楊東來(lái)，劉 丹，王 旭，彭 菲

（滿洲里出入境檢驗(yàn)檢疫局，內(nèi)蒙古滿洲里 021400）

蜂蜜中蜜蜂美洲幼蟲腐臭病的檢測(cè)方法研究

楊東來(lái)，劉 丹，王 旭，彭 菲

（滿洲里出入境檢驗(yàn)檢疫局，內(nèi)蒙古滿洲里 021400）

美洲幼蟲腐臭病是世界上最嚴(yán)重的蜜蜂病害之一，病原體是幼蟲芽孢桿菌。在蜂蜜中檢測(cè)幼蟲芽孢桿菌的有效方法很少。本研究將微生物培養(yǎng)法和PCR法結(jié)合，改進(jìn)了對(duì)病原菌的培養(yǎng)和分離，再用PCR法進(jìn)行定性鑒別，從而降低了檢出限，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

美洲幼蟲腐臭??；幼蟲芽孢桿菌；蜂蜜；檢測(cè)；微生物培養(yǎng)；PCR法

美洲幼蟲腐臭病[1-2]（American foulbrood disease，AFB）是世界上最嚴(yán)重的蜜蜂病害之一，主要感染蜜蜂幼蟲。幼蜂一旦感染AFB后，如果沒有適當(dāng)?shù)闹委?，感染的蜜蜂就?huì)很快死亡，而且還會(huì)擴(kuò)散到整個(gè)蜂群，甚至感染其他有過接觸的蜂群，導(dǎo)致整個(gè)蜂群死亡。AFB的病原是幼蟲芽孢桿菌（Paenibacillus larvae），主要感染西方蜜蜂，蜜蜂幼蟲通過食入污染病原的食物而感染[3-4]。其對(duì)1日齡的蜜蜂幼蟲的感染率很高，對(duì)2日齡的幼蟲感染率較低，對(duì)3日齡以上及成蟲不具有感染性。蜜蜂幼蟲感染后，癥狀表現(xiàn)為體表顏色由原來(lái)的白色逐漸變黑褐色，身體脫水，體表有微小的鱗片狀物，最后干枯，緊貼在蜂巢房壁上。幼蟲芽孢桿菌只有在芽孢狀時(shí)才具有感染性，其他的營(yíng)養(yǎng)體不具有感染性。由于具有芽孢這種特殊結(jié)構(gòu)，使感染性的幼蟲芽孢桿菌具有很強(qiáng)的生存能力，對(duì)高溫、酸堿和化學(xué)消毒劑有很強(qiáng)的耐受性。

目前檢測(cè)幼蟲芽孢桿菌的方法有癥狀診斷法、微生物學(xué)診斷法、生化診斷法、牛乳診斷法、PCR診斷法等[2,4-5]。其中PCR診斷法對(duì)幼蟲芽孢桿菌的診斷快速、準(zhǔn)確，靈敏度高，是當(dāng)前的主要診斷手段。

上述方法主要檢 測(cè)對(duì)象是蜜蜂的個(gè)體，如PCR法是從蜜蜂身體中提取DNA來(lái)確定有沒有幼蟲芽孢桿菌特定基因片段。這些方法用于檢測(cè)蜂蜜中的幼蟲芽孢桿菌有很大的局限性。有關(guān)把蜂蜜作為對(duì)象來(lái)檢測(cè)幼蟲芽孢桿菌的方法較少，主要原因在于蜂蜜較為粘稠，成分復(fù)雜，芽孢分布不均勻，幼蟲芽孢桿菌不能很好分離收集，使得檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，誤檢率高。

本檢測(cè)法是在原有方法的基礎(chǔ)上，根據(jù)蜂蜜樣品的特殊性，改進(jìn)病原菌的培養(yǎng)分離方法，將微生物診斷法和PCR法[5-6]結(jié)合到一起，提高檢測(cè)的精度和準(zhǔn)確性。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株。Paenibacillus larvae，編號(hào)為ATCC 9545，購(gòu)自ATCC（美國(guó)菌種保藏中心）。

