萬曉龍,趙凌宇,董水瀅

西安交通大學第二附屬醫(yī)院消化內科(西安710004)

miR-15b-5p在胃癌組織中的表達及其臨床意義

萬曉龍,趙凌宇,董水瀅

西安交通大學第二附屬醫(yī)院消化內科(西安710004)

目的：檢測miR-15b-5p在胃癌中的表達變化，探索其對胃癌細胞功能的影響。方法：采用實時定量PCR檢測35例胃癌組織及其對應的癌旁正常胃組織中miR-15b-5p的表達；構建miR-15b-5p過表達載體及合成miR-15b-5p抑制劑，并轉染胃癌細胞系AGS；應用MTT法檢測胃癌細胞增殖能力變化；采用流式細胞術分析miR-15b-5p對細胞周期和凋亡的影響。結果：miR-15b-5p在胃癌組織中的表達顯著下調(P<0.01)；轉染miR-15b-5p過表達載體抑制了胃癌細胞的增殖，將細胞周期阻滯在G0/G1期，并誘導了細胞凋亡；轉染miR-15b-5p抑制劑促進了胃癌細胞的增殖，使細胞進入S和G2/M期，并抑制細胞凋亡。結論：miR-15b-5p在胃癌中下調，抑制胃癌細胞的增殖，并誘導細胞凋亡。

胃癌全球范圍內發(fā)病率僅次于肺癌、乳腺癌和結腸癌，位居第四位，病死率居惡性腫瘤的第二位[1]。中國是世界上胃癌高發(fā)的國家之一，胃癌的發(fā)病率居惡性腫瘤第二位，每年有近30萬人死于胃癌,約40萬新發(fā)病例[2]。盡管采取了包括手術切除、放射治療、化學治療以及其它綜合性的治療措施, 然而治療效果欠佳。胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及癌基因/抑癌基因的異常激活/雜合性丟失、免疫改變、表觀遺傳學改變等, 是一個多因素、多階段的網絡調控過程。近年來的研究表明核酸水平的調控也與胃癌的發(fā)生發(fā)展關系密切，特別是非編碼微小RNA (microRNA，miRNA)通過調控其靶基因的表達影響胃癌發(fā)生發(fā)展。miRNA是一類長度為18～25nt，具有高度保守性的非編碼單鏈小分子RNA，它通過調節(jié)靶基因的表達，參與細胞存活、增殖、分化和凋亡等生物學過程。miRNA通過與靶基因的mRNA的3′端非翻譯區(qū)互補性結合，直接降解mRNA或抑制mRNA的翻譯從而導致靶基因的表達下調[3]。最近的研究報道發(fā)現miR-15b-5p在肝癌中扮演者重要的角色[4]，而miR-15b-5p在胃癌發(fā)生發(fā)展中作用尚未見報道。本研究旨在探討miR-15b-5p在胃癌組織中的表達變化和其在胃癌中的作用。

材料與方法

1 材 料 西安交通大學第二附屬醫(yī)院外科手術切除的胃癌組織及其對應的癌旁正常胃組織35例，手術后均經病理檢查確認，采集前經過醫(yī)院倫理委員會批準及患者知情同意。所有患者手術前均未經化療、放療等治療，樣本收集后置于液氮中長期保存。人胃癌細胞系AGS由西安交通大學第二附屬醫(yī)院轉化醫(yī)學中心提供并保存。

2 儀器與試劑 -80℃冰箱(日本SANYO公司)；CO2培養(yǎng)箱(英國RS Biotech公司)；高通量微板測試系統(tǒng)(德國BMG Labtechnologies公司)；流式細胞儀(美國FALS CALIBAR BD公司)；實時定量PCR儀(美國Bio - Rad公司，iQ5 Multicolor)。新生胎牛血清(美國Gibico公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；MTT、RnaseA、碘化丙啶(美國Sigma公司)；Annexin V-FITC凋亡試劑盒(美國BD BioScience公司)；Trizol和Lipofectamine2000(美國Invitogen公司)；qRT-PCR試劑盒和逆轉錄試劑盒(大連TaKaRa公司)。

3 miR-15b-5p過表達載體的構建及抑制劑的合成 通過生物信息學方法在miRbase查找miR-15b-5p序列(F5′ TTGAGGCCTTAAAGTACTGTAGCAGCACA TCATGGTTTACATGCTACAGTCAAGATGCGAATCATTATTTGCTGCTCTAGAATTTAAGGAAATTCAT3′ R)并在兩端構建EcoR I和Hind III酶切位點，序列由上海生工生物工程有限公司合成。然后將該序列克隆到真核表達載體pcDNA6.2-GW/EmGFP中，并由上海生工生物工程有限公司克隆、篩選、測序鑒定。miR-15b-5p-inhibitor(5′ TGTAAACCATGATGTGCTGCTA3′)和miR-15b-5p-inhibitor陰性對照(Inhibitor NC，5′TGACTGTACTGACTCGACTG3′)也由上海生工生物工程有限公司合成。

