樊云芳，尹 躍，安 巍，趙建華，李彥龍，王亞軍，曹有龍

(寧夏農(nóng)林科學(xué)院 國家枸杞工程技術(shù)研究中心，銀川 750002)

TP-M13-SSR技術(shù)在枸杞遺傳多樣性研究中的應(yīng)用

樊云芳，尹 躍，安 巍，趙建華，李彥龍，王亞軍，曹有龍

(寧夏農(nóng)林科學(xué)院 國家枸杞工程技術(shù)研究中心，銀川 750002)

利用在SSR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測過程中的一種基于熒光測序技術(shù)的高通量低成本分析技術(shù)體系TP-M13-SSR對(duì)29份枸杞種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性研究。13對(duì)引物共檢測到78個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)6個(gè)等位基因。群體平均的主等位基因頻率(MAF)、有效等位基因數(shù)(NE)、觀測雜合度(HO)、期望雜合度(HE)、Shannon’s信息指數(shù)(I)和多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.625、2.684、0.401、0.514、1.103和0.487。聚類分析表明：29份枸杞種質(zhì)間相似系數(shù)為0.66～0.97，平均相似系數(shù)為0.81；供試材料可分為5大類7亞類。研究表明，供試材料的遺傳相似性較高，遺傳多樣性較低。TP-M13-SSR方法具有經(jīng)濟(jì)、靈敏、高效等優(yōu)點(diǎn)，在枸杞遺傳多樣性研究中應(yīng)用效果好。

枸杞；TP-M13-SSR；遺傳多樣性

枸杞(LyciumbararumL.)系茄科(Solanaceae)枸杞屬(LyciumL.)，全球約有80余種，主要分布在南美洲南部、北美洲南部、非洲南部和歐亞大陸[1]。中國枸杞屬有7個(gè)種3個(gè)變種，寧夏枸杞和中國枸杞分布最廣泛，寧夏枸杞主要分布在中國西北地區(qū)，中國枸杞主要分布在中國華中、西南和東南地區(qū)[2]。枸杞種質(zhì)資源研究始于20世紀(jì)50年代，細(xì)胞學(xué)、形態(tài)學(xué)、同工酶等方面的研究都在種質(zhì)資源鑒定和親緣關(guān)系研究中起積極作用[3-4]。分子標(biāo)記(RAPD、AFLP、SSR)等技術(shù)發(fā)展，為種質(zhì)資源研究提供了一條準(zhǔn)確、高效、快捷的途徑，近年來也被逐漸應(yīng)用到枸杞種質(zhì)資源的上述研究中[5-8]，SSR標(biāo)記具有高多態(tài)性、重復(fù)性、穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源鑒定及親緣關(guān)系等方面研究中。在用SSR方法進(jìn)行枸杞遺傳多樣性研究中，研究者主要采用銀染技術(shù)[9-10]，該技術(shù)存在難以讀取擴(kuò)增片段大小、試驗(yàn)過程耗時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)。

熒光測序技術(shù)在SSR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測上的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)收集和處理的自動(dòng)化，克服了銀染法的不足。Oetting等[11]首次將一段19 bp的核苷酸序列(稱為Tailed primer，即尾巴引物)引入到短串聯(lián)重復(fù)(Short tandem repeat，STR)標(biāo)記體系中，并與熒光分析技術(shù)和多重PCR(Multiplex RCR)技術(shù)結(jié)合。Schuelke[12]又用M13序列作為尾巴引物，對(duì)該技術(shù)體系進(jìn)行完善，最終實(shí)現(xiàn)SSR技術(shù)與熒光自動(dòng)測序技術(shù)的結(jié)合，形成了一套低成本的基于熒光測序技術(shù)的SSR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測體系，即TP-M13-SSR技術(shù)。此技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用到蘋果、楊樹、桂花等樹種遺傳多樣性分析、品種指紋圖譜構(gòu)建等[13-16]研究中。

本研究采用TP-M13-SSR毛細(xì)管電泳自動(dòng)檢測法對(duì)29份枸杞種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在從DNA水平上揭示枸杞種質(zhì)資源的親緣關(guān)系及遺傳背景，以期為枸杞種質(zhì)資源的開發(fā)與利用、品種選育及雜交育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

29份枸杞種質(zhì)資源分別來自寧夏、新疆、河北、四川、青海和云南6個(gè)省(自治區(qū))的地方品種、栽培品種和野生種(表1)。均保存于國家枸杞工程技術(shù)研究中心枸杞種質(zhì)資源圃(38°38′49″N，106°9′10″E)。