1.1.2 主要試劑。培養(yǎng)基，購(gòu)自北京陸橋；快速DNA提取擴(kuò)增試劑盒，編號(hào)KG201，購(gòu)自上海生工；引物購(gòu)自上海生工，正向：5'-CTT GTG TTT CTTT CGG GAG AGG CCA-3'，反向：5'-TCT TAG AGT GCC CAC CTC TGCG-3'，PCR產(chǎn)物大小為1 106 bp。

1.1.3 主要設(shè)備。PCR儀（Biometra TADVANCED）、凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)伯樂 Gel Doc XR+）

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前期處理。取蜂蜜樣品100 g，45 ℃水浴20 min；待蜂蜜的粘稠度降低，攪拌均勻，從中稱取10 mL蜂蜜樣品加入10 mL無(wú)菌生理鹽水；渦旋混勻，80 ℃水浴震蕩20 min。

1.2.2 病原菌的培養(yǎng)。培養(yǎng)基為腦心浸液培養(yǎng)基（BHI瓊脂培養(yǎng)基），高壓滅菌后放冷到90 ℃左右；取處理的蜂蜜樣品1 mL加入到培養(yǎng)平板中，倒入BHI瓊脂培養(yǎng)基15 mL，搖勻；凝固后，放37 ℃培養(yǎng)箱培育72 h，觀察培養(yǎng)皿中菌落的生長(zhǎng)情況。

1.2.3 菌落收集。在培養(yǎng)平板中有菌落生長(zhǎng)時(shí)，觀察菌落特征，收集疑似菌落。幼蟲芽孢桿菌的菌落特征是顏色灰白，表面粗糙，凹凸不平，菌落邊緣不光滑不整齊，并且菌落具有遷移性，隨培養(yǎng)時(shí)間不同位置會(huì)發(fā)生游走[4]。對(duì)疑似幼蟲芽孢桿菌菌落，用接種針或小藥匙將菌落挑起放入離心管中，加入2 mL無(wú)菌生理鹽水，渦旋混勻。

1.2.4 PCR檢測(cè)。取上步菌液200 μL，按照快速DNA提取擴(kuò)增試劑盒操作說明，提取DNA，加入引物，對(duì)特異基因進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察有無(wú)目的條帶。具體參數(shù)為反應(yīng)體積20 μL，反應(yīng)循環(huán)：94 ℃/3 min→（94 ℃/30 s→55 ℃/30 s 72/1 min）35 個(gè)循環(huán)→72 ℃/5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL產(chǎn)物，用于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果

如果1.1.2中的培養(yǎng)平板沒有菌落生長(zhǎng)，判斷為沒有檢測(cè)到幼蟲芽孢桿菌，美洲幼蟲腐臭病為陰性；如果培養(yǎng)平板中有菌落生長(zhǎng)，則進(jìn)行1.2.3和1.2.4中的操作。如果在瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中的1 106 bp處有條帶，則判斷為檢測(cè)到幼蟲芽孢桿菌，如果沒有，則判斷為沒有檢測(cè)到幼蟲芽孢桿菌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，泳道1~3在1 106 bp處有目的條帶，為陽(yáng)性，同樣泳道6~8為陽(yáng)性，其余泳道沒有目條帶，為陰性（圖1）。

圖1 PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

3 討論分析

本檢測(cè)方法是將微生物培養(yǎng)法和PCR法結(jié)合到一起，很大程度地提高了檢測(cè)的精確性和準(zhǔn)確性。微生物培養(yǎng)法也是鑒別幼蟲芽孢桿菌的重要方法，單純用微生物培養(yǎng)法檢測(cè)，樣品培養(yǎng)后很容易出現(xiàn)雜菌，這將增加鑒別的難度。另外國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道在蜂蜜中發(fā)現(xiàn)有18種芽孢桿菌的和幼蟲芽孢桿菌形態(tài)學(xué)相近[7]，鏡檢鑒別很難區(qū)分，所以只用微生物法培養(yǎng)很容易出現(xiàn)誤檢。

隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)成為了生物學(xué)鑒定的重要方法，也是當(dāng)前幼蟲芽孢桿菌的主要檢測(cè)方法。但是直接以蜂蜜為樣本檢測(cè)幼蟲芽孢桿菌在實(shí)際操作中卻有這很大的局限性，最大的問題是當(dāng)芽孢在蜂蜜中濃度小于一定程度時(shí)無(wú)法保證有效的提取DNA，但可通過添加陽(yáng)性菌液對(duì)照試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)本文方法和直接提取DAN法這兩種方法的靈敏度高低。把幼蟲芽孢桿菌菌液不同梯度稀釋，80℃水浴震蕩20 min，用瓊脂平板法[8]計(jì)數(shù)確定菌液的濃度，然后添加到無(wú)菌蜂蜜樣品中，計(jì)算蜂蜜中幼蟲芽孢桿菌的濃度，得到含有不同濃度幼蟲芽孢桿菌的蜂蜜樣品，用兩種方法檢測(cè)的結(jié)果如圖1。泳道6~10為直接在蜂蜜中提取的DNA和 PCR后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。只有當(dāng)蜂蜜中幼蟲芽孢桿菌的濃度大于500個(gè)/mL時(shí)才能準(zhǔn)確的檢測(cè)到幼蟲芽孢桿菌；當(dāng)蜂蜜中幼蟲芽孢桿菌數(shù)量低于這個(gè)濃度時(shí)，檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，也就檢測(cè)不到幼蟲芽孢桿菌。泳道1~5為本文的檢測(cè)方法先微生物培養(yǎng)、PCR，再瓊脂糖凝膠電泳。當(dāng)蜂蜜中幼蟲芽孢桿菌的數(shù)量大于100個(gè)/mL時(shí)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確；當(dāng)小于這個(gè)濃度時(shí)，檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，同樣也就檢測(cè)不到幼蟲芽孢桿菌。

本檢測(cè)方法改進(jìn)了微生物的培養(yǎng)方法，增加了取樣量（可以在微生物培養(yǎng)環(huán)節(jié)做多平行），可有效分離擴(kuò)增幼蟲芽孢桿菌。該方法利用PCR對(duì)培養(yǎng)后的菌落進(jìn)行鑒定，有效降低了幼蟲芽孢桿菌的誤檢率，降低了檢測(cè)濃度，保證了幼蟲芽孢桿菌檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率。

[1] 陳勝祿.中國(guó)養(yǎng)蜂學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001：592-593.

[2] New Antibiotic For AFB[J]. Bee Culture，2012：75.

[3] FRIES I，LINDSTROM A，KORPELA S. Vertical transmission of American foulbrood in honey bees[J]. Veterinary Microbiology，2006，114：269-274.

[4] 農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局，中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心. 陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)：哺乳動(dòng)物、禽鳥與蜜蜂[M]. 5版.北京：中國(guó)科技出版社，2007：985-987.

[5] 農(nóng)業(yè)部. 蜜蜂幼蟲腐臭病診斷技術(shù)規(guī)范：NY/T 1951—2010[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[6] PIICCINI C，ALESSANDRO B D，ANTUNEZ K. Detection of Paenibacillus larvae subspecies larvae spores in naturally infected bee larvae and artificially contaminated honey by PCR[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2002，18（8）：761-765.

[7] ANTUNEZ K，ALESSANDRO B D，CORBELLA E，et al. Paenibacillus larvae spores in honey samples from Uruguay：a nationwide survey[J]. Invertebrate pathology，2004，86：56-58.

[8] 衛(wèi)生部. 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定：GB 4789.2—2010[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Study on the Detection Method of American Foulbrood in Honey

Yang Donglai，Liu Dan，Wang Xu，Peng Fei
（Manzhouli Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Manzhouli，Inner Mongolia 021400）

American foulbrood is one of the most severe diseases of honeybee. The causative agent isPaenibacillus larvae. There are few effective methods to detectBacillusin honey. In this study，microbial culture method and PCR method were combined to improve the cultivation and isolation of pathogenic bacteria，and then qualitative identif i cation was carried out by PCR method，in order to reduce the detection limit and to improve the accuracy of detection.

American foulbrood；Paenibacillus larvae；honey；detection；microbial cultivation；PCR

S851.34

：B

：1005-944X（2017）07-0105-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.07.029