李廣禎，馬志杰*，陳生梅，林 元，李瑞哲，劉書杰，楊國太，周桑加

(1 青海省高原家畜遺傳資源保護與創(chuàng)新利用重點實驗室，青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，西寧 810016；2 青海省同德縣農(nóng)牧和水利局，青海 同德 813200)

前言

牦牛(Bosgrunniens)能在空氣稀薄、高紫外線、寒冷和牧草生長期短的高寒生態(tài)環(huán)境中生活自如，是青藏高原及其毗鄰的高山、亞高山地區(qū)的標志性畜種，可為當?shù)夭?、蒙、回等民族及其他游牧民族提供肉、奶、毛、絨、皮、交通和燃料等生產(chǎn)、生活必需品，是青藏高原民族文化重要的組成部分[1]。Y染色體具有遵循父系遺傳、突變率低、不易受重組影響等特點，是開展哺乳動物父系遺傳多樣性、種群歷史動態(tài)、起源和進化等研究強有力的工具[2]。近年來，Y染色體單核苷酸多態(tài)性(Y-SNP)和Y染色體微衛(wèi)星(Y-STR)標記作為2種主要的Y染色體分子標記，已被用于牦牛的父系起源、遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關系等研究[3-7]。Li等[3]最早通過對高原、環(huán)湖和天祝白牦牛共65頭公牦牛的16個Y染色體基因片段進行測序分析，發(fā)現(xiàn)5個Y染色體基因片段(即SRY4、USP9Y、UTY19、AMELY2和OFD1Y10)中6個Y-SNPs可用于牦牛父系遺傳分析，共確定了3種單倍型，初步推斷牦牛擁有2個高度分化的父系支系。Ma等[4]基于Li等[3]報道的5個牦牛Y-SNPs標記，對青海省9個牦牛品種(群體)進行系統(tǒng)的父系遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構及遺傳背景分析，表明青海牦牛具有較豐富的父系遺傳多樣性，由2大父系支系組成，發(fā)現(xiàn)大通牦牛品種和曲麻萊牦牛(即玉樹牦牛)群體均擁有特殊的單倍型。隨后，為系統(tǒng)探究中國牦牛的父系遺傳多樣性、譜系地理結(jié)構、分化、聚類關系、分子變異及系統(tǒng)發(fā)育關系，馬志杰等[5-7]基于上述5個Y-SNPs標記和1個Y-STR INRA189標記的聯(lián)合對家牦牛11個地方品種(即九龍、麥洼、娘亞、斯布、帕里、高原、環(huán)湖、甘南、巴州、中甸和天祝牦牛)、1個培育品種(即大通牦牛)和3個群體(即塔縣、雪多和類烏齊牦牛)共682頭公牦牛和8頭野牦牛公牛進行父系遺傳綜合分析，表明我國牦牛擁有豐富的父系遺傳多樣性，遺傳分化程度較高，品種(群體)間無明顯的譜系地理結(jié)構，更多的遺傳變異存在于品種(群體)內(nèi)和品種(群體)間，由2個父系支系組成(即有2個父系起源)，16個牦牛品種(群體)可明顯的分為5類，推測青海省可能是牦牛的起源與馴化地。上述研究為深入了解牦牛的父系遺傳多樣性水平、群體結(jié)構組成、分化程度、起源、分類和系統(tǒng)發(fā)育關系提供了基礎數(shù)據(jù)，對進一步開展牦牛種質(zhì)資源的發(fā)掘、合理保護和利用提供了重要信息。

同德縣地處青海省海南、黃南和果洛3個藏族自治州的交接處，是一個以牧為主，農(nóng)牧結(jié)合的少數(shù)民族地區(qū)，縣內(nèi)平均海拔3 660 m。畜牧業(yè)是該縣的主要產(chǎn)業(yè)之一，牦牛是其優(yōu)勢畜種和寶貴的動物遺傳資源，存欄量達15.6萬頭[8]。在先前同德牦牛的母系遺傳研究中，李廣禎等[9]對60頭同德牦牛mtDNA D-loop區(qū)序列進行了測定分析，表明同德牦牛與其他牦牛品種(群體)相比，具有較豐富的母系遺傳多樣性且擁有2個母系支系。然而，當前尚未見對同德牦牛父系遺傳分析的研究報道。鑒于此，本研究對同德牦牛的父系遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構及父系起源進行探究，以明確其父系遺傳多樣性水平、群體結(jié)構組成及父系遺傳背景，為后續(xù)開展同德牦牛遺傳資源的合理保護與開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與基因組DNA提取

