孫學(xué)強(qiáng)，邵衛(wèi)星，張如民，南文龍，張興進(jìn)，宮楓舉，張秀娟，劉 爽

（1. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 青島立見(jiàn)診斷技術(shù)發(fā)展中心，山東青島 266114；3. 鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州 450121）

三種感染動(dòng)物陽(yáng)性血清與口蹄疫病毒重組非結(jié)構(gòu)蛋白的反應(yīng)原性

孫學(xué)強(qiáng)1，2，邵衛(wèi)星1，2，張如民3，南文龍1，張興進(jìn)2，宮楓舉2，張秀娟1，劉 爽1

（1. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 青島立見(jiàn)診斷技術(shù)發(fā)展中心，山東青島 266114；3. 鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州 450121）

本試驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)比對(duì)分析GenBank中口蹄疫病毒（A型、O型和亞洲1型）非結(jié)構(gòu)蛋白的保守序列，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，優(yōu)化合成了非結(jié)構(gòu)蛋白基因，經(jīng)過(guò)測(cè)序和轉(zhuǎn)化，篩選到能夠表達(dá)重組非結(jié)構(gòu)蛋白的陽(yáng)性重組菌株。經(jīng)過(guò)Western-blot試驗(yàn)，證明表達(dá)的重組非結(jié)構(gòu)蛋白能分別與口蹄疫病毒感染的牛、羊和豬陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。該重組蛋白待進(jìn)一步驗(yàn)證后，可用于口蹄疫病毒感染動(dòng)物的鑒別檢測(cè)試劑盒研究。

口蹄疫病毒；感染血清；重組非結(jié)構(gòu)蛋白；反應(yīng)原性

口蹄疫是全球性最重要的動(dòng)物健康問(wèn)題之一，在世界大部分地區(qū)時(shí)有發(fā)生，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的須通報(bào)疫病?？谔阋卟《緦儆谖NA病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒屬（Aphthovirus），有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3及Asia1型7個(gè)血清型[1]?？谔阋卟《镜幕蚪M由5′UTR、ORF和3′UTR及PolyA組成，全長(zhǎng)約8 500 nt，開(kāi)放讀碼框架區(qū)（ORF，Open Reading Frame）編碼1個(gè)多聚蛋白，依次為L(zhǎng)pro蛋白編碼區(qū)、P1區(qū)、P2區(qū)和P3區(qū)[2-3]，基因組結(jié)構(gòu)為VPg_5_ UTR[Lpro/1A—1B—1C—1D—2Anpgp/2B—2C/3A—3B—3C—3D]3_UTR—polyA。用3ABC基因編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白（Non-structural protein，NSP）為抗原，檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)的NSP抗體是一種很好的區(qū)分感染動(dòng)物和疫苗免疫動(dòng)物的診斷方法[4]。檢測(cè)3ABC抗體，免疫動(dòng)物3ABC抗體陰性，感染動(dòng)物則為陽(yáng)性[1]。

大多數(shù)發(fā)展中國(guó)家一直都在通過(guò)注射滅活疫苗的辦法來(lái)控制該病的流行。去除滅活疫苗中的非結(jié)構(gòu)蛋白成為質(zhì)量控制的關(guān)鍵[5]。隨著口蹄疫滅活疫苗純化工藝的發(fā)展[6]，研發(fā)并應(yīng)用以口蹄疫病毒NSP為抗原檢測(cè)動(dòng)物血清中的特異性抗體，以區(qū)別臨床病例的感染和免疫，對(duì)于口蹄疫的防控意義重大。本試驗(yàn)通過(guò)基因優(yōu)化并合成了表達(dá)口蹄疫病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌。重組陽(yáng)性克隆經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后表達(dá)的重組NSP能夠與牛、羊和豬的病毒感染陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。該重組蛋白是研究開(kāi)發(fā)口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的良好候選抗原。

