on 19 STR loci, and 557 mutation events were observed.The loci mutation rate was 0.07‰-2.23‰.The ratio of paternal to maternal mutant events was 3.06:1.One step mutation was the main mutation,and the number of the increased repeat sequences was almost the same as the decreased repeat sequences.The repeat sequences were more likely to decrease in two steps mutation and above.Mutation mainly occurred in the medium allele,and the number of the increased repeat sequences was almost the same as the decreased repeat sequences.In long allele mutations,the decreased repeat sequences were significantly more than the increased repeat sequences.The number of the increased repeat sequences was almost the same as the decreased repeat sequences in paternal mutation,while the decreased repeat sequences were more than the increased in maternal mutation.ConclusionThere are significant differences in the mutation rate of each locus.When one or two loci do not conform to the genetic law,other detection system should be added,and PI value should be calculated combined with the information of the mutate STR loci in order to further clarify the identification opinions.

forensic genetics;parent-child relations;short tandem repeat;DNA mutational analysis

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.03.010

1004-5619（2017）03-0263-04

2016-11-14）

（本文編輯：張素華）

畢潔（1983—），女，主檢法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)物證學(xué)鑒定；E-mail：bijie0403＠163.com