4 細胞培養(yǎng)與轉染 人胃癌AGS細胞系培養(yǎng)于含10%新生胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在5 % CO2，37 ℃孵箱中培養(yǎng)，取對數生長期的AGS細胞進行實驗。實驗分組為：pcDNA6.2空載體為對照組(miR-control)、miR-15b-5p過表達載體組(miR-15b-5p)、miR-15b-5p抑制劑陰性對照組(Inhibitor NC)、miR-15b-5p抑制劑組(miR-15b-5p inhibitor)。細胞在種植24h時，各組依照Lipofectamine2000(美國Invitogen公司)轉染試劑說明書進行瞬時轉染。

5 實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 在臨床胃癌樣本組織、癌旁正常胃組織、轉染24h時的AGS細胞中加入Trizol，用氯仿、異丙醇等提取總RNA。取1μ1總RNA，分別加入特異性莖環(huán)引物(內參U6-RT：5′ CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3′；miR-15b-5p-RT：5′ GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTG CACTGGATACGACTGTAAAC3′)，依照試劑盒說明書操作逆轉錄cDNA，反應溫度：42℃ 15min，85℃ 5s。qRT-PCR反應，按照序列設計引物。內參U6 Forward: 5′GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3′；Reverse: 5′CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3′。miR-15b-5p Forward: 5′ATCCAGTGCGTGTCGTG3′；Reverse: 5′TGCTTAGCAGCACATCATG3′。擴增條件：95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40個循環(huán)，72℃延伸5min終止反應。所有樣品均設立3個復孔，用2-△△Ct法對結果相對定量分析。

6 MTT比色法實驗 AGS細胞以5000個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)基為200μl/孔。每組5個復孔，轉染miR-15b-5p過表達載體和抑制劑后分別培養(yǎng)24、48、72h，每孔加入5mg/ml MTT溶液20μl，再培養(yǎng)4h，去掉上清液并加入150μl DMSO，震蕩，在微板測試儀上檢測光吸收值，波長為490nm。

7 流式細胞儀檢測細胞周期 轉染48h時收集各組細胞，每組3個復孔，用預冷的PBS洗滌2次，75%乙醇過夜固定；然后加濃度為100μg/ml碘化丙啶(PI)染液0.3ml，室溫避光靜置15min；采用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長是488nm，PI的紅色熒光通過630nm的濾光片進行信號收集，通過Modfit LT軟件分析DNA含量變化，進而分析細胞周期變化。

8 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集轉染48h的各組細胞，每組3個復孔，用預冷的PBS洗滌2次。用結合緩沖液500μ1懸浮細胞，分別加入5μ1 Annexin V/FITC和5μ1 20μg/ml的PI，混勻，室溫避光靜置15min。用流式細胞儀檢測，PI受激發(fā)后發(fā)紅色熒光，FITC發(fā)綠色熒光，檢測結果用隨機軟件分析。

結 果

1 miR-15b-5p在胃癌組織中的表達 應用qRT-PCR檢測35對胃癌組織及其癌旁正常胃組織miR-15b-5p的表達變化。結果顯示，與癌旁正常胃組織相比，miR-15b-5p在胃癌組織中表達顯著下調(P<0.01)，平均下調至0.57倍(圖1)。

2 miR-15b-5p對胃癌AGS細胞增殖的影響 在胃癌細胞系AGS細胞中分別轉染空載體(miR-control)、miR-15b-5p過表達載體(miR-15b-5p)、抑制劑陰性對照(Inhibitor NC)、miR-15b-5p抑制劑(miR-15b-5p inhibitor)，并在轉染24h后通過qRT-PCR檢測miR-15b-5p表達變化。結果顯示，與miR-control組相比，miR-15b-5p過表達載體組miR-15b-5p表達顯著上調(P<0.01)，上調至27.5倍，而轉染抑制劑后miR-15b-5p表達無顯著變化(圖2)。通過MTT比色法分析miR-15b-5p對胃癌細胞系AGS細胞增殖能力的影響。與miR-control組相比，過表達miR-15b-5p載體48,72h時均顯著的降低了AGS細胞的增殖能力(P<0.01)；與Inhibitor NC組相比，轉染miR-15b-5p inhibitor48,72h時均顯著的增強了AGS細胞的增殖能力(P<0.01)(圖3)，說明miR-15b-5p可抑制胃癌細胞系AGS細胞增殖。