1 材料和方法

1.1 血清、酶和基因合成

經(jīng)過(guò)病毒中和試驗(yàn)驗(yàn)證的?？谔阋卟《靖腥娟?yáng)性血清、羊口蹄疫病毒感染陽(yáng)性血清、豬口蹄疫病毒感染陽(yáng)性血清，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供；口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；Taq酶、限制酶，購(gòu)自寶生物（大連）工程有限公司；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；硝酸纖維素膜及電泳試劑等，為Sigma公司產(chǎn)品；核酸膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、增強(qiáng)型HRPDAB底物顯色試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；表達(dá)載體pET-28a，為本實(shí)驗(yàn)室保存；酶標(biāo)6His標(biāo)簽蛋白單抗，購(gòu)自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因優(yōu)化合成及鑒定。以NCBI公布口蹄疫病毒（A型、O型和亞洲1型）的非結(jié)構(gòu)蛋白序列通過(guò)BLASTP比對(duì)，以保守蛋白序列為重組目的蛋白，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化DNA序列，在5′端加入NdeI酶切位點(diǎn)和6His標(biāo)簽蛋白序列，在3′端依次加入終止密碼子和HindIII酶切位點(diǎn)序列，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成并克隆至表達(dá)載體pET-28a。重組表達(dá)載體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。重組表達(dá)質(zhì)粒鑒定引物FP（5′AATACGACTCACTATAGGG3′）和RP（5′TGCTAGTTATTGCTCAGCGG3′）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

圖1 重組表達(dá)載體圖譜

1.2.2 重組表達(dá)載體的鑒定和重組菌株轉(zhuǎn)化。將含有重組表達(dá)載體的大腸桿菌接種LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，取2 μL菌液用FP和RP進(jìn)行PCR擴(kuò)增并電泳鑒定。取2 mL菌液，12 000 r/min 離心120 s，菌體后加入500 μL溶液Ⅰ，充分混勻；加入500 μL溶液Ⅱ后輕柔顛倒混勻至液體清亮；加入700 μL溶液Ⅲ混勻，4 ℃ 13 000 r/min離心 10 min；將上清液體移至吸附柱中，離心60 s；棄濾液，加入500 μL 70%乙醇溶液洗滌，13 000 r/min離心120 s；將吸附柱放入新EP管中，加入 30 μL 洗脫液，然后13 000 r/min 離心1 min，收集的洗脫液中即為重組表達(dá)載體。取重組表達(dá)載體質(zhì)粒10 μL、HindIII 1 μL、NdeI 1 μL、10×T Buffer 3 μL、去離子水5 μL，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。取重組質(zhì)粒2 μL加入到 100 μL 新鮮的大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，輕柔吹打混勻，冰浴30 min；然后置42 ℃水浴中熱休克90 s，迅速置冰中冷卻2~3 min；加入800 μL LB培養(yǎng)基，37 ℃ 120 r/min 震蕩培養(yǎng)45 min；取100 μL菌液，涂布于含100 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h。挑取轉(zhuǎn)化后在抗性平板上生長(zhǎng)的單菌落，接種于含有卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)10 h后，取2 μL菌液用FP和RP進(jìn)行PCR擴(kuò)增并電泳鑒定。

1.2.3 非結(jié)構(gòu)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。將鑒定正確的含有重組表達(dá)質(zhì)粒的BL21（DE3）宿主菌的陽(yáng)性克隆菌株按1:50倍接種于10 mL含1:1 000稀釋的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)7 h；然后取5 mL加入IPTG至終濃度1 mmol/L，37 ℃振蕩培養(yǎng)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)6 h后，所有樣品各取0.5 mL，13 000 r/min離心60 s，移出上清液加入蛋白電泳載樣緩沖液；沉淀細(xì)菌加入40 μL PBS重懸沉淀，充分混勻后加入蛋白電泳載樣緩沖液；100 ℃水浴10 min，13 000 r/min離心5 min，各取10 μL上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.4 三種動(dòng)物感染陽(yáng)性血清與重組蛋白的反應(yīng)原性。按照常規(guī)方法制備12%分離膠和5%的濃縮膠，每孔上樣5 μL，80 V進(jìn)行電泳濃縮，當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后改變電壓為120 V。采用半干法轉(zhuǎn)印至NC膜，用5%的脫脂奶封閉過(guò)夜；將樣品轉(zhuǎn)印膜分別在含有20 μL酶標(biāo)6His標(biāo)簽蛋白單抗、?？谔阋卟《靖腥娟?yáng)性血清、羊口蹄疫病毒感染陽(yáng)性血清和豬口蹄疫病毒感染陽(yáng)性血清的20 mL TBST中37 ℃孵育1 h后，用TBST洗滌2次，每次10 min；三種陽(yáng)性血清孵育的轉(zhuǎn)印膜在含有20 μL HRP-SPA的TBST中37℃孵育1 h，然后用TBST洗滌2次，用DAB顯色約30 s后終止反應(yīng)，晾干觀察。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)載體的合成目的基因序列分析

