張海波, 劉 冰, 楊娟妮, 張 田, 張 英

(1.陜西省種子管理站，西安 710018；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，西安 710018)

利用實時熒光PCR快速篩查玉米中轉(zhuǎn)基因成分

張海波1,2, 劉 冰1,2, 楊娟妮1,2, 張 田1,2, 張 英1,2

(1.陜西省種子管理站，西安 710018；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，西安 710018)

玉米是擁有轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體數(shù)量最多的作物，多樣的轉(zhuǎn)化體增加了玉米中轉(zhuǎn)基因成分篩查的難度。為了建立玉米中轉(zhuǎn)基因成分的快速篩查方法，利用Taqman探針實時熒光PCR方法，通過對玉米樣品中CaMV35S啟動子(P-35S)和NOS終止子(T-NOS)2個元件組合的檢測，完成對現(xiàn)有玉米轉(zhuǎn)化體的篩查。建立的Taqman探針實時熒光PCR方法靈敏度可達到0.1%，檢測時間較普通PCR方法縮短1 h以上。同時提出了轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體鑒定路線圖。該篩查方法可對玉米中的轉(zhuǎn)基因成分進行快速、高靈敏度的篩查。

轉(zhuǎn)基因玉米；Taqman探針實時熒光PCR；快速篩查；CaMV35S啟動子

隨著轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品越來越受到消費者關(guān)注，快速、準確的轉(zhuǎn)基因成分篩查方法，將成為維護消費者權(quán)益的重要技術(shù)支撐。以PCR 技術(shù)為基礎的方法是轉(zhuǎn)基因成分檢測中最為快速和準確的方法[1]。常規(guī)PCR檢測由核酸提取、PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳3個步驟組成。Taqman探針實時熒光PCR技術(shù)近年來越來越多的應用于轉(zhuǎn)基因成分檢測中，它是在常規(guī)PCR基礎上，添加一條標記2個熒光基團的探針(Taqman探針)，能在PCR擴增過程中，通過記錄熒光信號強度的變化，對擴增產(chǎn)物的積累進行實時監(jiān)控，從而能在擴增結(jié)束時對結(jié)果進行判斷[2]。以Taqman探針實時熒光PCR 技術(shù)為基礎的轉(zhuǎn)基因成分檢測可將檢測步驟縮短為兩步，即核酸提取和PCR擴增，可提高檢測效率，節(jié)約時間成本[3]。另外，瓊脂糖凝膠電泳中使用的染色劑溴化乙錠(EB)為強烈致癌物質(zhì)，若操作不當，會危害試驗人員的健康。而Taqman探針實時熒光PCR檢測則采用完全閉管檢測，無需PCR后處理，避免交叉污染和假陽性的風險。

玉米是具有轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體數(shù)量最多的作物，包括29個轉(zhuǎn)化體和26個疊加品系，其中疊加品系是由2個或2個以上的轉(zhuǎn)化體雜交而成，如TC1507×NK603，Bt11×MIR604×GA21[4-5]。疊加品系的檢測可通過對形成疊加品系的轉(zhuǎn)化體的檢測來完成，本試驗主要以29個玉米轉(zhuǎn)化體為研究對象，根據(jù)張海波等[6]2015年的研究結(jié)果，進行P-35S和T-NOS的檢測，可以覆蓋27個玉米轉(zhuǎn)化體。新增的抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體4114含有P-35S，耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體5307含有T-NOS[4]。因此，根據(jù)玉米轉(zhuǎn)基因成分篩查原則，同時進行P-35S和T-NOS檢測，可以覆蓋所有的29個玉米轉(zhuǎn)化體。