采用頸靜脈采血法在青海省同德縣秀麻鄉(xiāng)和河北鄉(xiāng)共采集32頭公牦牛的頸靜脈血樣，使用血液基因組DNA提取試劑盒(艾德萊生物科技有限公司，北京)提取基因組DNA，-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。血樣采集前，仔細詢問牧戶并查詢相應的牦牛系譜記錄，采用分戶隨機采樣方式開展采樣，確保個體間無親緣關系。

1.2 引物合成、PCR擴增與測序分型

參照馬志杰[5]報道的牦牛Y-SNPs標記(即SRY4、USP9Y、UTY19、AMELY3 和OFD1Y10)和Y-STR標記(INRA189)序列合成6對引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR反應體系(25 μL)為：2×Prime STAR Max Premix (上海寶生物公司) 10.5 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.5 μL，基因組DNA 1.0 μL，超純水12.5 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性4 min；98 ℃變性10 s，Ta ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；后冷卻至4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠(含Gold View 核酸染料)電泳、凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測后，將目的條帶單一、擴增效率高的PCR產(chǎn)物回收純化，送至北京擎科生物有限公司進行正、反向測序。同時，Y-STR INRA189標記PCR產(chǎn)物測序分型由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 牦牛Y染色體分子標記引物信息

1.3 數(shù)據(jù)分析

將測序數(shù)據(jù)使用Chromas 2.3軟件進行人工核對，確保數(shù)據(jù)的準確性。用BioEdit7.2.5軟件[10]對32頭同德牦牛5個Y-SNPs標記(SRY4、USP9Y、UTY19、AMELY3 和OFD1Y10)測序結(jié)果進行多序列比對分析，檢測每個標記中的SNP位點。同時，用GeneMarker 1.91 軟件[11]對每頭牦牛的Y-STRINRA189標記測序分型結(jié)果進行分析，確定其等位基因大小。通過2種標記聯(lián)合分型確定每頭公牦牛的Y染色體單倍型及單倍型組。后采用DnaSP5.10.01[12]和Arlequin3.11軟件[13]確定同德牦牛的Y染色體單倍型數(shù)目，計算其Y染色體單倍型多樣度(Hd)大小。用Network10.1軟件[14]基于不同單倍型間的核苷酸變異繪制網(wǎng)絡中介圖(Median-Joining, MJ)以揭示單倍型(組)間的系統(tǒng)發(fā)育關系。

2 結(jié) 果

2.1 同德牦牛Y染色體標記的多態(tài)性檢測

對32頭同德牦牛5個SNPs 標記即SRY4、USP9Y、UTY19、AMELY3 和OFD1Y10進行PCR純化產(chǎn)物雙向測序，獲得的片段長度分別為969 bp、470 bp、290 bp、971 bp和763 bp。對各標記測序結(jié)果進行多序列比對分析，除檢測到先前Ma等[4-5]確定的10個Y-SNPs外，本研究在同德牦牛AMELY3標記中首次檢測到一個新的Y-SNP位點(即g.719 C>T)(圖1)。在對同德牦牛Y-STRINRA189標記分型分析中，本研究共檢測到155 bp、157 bp和159 bp 3個等位基因(圖2)。

圖1 同德牦牛AMELY3標記新的Y-SNP(g.719 C>T)位點測序峰圖

圖2 同德牦牛Y-STR INRA189 標記分型結(jié)果

2.2 同德牦牛Y染色體單倍型確定及多樣度大小

參照先前研究報道中其他牦牛品種(群體)Y染色體單倍型的確定方法[3-5]，本研究對同德牦牛群體進行Y染色體單倍型確定和綜合分析，結(jié)果共確定了6種Y染色體單倍型，即Y1H1、Y1H2、Y1H3、Y1H4、Y1H5和Y2H6(表2)。其中Y1H1為優(yōu)勢單倍型，共有15個個體共享，占總數(shù)的47%；Y2H6有8個個體共享，占總數(shù)的25%；Y1H5有4個個體共享，占總數(shù)的13%；Y1H2有3個個體共享，占總數(shù)的9%；而Y1H3和Y1H4單倍型均只包含1個個體，頻率最低，各占總數(shù)的3%，為稀有單倍型。計算結(jié)果表明，同德牦牛Y染色體單倍型多樣度(Hd)大小為0.714±0.060。

表2 同德牦牛Y染色體單倍型(組)信息

2.3 同德牦牛Y染色體單倍型系統(tǒng)發(fā)育分析

對同德牦牛6種Y染色體單倍型構建網(wǎng)絡關系圖(圖3)，結(jié)果顯示：6種Y染色體單倍型分為2個大的單倍型組/支系(即Ⅰ和Ⅱ)。其中，Ⅰ單倍型組/支系包括5種單倍型(即Y1H1、Y1H2、Y1H3、Y1H4和Y1H5)，占總數(shù)的75%；而Ⅱ單倍型組/支系僅含有Y2H6一種單倍型，占總數(shù)的25%，提示同德牦牛由2個大的父系單倍型組/支系組成，以Ⅰ單倍型組/支系為主，有2個父系起源。