根據(jù)測(cè)序報(bào)告，將優(yōu)化合成的非結(jié)構(gòu)蛋白基因序列進(jìn)行翻譯；對(duì)翻譯后的蛋白序列經(jīng)過(guò)GenBank比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與口蹄疫病毒A型、O型和Asia 1型的非結(jié)構(gòu)蛋白同源性達(dá)到96%。

2.2 重組表達(dá)載體的PCR和酶切鑒定

將含有重組表達(dá)載體的大腸桿菌接種LB液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后，取2 μL菌液用FP和RP進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)電泳后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，結(jié)果出現(xiàn)特定長(zhǎng)度的擴(kuò)增片段。對(duì)培養(yǎng)物小提質(zhì)粒后，用HindIII和NdeI雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)過(guò)電泳也出現(xiàn)與PCR鑒定相同長(zhǎng)度的目的基因片段（圖2）。

圖2 重組表達(dá)載體的PCR和酶切鑒定電泳圖譜

2.3 重組菌株轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)表達(dá)

將鑒定正確的含有重組表達(dá)質(zhì)粒，以熱激法轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)BL21（DE3）宿主菌，經(jīng)過(guò)PCR鑒定，在陽(yáng)性克隆菌株中出現(xiàn)特定長(zhǎng)度的擴(kuò)增條帶。將陽(yáng)性克隆菌株接種于10 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)7 h后，用 IPTG誘導(dǎo)6 h，制備誘導(dǎo)后的菌體和上清蛋白樣品，然后進(jìn)行SDS-PAGE。凝膠經(jīng)過(guò)染色后觀察發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)前的菌體和上清以及誘導(dǎo)后的上清均未出現(xiàn)表達(dá)條帶，誘導(dǎo)后菌體出現(xiàn)豐度較高的表達(dá)條帶（圖3）。

圖3 重組陽(yáng)性克隆誘導(dǎo)產(chǎn)物SDS-PAGE圖譜

2.4 三種動(dòng)物感染陽(yáng)性血清與重組非結(jié)構(gòu)蛋白的反應(yīng)結(jié)果

將誘導(dǎo)后的培養(yǎng)物上清和菌體蛋白電泳樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，再次進(jìn)行SDS-PAGE電泳。用半干法將PAGE膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)印至NC膜，進(jìn)行western-blot試驗(yàn)。轉(zhuǎn)印的NC膜經(jīng)過(guò)封閉后分別與酶標(biāo)6His標(biāo)簽蛋白單抗、牛口蹄疫病毒感染陽(yáng)性血清、羊口蹄疫病毒感染陽(yáng)性血清、豬口蹄疫病毒感染陽(yáng)性血清各20 μL進(jìn)行反應(yīng)，最后參照增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行顯色。觀察顯色條帶，發(fā)現(xiàn)酶標(biāo)6His標(biāo)簽蛋白單抗與重組非結(jié)構(gòu)蛋白出現(xiàn)雜交條帶，表明構(gòu)建、鑒定和篩選的重組質(zhì)粒以及含有重組質(zhì)粒的菌株能夠表達(dá)完整的重組目的蛋白；表達(dá)的重組蛋白與牛、羊和豬口蹄疫病毒感染陽(yáng)性血清反應(yīng)均出現(xiàn)雜交條帶，證明篩選的陽(yáng)性克隆菌株能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生的重組非結(jié)構(gòu)蛋白能夠與牛、羊、豬口蹄疫病毒感染陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，而且反應(yīng)原性良好（圖4）。