根據(jù)農(nóng)業(yè)部報告，中國將遵循非食用、間接食用、食用的步驟推進轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化，即首先發(fā)展非食用的經(jīng)濟作物，其次是飼料作物、加工原料作物，再次是一般食用作物，最后才是主糧作物[7]。中國批準種植的轉(zhuǎn)基因作物只有棉花和木瓜，沒有批準任何轉(zhuǎn)基因主糧的商業(yè)化生產(chǎn)[8]。而獲準作為加工原料進口到中國的轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化事件也只有15個(截至2016年1月有效)，分別為3個耐除草劑玉米GA21、NK603、T25，9個抗蟲玉米MON89034、MON810、MIR604、Bt11、TC1507、59122、Bt176、MIR162，2個抗蟲耐除草劑玉米MON88017 、Bt11×GA21，1個耐旱玉米MON87460和1個品種改良玉米Event 3272[4,9]。因此，轉(zhuǎn)基因作物監(jiān)控的重點，在于未批準作物的非法種植和使用，即在大量的非轉(zhuǎn)基因作物和產(chǎn)品中篩查出非法種植和使用的轉(zhuǎn)基因作物和產(chǎn)品。這就需要快速準確的轉(zhuǎn)基因成分篩查方法。篩查出含有轉(zhuǎn)基因成分的樣品要進行具體轉(zhuǎn)化體的鑒定。

本研究利用Taqman探針實時熒光PCR技術(shù)，通過對P-35S和T-NOS檢測，建立轉(zhuǎn)基因玉米的快速篩查方法，測定檢測方法的靈敏度，同時提出轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體鑒定路線圖。該方法可實現(xiàn)對玉米中轉(zhuǎn)基因成分的快速準確篩查和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材 料

非轉(zhuǎn)基因玉米種子‘鄭單958’由農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(西安)收藏，轉(zhuǎn)基因玉米標準物質(zhì)粉末MON863、Bt176、Bt11、NK603、MON810、GA21、MIR604、Event 3272、Event 98140、59122和TC1507由歐洲標準局(Institute for Reference Materials and Measurements, IRMM)制作，并購買于上海安譜實驗科技股份有限公司。

Taqman探針實時熒光PCR擴增試劑[Premix ExTaqTM(Probe qPCR)，RR390A]購自寶生物工程(大連)有限公司。擴增引物和Taqman探針由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2 序列比對

用Alignment序列比對軟件(Vector.NTI.Advance.v10.3-RECOiL)比對不同轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體P-35S和T-NOS的DNA序列，并與Taqman探針實時熒光PCR的引物探針序列比對。

1.3 基因組DNA提取

樣品基因組DNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的新型植物基因組DNA提取試劑盒(DP320)。DNA的純度和質(zhì)量濃度使用紫外分光光度計ND2000[賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific)]測定，260 nm與280 nm吸光度比值為1.8～2.0，DNA質(zhì)量濃度為50～100 mg/L。DNA樣品的完整性使用 8 g/L 瓊脂糖凝膠電泳和EB染色檢測。玉米內(nèi)標準基因(zSSⅡb)擴增測定DNA樣品中是否存在擴增抑制物質(zhì)。

1.4 Taqman探針實時熒光PCR

Taqman探針實時熒光PCR擴增條件及擴增程序依據(jù)農(nóng)業(yè)部1782號公告-3-2012[10]中相應標準執(zhí)行，其中PCR擴增循環(huán)數(shù)增加至50個循環(huán)。Taqman探針實時熒光PCR擴增使用ABI StepOne Plus實時熒光PCR儀(美國Applied Biosystems)進行，并使用儀器自帶軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Taqman探針實時熒光PCR篩查引物和探針序列與轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體序列比對

在使用基因槍或根癌農(nóng)桿菌將外源基因轉(zhuǎn)入受體植物的過程中，經(jīng)常會發(fā)生基因重排或片段丟失的現(xiàn)象，加之研發(fā)人員根據(jù)宿主植物密碼子的偏好對基因片段進行修飾，使得名稱相同的基因元件在不同的轉(zhuǎn)化體中可能具有不同的核苷酸序列[11]。因此，在選擇檢驗方法時，必須對需要檢測的轉(zhuǎn)化體目標序列和檢測方法中的引物探針序列進行比對分析，以保證選擇的方法能夠檢測出最多的目標轉(zhuǎn)化體[12]。本研究從歐洲轉(zhuǎn)基因生物指南轉(zhuǎn)基因數(shù)據(jù)庫[5]、轉(zhuǎn)基因檢測方法數(shù)據(jù)庫[9]和文獻報道中[13]收集到的序列進行對比，確定合適的篩選引物探針進行檢測。經(jīng)過序列比對，選擇農(nóng)業(yè)部1782號公告-3-2012中的P-35S和T-NOS的引物探針，具體序列信息見表1。圖1和圖2顯示P-35S、T-NOS序列與引物探針序列的比對結(jié)果。

