趙楠，阮俊青，包怡紅

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

松仁粕中清蛋白的提取工藝及功能性質(zhì)研究

趙楠，阮俊青，包怡紅*

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

以脫脂松仁粕為材料，清蛋白提取率為考察指標(biāo)，蒸餾水為提取劑，設(shè)料(質(zhì)量，g)液(體積，mL)比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)、提取溫度(35、40、45、50、55 ℃)和提取時(shí)間(30、60、90、120、150 min)3個(gè)單因素試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化清蛋白的提取工藝，并對(duì)清蛋白的功能性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明：松仁粕中清蛋白的最佳提取工藝為料液比 1∶25、提取時(shí)間 92 min、提取溫度 53 ℃，松仁粕中清蛋白的提取率可達(dá) 23.52%；松仁粕清蛋白的溶解度在 pH值為3時(shí)最小，在堿性條件下具有較好的溶解性、起泡性與乳化性。

松仁粕；清蛋白；響應(yīng)面法優(yōu)化；提取工藝；功能性質(zhì)

紅松(Pinus konaiensis Sieb. et Zucc.)為松科松屬植物，是常綠針葉喬木，主要分布于黑龍江省小興安嶺和吉林省長(zhǎng)白山一帶[1-2]。紅松的種子略扁，呈圓錐形狀。松仁營(yíng)養(yǎng)豐富，含有蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、微量元素等多種人類(lèi)所需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3-5]，有“長(zhǎng)壽果”之稱。松仁粕是松仁油生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)物，不僅產(chǎn)量高，還含有豐富的蛋白質(zhì)、膳食纖維及微量元素等，有較大的再利用價(jià)值。筆者以松仁粕為原料，探索其清蛋白的提取工藝參數(shù)和功能性質(zhì)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

供試松仁粕購(gòu)自七臺(tái)河市宏泰松果有限公司；硫酸銅、濃硫酸、溴甲酚綠、硫酸鉀、甲基紅等均為分析純；考馬斯亮藍(lán) G-250、牛血清蛋白購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；恒溫水浴振蕩器，上海百典儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；FA25高剪切分散乳化機(jī)，山海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司產(chǎn)品；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 脫脂松粕的制備

取松仁粕，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)孔徑為0.425 mm篩，以石油醚為溶劑，按料(質(zhì)量，g)液(體積，mL)比1∶10進(jìn)行脫脂，干燥，得松仁粕粉，備用。

1.2.2 松仁粕清蛋白的提取工藝流程

松仁粕→過(guò)篩→脫脂→恒溫振蕩提取→離心→過(guò)濾→二次浸提沉淀→離心→過(guò)濾→合并松仁粕清蛋白提取液→調(diào)至等電點(diǎn)→干燥。

1.2.3 清蛋白提取率的測(cè)定

參照GB/T 5009.5—2010的方法測(cè)定松仁粕中的總蛋白含量；采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定提取液中松仁粕清蛋白含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：精確吸取0.1 mg/mL牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，分別加入 1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.0 mL蒸餾水，搖勻，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)顯色劑，室溫下反應(yīng)，穩(wěn)定 5 min 后，在 595 nm下測(cè)定其吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程 y=7.113 3x+0.142 3，R2=0.999 2。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以蒸餾水為提取劑(pH=6.2)，參照1.3.2中工藝提取松仁粕清蛋白，選擇料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，提取溫度 35、40、45、50、55 ℃和提取時(shí)間30、60、90、120、150 min進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)(表1)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平Table 1 Experimental design of response surface methodology

1.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

以松仁粕粉末為材料，按照最佳提取工藝進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定松仁粕中清蛋白的提取率。

1.2.7 松仁粕清蛋白功能性質(zhì)的測(cè)定

1) 松仁粕中清蛋白溶解性的測(cè)定。根據(jù)CHATTERJEE等[6]的方法略有修改。將清蛋白配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，分別調(diào)至不同 pH測(cè)定松仁粕清蛋白的溶解性。

2) 松仁粕清蛋白起泡性的測(cè)定。根據(jù)JAMDAR等[7]的方法略作修改。將清蛋白配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的溶液，在不同 pH 下測(cè)定松仁粕清蛋白的起泡性及起泡穩(wěn)定性。