圖4 牛、豬、羊感染陽(yáng)性血清及酶標(biāo)6His標(biāo)簽蛋白單抗與重組非結(jié)構(gòu)蛋白圖譜的western-blot圖譜

3 討論

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性動(dòng)物疫病。目前，我國(guó)仍是口蹄疫危害較為嚴(yán)重的國(guó)家之一，流行情況比較復(fù)雜。O型、Asia 1型、A型3種血清型口蹄疫病毒并存，豬牛羊等易感動(dòng)物都有感染。我國(guó)當(dāng)前主要的口蹄疫預(yù)防方針是實(shí)行區(qū)域化管理，嚴(yán)格落實(shí)免疫預(yù)防、監(jiān)測(cè)凈化等防治措施。在監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查方面，縣級(jí)動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)以抗體監(jiān)測(cè)和病原學(xué)初篩為主；地市級(jí)和省級(jí)動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)以病原學(xué)監(jiān)測(cè)為主[7]。因此，口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的檢測(cè)試劑對(duì)于口蹄疫防控工作至關(guān)重要，研究開(kāi)發(fā)能夠滿足需求的檢測(cè)試劑盒意義重大。

本試驗(yàn)通過(guò)基因優(yōu)化合成獲得非結(jié)構(gòu)蛋白的目的基因，未采用提取口蹄疫病毒RNA通過(guò)RTPCR獲得目的基因。這不但避免了直接操作一類(lèi)病原微生物存在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)根據(jù)遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性和大腸桿菌密碼子偏好性，也提高了目的基因能夠在大腸桿菌宿主菌中的表達(dá)效率。本試驗(yàn)中選擇3種感染動(dòng)物的陽(yáng)性血清對(duì)重組表達(dá)蛋白進(jìn)行免疫雜交，其試驗(yàn)結(jié)果和篩選到的陽(yáng)性克隆更有利于下游的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和開(kāi)展。但是，對(duì)于所用的3種動(dòng)物陽(yáng)性血清，由于條件限制，未能確定其感染的口蹄疫病毒亞型。對(duì)于該重組蛋白與3種易感動(dòng)物感染口蹄疫病毒不同亞型的陽(yáng)性血清以及免疫動(dòng)物的陽(yáng)性血清的反應(yīng)原性，已通過(guò)建立ELISA方法得到了進(jìn)一步驗(yàn)證，相關(guān)研究結(jié)果和數(shù)據(jù)另文發(fā)表。

利用口蹄疫病毒重組NSP建立檢測(cè)方法的研究報(bào)道很多，有的是用病毒基因組直接提取核酸克隆NSP基因進(jìn)行原核表達(dá)[8]，有的用酵母細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)[9]，有的建立了ELISA抗體檢測(cè)方法[10-11]，有的研發(fā)膠體金試紙條[12]，有的建立了斑點(diǎn)免疫金滲濾法[13]，而且有報(bào)道國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體檢測(cè)試劑盒可以用于?？谔阋哐鍖W(xué)篩選性試驗(yàn)[14]。本試驗(yàn)獲得的表達(dá)口蹄疫重組非結(jié)構(gòu)蛋白能夠與牛、羊和豬的病毒感染陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，可以作為研究開(kāi)發(fā)口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白多種抗體檢測(cè)試劑盒的良好候選抗原。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Reactionogenicity of Foot-and-mouth Disease Virus Recombinant Non-structural Protein against the Positive Sera of Infected Bovine，Goat and Swine

Sun Xueqiang1，2，Shao Weixing1，2，Zhang Rumin3，Nan Wenlong1，Zhang Xingjin2，Gong Fengju2，Zhang Xiujuan1，Liu Shuang1
（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. Qingdao Regen Diagnostics Development Center，Qingdao，Shandong 266114；3. Zhengzhou Technical College，Zhengzhou，Henan 450121）

The conserved non-structural protein（NSP）sequence of Foot-and-mouth disease virus（type A，type O and type Asia 1）was conf i rmed by blastp from GenBank. The DNA sequence coding the truncated conserved NSP was optimized according to the bias ofE. coli. It was synthesized and cloned to expression vector. After sequencing and transformation，the positive recombinant strains expressing recombinant NSP were screened. Using western-blot，it was conf i rmed that the recombinant truncated NSP could react against with the positive sera of infected bovine，goat and swine. So that，the recombinant truncated NSP could be used as an antigen to develop the DIVA diagnostics kits.

FMDV；infected positive sera；recombinant non-structural protein；reactionogenicity

S852.65

：B

：1005-944X（2017）07-0092-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.07.026

科技部科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2012FY111000）