表1 篩查檢測中所用的引物和探針Table 1 Primers and probes used in the screening method

2.2 P-35S、T-NOS序列比對分析

圖1顯示MON89034、MON88017、Event 98140、MON810、MON863、TC1507、NK603、59122、Bt11、T25 10個玉米轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化事件的P-35S序列比對結(jié)果和引物探針位置。圖中淺灰色覆蓋的序列表示在不同轉(zhuǎn)化事件中該序列位點有差異，轉(zhuǎn)基因玉米的P-35S序列有部分差異，其中3個差異位點落在引物探針的區(qū)域(圖1)。在正向引物35S-F的序列比對中，TC1507的P-35S有一個差異位點為T，其他玉米轉(zhuǎn)化事件和正向引物，對應的位置都為G。在反向引物35S-R的序列比對中，NK603的P-35S有一個缺失位點，而其他玉米轉(zhuǎn)化事件和反向引物，對應的位置都為T。在探針35S-P的序列比對中，Bt11的P-35S有一個差異位點為A，而其他玉米轉(zhuǎn)化事件和探針序列，對應的位置都為G。

圖2顯示MON89034、MON88017、Event 3272、MIR604、CBH351、Bt11 6個玉米轉(zhuǎn)化事件的T-NOS序列比對結(jié)果和引物探針位置。轉(zhuǎn)基因玉米T-NOS的序列是完全一致，并與引物和探針完全配對。

對轉(zhuǎn)基因玉米P-35S序列中的差異進行分析發(fā)現(xiàn)，TC1507和NK603引物35S-F/R上的差異位點均處于引物的5′端。引物5′端序列的錯配一般并不影響PCR擴增反應的正常進行，因此TC1507和NK603引物35S-F/R上的差異位點可以忽略。探針序列上的錯配對PCR擴增反應的影響，與探針上使用的熒光基團組合有關(guān)，例如TaqMan-MGB探針對錯配非常敏感，一般用于SNP分析。常用的以FAM為報告基團、TAMRA為淬滅基團的熒光組合，對少量錯配并不敏感。因此，本研究中使用的探針在合成時，選擇使用FAM/TAMRA標記，以減小Bt11探針上的錯配對PCR擴增反應的影響。同時，在篩查檢測中，TC1507、NK603和Bt11的檢測結(jié)果將被列為關(guān)注的重點，以驗證選擇的實時熒光檢測方法適合玉米轉(zhuǎn)基因成分的快速篩查。

方框表示引物和探針序列、箭頭表示引物方向；淺灰色覆蓋的序列表示在不同轉(zhuǎn)化事件中該序列位點有差異 Box means the sequences of primers/probe and arrow means the direction of primers；light grey background means different sequences among different GM maize events.

圖1 P-35S序列比對和引物探針位置
Fig.1 Sequences alignment of P-35S and the primers/probe location

2.3 Taqman探針實時熒光PCR方法對轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體的篩查檢測

為了驗證選擇的P-35S和T-NOS實時熒光篩選方法是否適合對玉米中的轉(zhuǎn)基因成分進行篩查，利用表1中的引物對實驗室已有的轉(zhuǎn)基因玉米MON863、Bt176、Bt11、NK603、MON810、GA21、MIR604、Event 3272、Event 98140、59122、TC1507和非轉(zhuǎn)基因玉米‘鄭單958’進行試驗驗證。