表1 29份枸杞種質(zhì)資源名稱及來源Table 1 29 wolfberry germplasm and its sources

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 參照Porebski等[17]方法提取枸杞基因組DNA，用80 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白檢測儀檢測DNA質(zhì)量和質(zhì)量濃度，并用ddH2O將母液質(zhì)量濃度稀釋至50 ng·μL-1，-20 ℃保存，備用。

1.2.2 引物合成 在TP-M13自動(dòng)熒光檢測系統(tǒng)中，用3條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。第1條引物是把普通的SSR引物的正向引物分別和M13的反向引物相連合成帶有M13尾巴的引物，即TP-M13引物，第2條引物為正常的SSR反向引物，第3條引物是5′端帶有熒光標(biāo)記的M13正向引物。選用124對(duì)普通SSR引物是從枸杞全基因組測序結(jié)果(未公布)中開發(fā)的，由國家枸杞工程技術(shù)研究中心李彥龍先生提供，TP-M13-SSR引物和5′端帶有熒光標(biāo)記的M13正向引物(表2)均由美國ABI公司合成。

表2 5′端帶有熒光標(biāo)記的M13正向引物序列Table 2 M13 forward primer and sequence with fluorescent-labelled at 5′ end

1.2.3 PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物檢測 采用TP-M13-SSR毛細(xì)管電泳熒光檢測法進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測。PCR擴(kuò)增體系為15 μL：其中含10×PCR buffer(含Mg2+)1.5 μL、50 ng模板DNA、0.2 mmol·L-1dNTPs、0.7 μmol·L-1引物、0.27 μmol·L-1M13引物和0.75 U Hot startTaqDNA Polymerase。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃變性30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，53 ℃變性30 s，72 ℃延伸30 s，10個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 延伸5 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物的自動(dòng)熒光檢測，在96孔板中每孔加入分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液(0.5∶8.5)9 μL，PCR產(chǎn)物1.0 μL，95 ℃變性3 min，用ABI3730進(jìn)行自動(dòng)熒光檢測。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用GeneMapper 5.0軟件[18]對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得不同樣品擴(kuò)增片段長度。利用Popgen32[19]軟件計(jì)算等位基因數(shù)(Number of alleles，NA)、有效等位基因數(shù)(Effective number of alleles，NE)、觀測雜合度(Observed heterozygosity，HO)、期望雜合度(Expected heterozygosity，HE)、Shannon’s信息指數(shù)(Shannon’s information index，I)。利用PowerMarker V 3.25[20]軟件計(jì)算主等位基因頻率(Major allele frequency，MAF)和位點(diǎn)多態(tài)信息含量(Polymorphism information content，PIC)。同時(shí)使用NTSYSpc-2.10軟件[21]計(jì)算遺傳相似系數(shù)，即Gsij=a/(a+b+c)，Gsij是用來衡量2個(gè)個(gè)體i和j的遺傳相似系數(shù)，a為2個(gè)體共有條帶數(shù)，b和c為個(gè)體i和個(gè)體j各自特有的多態(tài)性條帶數(shù)，根據(jù)遺傳相似性系數(shù)進(jìn)行UPGMA聚類分析(unweighted pair group method analysis)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TP-M13-SSR引物篩選及條件優(yōu)化

應(yīng)用合成的124對(duì)TP-M13-SSR引物對(duì)遺傳背景和表型性狀差異較大的4份種質(zhì)進(jìn)行篩選，初步篩選出穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、PCR條件相對(duì)穩(wěn)定的13對(duì)引物(引物名稱及序列見表3)。其PCR條件優(yōu)化后，用于29份枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性研究。

表3 SSR引物信息Table 3 SSR primers used in this study

2.2 SSR位點(diǎn)多態(tài)性分析

利用篩選出的13對(duì)引物對(duì)29份枸杞種質(zhì)材料進(jìn)行擴(kuò)增，準(zhǔn)確獲得不同材料在不同位點(diǎn)的等位基因片段大小(圖1)，共檢測到78個(gè)等位基因(表4)，變幅為2～11個(gè)，平均為6個(gè)；有效等位基因數(shù)(NE)變幅為1.035～5.861，平均為2.684；主等位基因頻率變幅為0.276～0.983，平均為0.625；觀測雜合度(HO)變幅為0.034～0.862，平均為0.401；期望雜合度(HE)變幅為0.034～0.831，平均為0.514；Shannon’s信息指數(shù)(I)變幅為0.087～1.992，平均為1.103；多態(tài)信息含量(PIC)值變幅為0.033～0.811，平均為0.487；表明29份枸杞種質(zhì)資源間存在豐富的遺傳多樣性。