3) 松仁粕清蛋白乳化性的測(cè)定。根據(jù)AMZA等[8]的方法測(cè)定。將清蛋白配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5% 的溶液，在不同 pH 下測(cè)定松仁粕清蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6、SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)料液比分別為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 時(shí)，清蛋白的提取率相應(yīng)為(7.84±0.3)%、(13.11±0.3)% 、 (14.82±0.4)% 、 (18.35±0.2)% 、(16.64±0.5)%，可見(jiàn)隨著溶劑的增加，提取率呈先升高后降低趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1∶25時(shí)，提取率最高，為 18.35%。當(dāng)提取時(shí)間分別為 30、60、90、120、150 min 時(shí)，清蛋白提取率分別為(13.46±0.2)% 、 (15.14±0.2)% 、 (18.55±0.24)% 、(18.36±0.26)%、(16.6±0.32)%，隨著時(shí)間的增加，清蛋白的提取率呈先升高后降低趨勢(shì)。提取時(shí)間為90 min，清蛋白的提取率達(dá)到最大，為18.55%。當(dāng)提取溫度分別為 35、40、45、50、55 ℃時(shí)，清蛋白的提取率相應(yīng)為(7.05±0.13)%、(10.41±0.46)%、(18.68±0.23)%、(20.77±0.5)%、(20.6±0.34)%，清蛋白的提取率呈先升高后降低趨勢(shì)，溫度為50℃時(shí)清蛋白的提取率達(dá)到最大，為20.77 %。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表 2 的結(jié)果，利用 Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，可得到松仁粕中清蛋白提取率(Y)和各個(gè)因子料液比(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)之間的回歸方程模型為：

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

為驗(yàn)證方程的有效性，對(duì)此回歸模型進(jìn)行方差分析(表3)。由表 3 可知：P＜0.000 1，此模型為極顯著(P＜0.01)；失擬項(xiàng) P=0.502 9，不顯著(P＞0.05)；R2=0.969 7，表明回歸方程的實(shí)際值與預(yù)期值吻合度好，可以較好地描述各變量與響應(yīng)值的關(guān)系。較低的離散系數(shù)(CV=5.13)進(jìn)一步說(shuō)明整個(gè)試驗(yàn)具有較好的精確度和可靠度。溫度對(duì)松仁粕清蛋白提取率的影響最大，其次是時(shí)間，料液比的影響最小；模型中A2、B2、C2、C對(duì)松仁粕清蛋白提取率的影響極顯著(P＜0.01)，A、B互作對(duì)松仁粕清蛋白的提取率的影響達(dá)顯著水平(P＜0.05)。根據(jù)該回歸方程繪制響應(yīng)面圖(圖1)，得到最佳提取工藝：料液比為1∶25.16，提取時(shí)間為 91.53 min，提取溫度為52.57 ℃。此條件下，松仁粕清蛋白的理論提取率為23.60%。

表3 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the established regression model

圖1 響應(yīng)面交互作用下松仁粕清蛋白的提取率Fig.1 Yield of albumin response surface interaction

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)優(yōu)化的工藝參數(shù)，結(jié)合實(shí)際操作，將松仁粕清蛋白最佳提取工藝修正為料液比 1∶25，時(shí)間92 min，溫度53 ℃。經(jīng)3次平行試驗(yàn)，松仁粕清蛋白的提取率分別為 23.49%、23.65%、23.42%，平均提取率為23.52%，實(shí)際結(jié)果與模型結(jié)果吻合度良好，說(shuō)明該模型可以較好地預(yù)測(cè)松仁粕清蛋白的提取率。

2.4 功能性質(zhì)的測(cè)定結(jié)果

2.4.1 pH值對(duì)松仁粕清蛋白溶解性的影響

松仁粕清蛋白的溶解性試驗(yàn)結(jié)果表明，松仁粕清蛋白在 pH 值為1、3、5、7、9、11時(shí)的溶解度分別為(20.43±0.26)%、(3.37±0.30)%、(4.90± 0.36)%、(15.97±0.22)%、(78.28±0.26)%、(95.48± 0.26)%，清蛋白的溶解性在 pH 值為 3 時(shí)最小，之后隨 pH值增大，松仁粕清蛋白的溶解性增大，表明松仁粕清蛋白在堿性條件下溶解性良好。

2.4.2 pH 值對(duì)松仁粕清蛋白起泡性的影響

如圖2所示，在pH 值為3時(shí)，松仁粕清蛋白的起泡性與起泡穩(wěn)定性均較差，之后隨 pH 值的升高，清蛋白的起泡性與起泡穩(wěn)定性增加，且泡沫細(xì)膩，表明松仁粕清蛋白在堿性條件下的起泡性和穩(wěn)定性較好。

圖2 不同pH值下松仁粕清蛋白起泡性及其穩(wěn)定性Fig.2 The foaming capacity and stability of pine nut at different pH values

2.4.3 pH值對(duì)松仁粕清蛋白乳化性的影響

由圖3可知，在 pH 值為3時(shí)，清蛋白的乳化性與乳化穩(wěn)定性最差，分別為0.636 m2/g和39.33 min，pH ＞ 3 時(shí)，松仁粕清蛋白的乳化性與乳化穩(wěn)定性都隨 pH 值的增加而增加，在 pH值為 11.0時(shí)，松仁粕清蛋白乳化性與乳化穩(wěn)定性最好，分別為34.32 m2/g和93.84 min。

圖3 不同pH值下松仁粕清蛋白的乳化性及其穩(wěn)定性Fig.3 The emulsification and stability of pine nut at dif ferent pH values