Taqman探針實時熒光PCR檢測結(jié)果如圖3所示。圖中藍色曲線為P-35S篩查檢測結(jié)果，紅色曲線為T-NOS篩查檢測結(jié)果。曲線有上揚的為檢測結(jié)果陽性，曲線無上揚的為檢測結(jié)果陰性。在P-35S和T-NOS的實時熒光篩選檢測結(jié)果中，P-35S和T-NOS都為陽性的玉米轉(zhuǎn)化事件有MON863、Bt11、NK603；P-35S陽性、T-NOS陰性的玉米轉(zhuǎn)化事件有Bt176、MON810、Event 98140、59122、TC1507；P-35S陰性、T-NOS陽性的玉米轉(zhuǎn)化事件有GA21、MIR604、Event 3272；P-35S和T-NOS都為陰性的是非轉(zhuǎn)基因玉米‘鄭單958’。與預期結(jié)果一致。

從圖3可看出，對于有序列錯配的轉(zhuǎn)化事件Bt11、NK603和TC1507，其P-35S的檢測結(jié)果并未受到錯配的影響，與預期結(jié)果一致。

2.4 轉(zhuǎn)基因玉米Taqman探針實時熒光PCR方法靈敏度檢測

使用來源于IRMM的不同轉(zhuǎn)基因含量的Bt11粉末，對所選用的實時熒光篩查方法進行靈敏度測試。轉(zhuǎn)基因含量分別為5%、2%、1%、0.5%和0.1%的Bt11粉末(IRMM編號分別為ERM-BF412F、ERM-BF412E、 ERM-BF411D、ERM-BF412C、ERM-BF412B)分別進行P-35S和T-NOS的實時熒光PCR擴增，每個樣品的每個檢測參數(shù)重復3次，結(jié)果如圖4所示。P-35S和T-NOS的檢測中，5個梯度的Bt11粉末的3個重復都可以檢測到，說明本研究所選用方法的靈敏度可達到0.1%。

方框表示引物和探針序列、箭頭表示引物方向 Box means the sequences of primers/probe and arrow means the direction of primers

圖2 T-NOS序列比對和引物探針位置
Fig.2 Sequences Alignment of T-NOS and the Primers/probe Location

2.5 轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體鑒定路線圖

在對玉米樣品進行轉(zhuǎn)基因檢測時，首先聯(lián)合使用P-35S和T-NOS進行篩查，確認其是否含有轉(zhuǎn)基因成分，如果檢出轉(zhuǎn)基因成分，則需要進行進一步的轉(zhuǎn)化體確認。按照圖5所示的篩查路線圖，可以利用其他常用的篩查元件，逐步縮小范圍，最終通過轉(zhuǎn)化體特異性引物進行確認。

如圖5所示，如果P-35S和T-NOS的檢測結(jié)果都為陰性，則認為樣品中未檢出轉(zhuǎn)基因成分。如果P-35S和T-NOS篩查結(jié)果都為陽性時，可繼續(xù)使用 CP4-EPSPS基因篩查，若為陽性，則進行 PINⅡ基因篩查；若為陰性，則進行Bar基因篩查，逐步縮小范圍，直至確定到轉(zhuǎn)化體。如果P-35S檢測結(jié)果為陽性，而T-NOS檢測結(jié)果為陰性，可繼續(xù)使用 PINⅡ篩查，再進行Bar基因篩查。如果P-35S檢測結(jié)果為陰性，而T-NOS檢測結(jié)果為陽性，可繼續(xù)使用CP4-EPSPS基因篩查，若為陽性，則進行GA21轉(zhuǎn)化體檢測確認；若為陰性，則進行MIR604、Event 3272或MIR162轉(zhuǎn)化體檢測確認。

與直接利用轉(zhuǎn)化體特異性引物逐一確認的方法相比，該路線圖能極大的減少檢測工作量，更加高效地完成轉(zhuǎn)化體確認。

藍色、紅色線分別為P-35S、T-NOS擴增曲線 Blue and red line means the amplification plot of P-35S and T-NOS, respectively

圖3 Taqman探針實時熒光PCR檢測轉(zhuǎn)基因玉米中的P-35S和T-NOS
Fig.3 Taqman Real-time PCR detection of P-35S and T-NOS in GM maize

圖4 P-35S和T-NOS Taqman探針實時熒光PCR檢測方法靈敏度擴增曲線Fig.4 Sensitivity amplification plot of P-35S and T-NOS Taqman Real-time PCR