擴(kuò)增片段/bp Size of bands amplified

引物名稱PrimernameNANEMAFHOHEIPICSF194.3580.3280.6900.7791.7050.749SF641.6600.7590.3790.3980.7640.367SF1342.4340.5690.2760.5901.0600.531SF2621.3990.8280.3450.2850.4600.245SF30114.0430.4310.5860.7531.7750.728SF3221.0350.9830.0340.0340.0870.033SF3441.2830.8790.1030.2210.4840.211SF6162.8270.5520.3450.6461.3650.615SF63105.8610.2760.8620.8311.9920.811SF6891.7800.7410.2760.4381.0570.425SF7341.4270.8280.2760.2990.6000.277SF9273.4680.4660.3100.7121.5360.678SF10763.3180.4830.7240.6991.4520.665平均值Mean62.6840.6250.4010.5141.1030.487

2.3 聚類分析

應(yīng)用NTSYS-pc軟件計(jì)算13對(duì)引物對(duì)29份種質(zhì)遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA方法構(gòu)建聚類圖(圖2)。從圖2可知，在遺傳相似系數(shù)為0.78時(shí)，可將供試材料分為5個(gè)類群。第Ⅰ大類包括21份種質(zhì)，第Ⅱ大類包括4份種質(zhì)，第Ⅲ大類包括2份種質(zhì)，第Ⅳ大類和第Ⅴ大類僅包括1份種質(zhì)。

第Ⅰ大類在遺傳相似系數(shù)為0.80處分為2個(gè)亞類群Ⅰ-1和Ⅰ-2，Ⅰ-1亞類在遺傳相似系數(shù)為0.84處又分為2個(gè)亞亞類群Ⅰ-11和Ⅰ-12，Ⅰ-11亞亞類群包括大麻葉、小麻葉、‘寧杞1號(hào)’和‘寧杞2號(hào)’4份種質(zhì)，其中‘寧杞1號(hào)’和‘寧杞2號(hào)’都是通過群體選優(yōu)從大麻葉群體選育的，Ⅰ-12亞亞類群包括8個(gè)枸杞品種和7份野生種質(zhì)，栽培品種與野生種質(zhì)混合聚類在一起，表明栽培品種與野生種質(zhì)有基因交流現(xiàn)象。

第Ⅱ大類在遺傳相似系數(shù)為0.80處分為2個(gè)亞類群Ⅱ-1和Ⅱ-2，Ⅱ-1包括北方枸杞、HB-09和W-31共3份種質(zhì)，其中北方枸杞和HB-09的地理來源相同。

第Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ大類在遺傳相似系數(shù)為0.80處各包括1個(gè)亞類群，其中第Ⅲ類群包括2份從云南引進(jìn)野生種質(zhì)云南枸杞和AN-02，第Ⅳ類群僅有黑果枸杞1份種質(zhì)，第Ⅴ類群僅包括CJ-09 1份種質(zhì)。

圖2 29份枸杞種質(zhì)資源的UPGMA聚類圖Fig.2 Dendrogram of cluster of 29 wolfberry germplasm analysis by UPGMA

3 討 論

3.1 TP-M13-SSR自動(dòng)熒光檢測技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

與基于普通SSR標(biāo)記的種質(zhì)資源遺傳多樣性方法相比，基于SSR熒光標(biāo)記的種質(zhì)資源遺傳多樣性研究結(jié)果更準(zhǔn)確、效率更高，能區(qū)分大小相差1個(gè)堿基的片段。郝晨陽等[22]應(yīng)用SSR熒光標(biāo)記分析技術(shù)和常規(guī)的SSR銀染技術(shù)對(duì)小麥451份材料進(jìn)行遺傳多樣分析，結(jié)果表明SSR熒光技術(shù)比常規(guī)銀染法在每個(gè)位點(diǎn)上多檢測到3個(gè)等位基因，檢測效率更高。程本義等[23]建立水稻SSR熒光標(biāo)記體系，結(jié)合常規(guī)SSR技術(shù)進(jìn)行水稻品種DNA指紋鑒定，結(jié)果表明，SSR熒光檢測法可以準(zhǔn)確讀出擴(kuò)增片段大小，檢測效率明顯高于普通SSR檢測方法。但熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測所需的DNA測序儀及配套試劑價(jià)格昂貴，一般實(shí)驗(yàn)室可能難以承受。