圖3 同德牦牛6種Y染色體單倍型網(wǎng)絡關系圖注：圖中圓面積大小與各單倍型頻率大小成正比

3 討 論

Y-SNP和Y-STR 作為2種主要的Y染色體分子標記，在開展哺乳動物父系遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構、起源等研究中發(fā)揮著重要的作用[3-7,15-18]。在先前牦牛的父系遺傳研究中，Li等[3]發(fā)現(xiàn)SRY4、USP9Y、UTY19、AMELY2和OFD1Y10標記中6個Y-SNPs可用于牦牛父系遺傳分析，在高原、環(huán)湖和天祝白牦牛中共確定了3種單倍型，提示各品種具有豐富的Y染色體遺傳多樣性。Ma等[4]對青海9個牦牛品種(群體)(即曲瑪萊、祁連、天峻、唐古拉山、郭勒木德、崗龍、雪多、大通和環(huán)湖牦牛)的父系遺傳分析中，表明郭勒木德群體具有最豐富的父系遺傳多樣性(Hd=0.706±0.038)。而在中國15個家牦牛和1個野牦牛品種/群體的父系遺傳分析中，馬志杰[5]在Li等[3]研究的基礎上在OFD1Y10標記中發(fā)現(xiàn)4個新的Y-SNPs，共確定了14 種Y染色體單倍型，表明家、野牦牛擁有豐富的父系遺傳多樣性，但野牦牛的父系遺傳多樣性(Hd=0.821 4±0.100 7)高于家牦牛(Hd=0.696 4±0.014 1)；家牦牛品種(群體)中巴州牦牛的父系遺傳多樣性最高(Hd=0.727 3±0.066 7)，帕里牦牛的父系遺傳多樣性最低(Hd=0.117 4±0.073 2)。在本研究中，基于相同的5個牦牛Y-SNPs標記(即SRY4、USP9Y、UTY19、AMELY3和OFD1Y10)和1個Y-STR標記(即INRA189)，在對同德牦牛的父系遺傳分析中首次在AMELY3標記中發(fā)現(xiàn)一個新的Y-SNP(g.719 C>T)，這不僅說明同德牦牛群體含有不同于其他牦牛品種(群體)特殊的父系遺傳信息，而且進一步表明牦牛Y染色體遺傳變異比較豐富且蘊含著豐富的遺傳信息。在本研究中，在同德牦牛中共確定了6種Y染色體單倍型(即Y1H1、Y1H2、Y1H3、Y1H4、Y1H5和Y2H6)，與先前Li等[3]和馬志杰[5]的研究報道相比，其單倍型數(shù)目與大通、麥洼、巴州牦牛所擁有的單倍型數(shù)目(6種)相同，只低于高原牦牛的單倍型數(shù)目(7種)，而高于其他品種(群體)所擁有的Y染色體單倍型數(shù)(2～5種)。與此同時，本研究表明同德牦牛的Y染色體單倍型多樣度(Hd)為0.714±0.060，這與我國其他家、野牦牛品種(群體)Y染色體單倍型多樣度值(0.117～0.821)相比[5]，該值也較高，僅低于野牦牛(0.821±0.101)和巴州牦牛(0.727±0.067)的相應值[5]，說明同德牦牛具有豐富的父系遺傳多樣性。同德牦牛所處地理位置特殊，母系遺傳多樣性較高(Hd= 0.935±0.023)[9]，而本研究進一步揭示其具有豐富的父系遺傳多樣性且擁有特殊的父系遺傳信息，說明該群體蘊含豐富的遺傳變異，可為牦牛品種(品系)培育提供良好的素材，故建議繼續(xù)深入開展同德牦?；蚪M、轉(zhuǎn)錄組及蛋白組學等方面的系統(tǒng)研究，為其種質(zhì)資源的合理保護和開發(fā)利用奠定基礎。

動物的起源和系統(tǒng)發(fā)育研究有助于揭示其進化歷史、系統(tǒng)發(fā)育關系和復雜的遺傳背景。先前對牦牛父系起源的研究中，表明我國家、野牦牛均擁有2個明顯的父系支系，提示牦牛有2個父系起源[3-6]。在本研究中，對同德牦牛6種Y染色體單倍型構建的網(wǎng)絡關系圖中，6種Y染色體單倍型也分為明顯的2個大分支，表明同德牦牛也由2個大的父系支系組成，有2個父系起源，這與前人對其他牦牛品種(群體)的研究結(jié)果一致[3-6]。

4 結(jié) 論

青海省同德牦牛群體具有豐富的父系遺傳多樣性，蘊含特殊的父系遺傳信息，由2個父系支系組成，擁有2個父系起源。