與癌旁正常胃組織相比，*P<0.01

3 miR-15b-5p對胃癌AGS細胞周期的影響 在AGS細胞中分別轉染miR-15b-5p過表達載體和miR-15b-5p Inhibitor 48h時，將其消化分撒為單細胞懸液，應用流式細胞儀檢測細胞周期。miR-15b-5p過表達載體組與miR-control組相比，G0/G1期細胞數量顯著增加(P< 0.01)，S期細胞數量顯著減少(P< 0.01)，G2/M期細胞數量也減少(P< 0.01)；miR-15b-5p Inhibitor組與Inhibitor NC組相比，G0/G1期細胞數量顯著減少(P< 0.01)，S期細胞數量顯著增加(P< 0.01)，G2/M期細胞數量無顯著差異(圖4)。證明miR-15b-5p使胃癌AGS細胞阻滯在G0/G1期，抑制細胞進入S和G2/M期進行增殖。

與miR-control組相比，*P<0.01

與miR-control組相比，* P<0.01；與Inhibitor NC組相比，# P<0.01

與miR-control組相比，* P<0.01；與Inhibitor NC組相比，# P<0.01

4 miR-15b-5p對胃癌AGS細胞凋亡的影響 在AGS中分別轉染miR-15b-5p過表達載體和miR-15b-5p Inhibitor 48h時，收獲細胞制備單細胞懸液，應用Annexin V + PI試劑盒染色，流式細胞儀檢測。與miR-control組相比，miR-15b-5p過表達載體組早期凋亡細胞顯著增加(P<0.01)，晚期凋亡細胞也增加(P< 0.01)；與Inhibitor NC組相比，miR-15b-5p Inhibitor組早期凋亡細胞顯著減少(P<0.05)，晚期凋亡細胞也減少(P< 0.05)(圖5)。這表明miR-15b-5p可誘導胃癌AGS細胞凋亡。

與miR-control組相比，*P<0.01；與Inhibitor NC組相比，#P<0.05

圖5 miR-15b-5p對胃癌細胞系AGS細胞凋亡的影響

討 論

研究表明miRNA在多種腫瘤組織中表達水平異常，這些miRNA通過靶向調控其下游靶基因的表達，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在腫瘤細胞的存活、增殖、凋亡、遷移、侵襲以及耐藥等生物學特性方面都發(fā)揮著非常重要的調控作用[5-6]。不同的miRNA在不同的腫瘤中可能扮演著原癌基因或抑癌基因的角色。

目前有關胃癌的研究中，已經發(fā)現多種miRNA的表達異常與胃癌的發(fā)生、進展以及轉移密切相關，例如，miR-15a、miR-124、miR-21、miR-23、miR-29a、miR-31、miR-34[7]。這些miRNA除了在胃癌中的表達有上調或下調的不同，它們也參與了胃癌的不同的發(fā)生發(fā)展過程。例如，miR-15a參與了胃癌細胞的增殖與侵襲，miR-29a參與了胃癌的轉移，miR-124為胃癌臨床分期的標志物。近來的研究發(fā)現miR-15b-5p參與了幾種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但是miR-15b-5p在不同腫瘤中的表達變化并不相同，其原因可能是它在不同腫瘤中的作用機制不同。研究報道m(xù)iR-15b-5p在鼻咽癌和膀胱癌中表達顯著下調[8-9]，而在肝癌中表達顯著上調[4]。我們的研究發(fā)現，miR-15b-5p在胃癌中的表達顯著下調，暗示其可能在胃癌進展中扮演抑癌基因的角色。

miR-15b-5p的生物學功能中，涉及更多的是調節(jié)腫瘤細胞生長與凋亡的功能。在不同腫瘤的進展過程中，其可能作為原癌基因存在，也可能作為抑癌基因基因發(fā)揮功能。例如，Guan等研究發(fā)現miR-15b-5p可促進子宮肌瘤細胞增殖[10]。Zhou等發(fā)現miR-15b-5p通過靶向調控TRIM29抑制鼻咽癌增殖和轉移[8]。Sun等結果表明miR-15b-5p可抑制神經膠質瘤細胞增殖和侵襲[11]。Yang等發(fā)現miR-15b-5p在肝癌中通過靶向調控Rab1A誘導內質網應激和凋亡，并抑制肝癌細胞增殖[4]。本研究結果表明：miR-15b-5p可抑制胃癌AGS細胞增殖，使胃癌細胞阻滯在G0/G1期，并誘導凋亡。

綜上所述，miR-15b-5p抑制胃癌細胞的增殖，阻斷細胞周期，并誘導細胞凋亡，由此可見miR-15b-5p在胃癌中起著抑癌基因的作用。這一結果為尋找胃癌新的分子治療靶標提供了實驗依據，但是miR-15b-5p在胃癌進展過程中的作用機制有待于進一步探索。

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(收稿：2016-11-3)

胃腫瘤/病理學 @miR-15b-5p 細胞增殖 細胞凋亡 細胞周期

R363

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.07.054