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，當(dāng)料液比為1∶25時(shí)，松仁粕清蛋白的提取率最高，隨著溶劑的增加，提取率下降，可能是蛋白質(zhì)分子與脫脂松仁粉顆粒的吸附作用大于蛋白質(zhì)與水的擴(kuò)散作用，導(dǎo)致松仁粕清蛋白的提取率下降[9-10]，這一結(jié)果與周立卿等[11]研究結(jié)果一致；松仁粕清蛋白的提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加，當(dāng)時(shí)間大于 90 min 時(shí)提取率下降，是因?yàn)樗扇势汕宓鞍椎娜艹雎蔬_(dá)到飽和，水浴振蕩會(huì)導(dǎo)致蛋白的變性，從而提取率會(huì)降低[12-13]，這與張貞亮[14]在不同時(shí)間內(nèi)提取杏仁蛋白的結(jié)果一致；松仁粕清蛋白提取率也會(huì)隨著溫度的升高呈先升高后降低的趨勢(shì)，可能是溫度過(guò)高造成部分蛋白質(zhì)變性所致[15-16]，這與洪晶等[17]的研究結(jié)果一致。

在松仁粕清蛋白功能性質(zhì)的測(cè)定中，pH值為3時(shí)松仁粕清蛋白的溶解性最小，這可能是在等電點(diǎn)附近時(shí)，松仁粕清蛋白凈電荷較少，隨著 pH 的增加，松仁粕清蛋白的溶解性增加，當(dāng) pH 值大于3時(shí)，松仁粕清蛋白分子主要以負(fù)離子形式存在，隨著pH的增加，松仁粕清蛋白表面帶的負(fù)電荷就越多，排斥力增強(qiáng)，蛋白的溶解性也就增強(qiáng)，這與WU等[18]的研究結(jié)果一致；松仁粕清蛋白在堿性條件下的起泡性及其穩(wěn)定性較好，可能是堿性條件下松仁粕清蛋白的溶解性增加，蛋白質(zhì)的凈電荷增加，松仁粕清蛋白在空氣與水的表面能快速的展開(kāi)并捕捉空氣中的粒子，從而促進(jìn)了泡沫的形成，這與鄧芝串等[19]研究的黑籽瓜種子蛋白的起泡性與起泡穩(wěn)定性的結(jié)果一致；松仁粕中清蛋白在堿性條件下的乳化性和乳化穩(wěn)定性較好，是因?yàn)椴辉诘入婞c(diǎn)時(shí)，蛋白分子所帶的凈電荷增加，靜電斥力阻止油的聚集，同時(shí)松仁粕清蛋白的溶解度增加，使其向油和水界面擴(kuò)散的能力增強(qiáng)，從而提高了乳化性。乳化活性指數(shù)的變化與蛋白質(zhì)的溶解性的變化趨勢(shì)是相似的，說(shuō)明松仁粕清蛋白的乳化指數(shù)與松仁粕清蛋白的溶解性密切相關(guān)。這與史卿[20]研究富硒菜籽粕中蛋白的乳化性趨勢(shì)一致。

綜上所述，松仁粕中清蛋白較優(yōu)提取工藝參數(shù)為料液比1∶25、提取時(shí)間 92 min、提取溫度53 ℃，在此條件下，松仁粕中清蛋白的提取率為23.52%。松仁粕清蛋白的起泡性與乳化性均與松仁粕清蛋白的溶解性密切相關(guān)，在pH為3時(shí)松仁粕清蛋白的溶解性最差，在堿性條件下溶解性較好，起泡性與乳化性能也較好。

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責(zé)任編輯：尹小紅

英文編輯：梁 和

Study on extraction technology and functional properties of albumin in pine nut meal

ZHAO Nan, RUAN Junqing, BAO Yihong*
(College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

The defatted pine nut meal was taken as the material and the distilled water as extraction agent. Three single factor tests of ratio of material to solvent(1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30), extraction time( 30, 60, 90, 120, 150 min)and extraction temperature( 35, 40, 45, 50, 55 ℃)were conducted to detect the extraction efficiency of protein. On the basis of single factor tests, the extraction process parameters of albumin were optimized by response surface methodology, and the functional properties of albumin were studied. The results showed that the optimum extraction conditions of albumin in pine nut meal were as follows： the ratio of material to liquid was 1∶25, extraction time was 92 min, extraction temperature was 53 ℃, and the extraction rate of albumin was 23.52%. The solubility of albumin from pine nut meal was the smallest at pH 3.The albumin have good solubility, foaming and emulsifying properties under alkaline conditions.

pine nut; albumin; response surface optimization; extraction process; functional properties

TQ914.3

A

1007-1032(2017)04-0464-05

2016-08-30

2017-05-07

中央高校科研項(xiàng)目(2572014EA02，2572016AA39)；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目(2015RAXXJ010)

趙楠(1991—)，女，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，主要從事食品生物技術(shù)與功能食品研究，smyzhaonan@163.com；*通信作者，包怡紅，教授，主要從事食品生物技術(shù)與功能食品研究，baoyihong@163.com