3.2 TP-M13-SSR在枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中的應(yīng)用

TP-M13自動(dòng)熒光檢測系統(tǒng)具有精確、靈敏、高效等優(yōu)點(diǎn)。自該技術(shù)問世以來，廣泛用于植物種質(zhì)資源遺傳多樣性及品種鑒定等方面的研究[15-16]。本研究中，利用篩選出的13對(duì)SSR熒光引物對(duì)29份枸杞種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性研究，聚類結(jié)果表明，供試材料親緣關(guān)系較近，遺傳基礎(chǔ)狹窄，這符合材料遺傳背景與地理來源的實(shí)際情況[24]，且部分種質(zhì)聚類結(jié)果與AFLP標(biāo)記聚類結(jié)果[25]相一致，但與基于表型性狀的聚類結(jié)果[4]和常規(guī)SSR標(biāo)記的聚類結(jié)果[10]并不完全一致，其原因可能是表型性狀檢測水平和常規(guī)SSR的檢測效率較低，說明TP-M13-SSR技術(shù)在枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中應(yīng)用效果較好。

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LI Y L,FAN Y F,DAI G L,etal.Analysis of genetic diversity for wolfberry germplasms by AFLP technology [J].ChineseTraditionalandHerbalDrugs,2011,42(4):770-773(in Chinese with English abstract) .

(責(zé)任編輯：潘學(xué)燕 Responsible editor:PAN Xueyan)

TP-M3-SSR Technique and Its Application in Analysis of Genetic Diversity of Wolfberry Germplasm Resources

FAN Yunfang,YIN Yue, AN Wei, ZHAO Jianhua, LI Yanlong, WANG Yajun and CAO Youlong

(Ningxia Academy of Agricultural and Forestry Sciences, National Wolfberry Engineering Research Center, Yinchuan 750002,China)

An economical detection method for simple sequence repeat with tailed primer M13(TP-M13-SSR) was used in genetic diversity analysis for 29 wolfberry germplasm. Thirteen pairs of SSR primers screened amplified 78 alleles with an average of six alleles per locus. The average ofMAF,NE,HO,HE,IandPICwas 0.625, 2.684, 0.401, 0.514, 1.103 and 0.487, respectively. The similarity coefficients among 29 wolfberry germplasm ranged from 0.66 to 0.97, with average of 0.81. 29 wolfberry germplasm could be divide into five groups and seven subgroups. The results showed there was a low level of genetic diversity among 29 wolfberry germplasm.The method had the advantages of economy, sensitiveness and high efficiency,and it had been used in genetic diversity analysis of wolfberry successfully.

Wolfberry; TP-M13-SSR；Genetic diversity

2016-03-28 Returned 2016-05-10

Ningxia Special Program of New Variety Breeding in Speical and Advantagous Industy in Agriculture(No.2013NYYZ0101); the National Natural Science Foundation of China(No. 31060104,31260351);the Natural Science Foundation of Ningxia(No.NZ15123);the Program of Technology Innovation of Ningxia Academy of Agricultural and Forestry Sciences(No. NKYJ-14-31,NKYZ-16-0405).

FAN Yunfang,female,associate researcher.Research area:molecular biology research of wolfberry.E-mail:majoriefyf@163.com

CAO Youlong,male,researcher,master supervisor.Research area:biotechnology breeding of wolfberry.E-mail:youlongchk@163.com

日期：2017-06-05

2016-03-28

2016-05-10

寧夏農(nóng)業(yè)特色優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)新品種選育專項(xiàng)(2013NYYZ0101)；國家自然科學(xué)基金(31060104, 31260351)；寧夏自然科學(xué)基金(NZ15123)；寧夏農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新先導(dǎo)資金(NKYJ-14-31, NKYZ-16-0405)。

樊云芳，女，副研究員，主要從事枸杞分子生物學(xué)研究。E-mail：majoriefyf@163.com

曹有龍，男，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事枸杞生物技術(shù)育種研究。E-mail:youlongchk@163.com

S567.1+9

A

1004-1389(2017)06-0890-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170605.1728.024.html