3 討 論

隨著轉(zhuǎn)基因作物在全球范圍內(nèi)種植面積的日益擴大，人們對轉(zhuǎn)基因生物的食用安全、飼用安全和環(huán)境安全的關(guān)注及擔憂日益增加。中國對農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管十分嚴格，《種子法》、《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》等法律法規(guī)，對農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因安全評價、產(chǎn)品標識、生產(chǎn)許可、加工許可、經(jīng)營許可、進口審批都有十分嚴格、細致的規(guī)定。中國目前尚未批準轉(zhuǎn)基因玉米的商業(yè)化種植，僅允許15個轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化事件作為加工原料進口。因此，轉(zhuǎn)基因玉米的安全監(jiān)管主要集中嚴防進口轉(zhuǎn)基因玉米的非法流通和轉(zhuǎn)基因玉米的非法繁育。

農(nóng)業(yè)主管部門對轉(zhuǎn)基因玉米的安全監(jiān)管是以快速、準確、靈敏的檢測技術(shù)為支撐，加大執(zhí)法力度和速度，及時防止非法轉(zhuǎn)基因玉米擴散對中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及食品加工行業(yè)造成危害。因此，加強玉米中轉(zhuǎn)基因成分檢測，不僅是保障我國農(nóng)業(yè)和食品安全、維護法律尊嚴的要求，對于確保我國農(nóng)作轉(zhuǎn)基因生物安全和有序推廣具有十分重要的意義。

本研究利用Taqman探針實時熒光PCR方法，通過聯(lián)合對P-35S和T-NOS的檢測，完成玉米中轉(zhuǎn)基因成分的篩查。該方法快速、準確，靈敏度可以達到0.1%，這與Wu等[13]、吳明生等[14]的檢測靈敏度近似，為玉米中轉(zhuǎn)基因成分的快速篩查提供依據(jù)。

隨著轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)在農(nóng)作物中應用的不斷深入，同時，作物種類和基因種類的不斷增加，轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)也需要根據(jù)監(jiān)管對象的發(fā)展不斷升級與改進，更好地適應轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展，并為轉(zhuǎn)基因作物的監(jiān)管提供有力的技術(shù)支撐。

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(責任編輯：成 敏 Responsible editor:CHENG Min)

Rapid Screening of Genetically Modified Maize Based on Taqman Real-time Fluorescence PCR Method

ZHANG Haibo1,2, LIU Bing1,2,YANG Juanni1,2, ZHANG Tian1,2and ZHANG Ying1,2

(1.Shaanxi Seed Administration Bureau, Xi’an 710018, China; 2.The Crop Seed Quality Testing Center in Xi’an, Ministry of Agriculture, Xi’an 710018, China)

Maize is the crop of having the largest amount of genetically modified (GM) events. Varied GM events make it difficult to screen GM ingredients in maize. In order to establish a rapid screening method for GM maize, the combination of CaMV35S promoter (P-35S) and NOS terminator (T-NOS) was used to screen all the commercial GM maize events based on Taqman real-time fluorescence PCR. The sensitivity of the method was of 0.1%.The time cost in Taqman real-time fluorescence PCR was one hour less than conventional PCR.In addition, the identification pathway of genetically modified maize event was presented in this article. In conclusion, this Taqman real-time fluorescence PCR method can be used for rapid and sensitive screening of GM maize events.

Genetically modified maize; Taqman Real-time PCR Method; Rapid Screening; CaMV35S Promoter

2016-07-12 Returned 2016-10-04

ZHANG Haibo, male,master,agronomist.Research area:GMO detection methods research. E-mail: 46974104@qq.com

ZHANG Ying,male,senior agronomist.Research area: GMO detection methods research. E-mail: zhying6@gmail.com

日期：2017-06-05

2016-07-12

2016-10-04 第一作者：張海波，男，碩士，農(nóng)藝師，從事農(nóng)作物種子質(zhì)量管理和分子檢驗工作。E-mail：46974104@qq.com 通信作者：張 英，男，高級農(nóng)藝師，從事農(nóng)作物種子質(zhì)量管理和分子檢驗工作。E-mail：zhying6@gmail.com

S513;Q946.2

A

1004-1389(2017)06-0840-09

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