李跑，馬雁軍，馬莉，張威，周駿，杜國(guó)榮,*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心北京工作站，北京 101121；3.國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，河南 鄭州 450001)

煙草總植物堿國(guó)際共同實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法的比對(duì)

李跑1，馬雁軍2，馬莉2，張威3，周駿2，杜國(guó)榮1,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心北京工作站，北京 101121；3.國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，河南 鄭州 450001)

聯(lián)合國(guó)際煙草科學(xué)研究合作中心(CORESTA)10家國(guó)際共同實(shí)驗(yàn)室，對(duì)8個(gè)煙草樣品分別用水和乙酸萃取、用連續(xù)流動(dòng)(硫氰酸鉀)法(NM法)替代高毒性氰化鉀法(CRM35法)提取總植物堿，8個(gè)煙草樣品的總植物堿含量為1.00%～5.00%。使用重現(xiàn)性和再現(xiàn)性、配對(duì)T檢驗(yàn)、Bland–Altman、Passing–Bablok回歸方法，對(duì)10個(gè)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明：NM法和CRM35法的測(cè)定值相近；水萃取結(jié)果都略高于乙酸萃取結(jié)果，相對(duì)平均偏差小于4.00%；水萃取法和乙酸萃取法之間存在線性關(guān)系，且可以通過(guò)Passing–Bablok回歸法實(shí)現(xiàn)不同萃取體系結(jié)果的相互轉(zhuǎn)化。NM法避免了使用高毒的氰化鉀試劑，且得到結(jié)果與CRM35一致，適用于煙草中總植物堿的測(cè)定。

煙草；總植物堿；配對(duì)T檢驗(yàn)；Bland–Altman法；Passing–Bablok法

煙草總植物堿包括近 50種生物堿類物質(zhì)，其中煙堿占植物堿總量的 95%以上[1–2]。目前測(cè)定煙草及其制品中總植物堿含量采用的方法，一類是光度法[3]，另一類是連續(xù)流動(dòng)法[4–5]。光度法操作過(guò)程包括蒸餾和光度測(cè)定兩步，受蒸餾裝置和單次測(cè)定量的限制，檢測(cè)周期較長(zhǎng)，難以適應(yīng)大批量樣品的檢測(cè)需求，常被用作定標(biāo)。連續(xù)流動(dòng)法由SADELER等[6]首次采用。1981年，HARVEY等[7]提出使用氰化鉀和氯胺T在線反應(yīng)生成氯化氰，代替溴化氰測(cè)定總植物堿的連續(xù)流動(dòng)法，避免使用易揮發(fā)、易爆炸、易分解、劇毒的溴化氰。國(guó)際煙草科學(xué)研究合作中心(CORESTA)借鑒HARVEY等的研究成果，于1994年發(fā)布了35號(hào)推薦方法(簡(jiǎn)稱CRM35法)。該方法中仍使用氰化鉀，依然存在使用危險(xiǎn)和管理風(fēng)險(xiǎn)。自2011年起，CORESTA化學(xué)常規(guī)分學(xué)組先后著手用無(wú)毒的硫氰化鉀與次氯酸鈉、硫氰化鉀與二水合二氯異氰尿酸鈉(簡(jiǎn)稱DCIC)的在線反應(yīng)代替氰化鉀和氯胺T在線反應(yīng)的研究工作，但是次氯酸鈉為液體，易分解，不穩(wěn)定，用前要采用滴定方法確定其有效氯濃度，因此采用硫氰化鉀與 DCIC在線反應(yīng)比較理想。從安全性和技術(shù)進(jìn)步角度出發(fā)，且保持與CRM35法測(cè)定準(zhǔn)確度一致的前提下，中國(guó)國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)中心與上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心北京工作站率先找到了硫氰化鉀與 DCIC最佳在線反應(yīng)條件和緩沖體系[8]，在CORESTA化學(xué)常規(guī)分學(xué)組會(huì)議上，提出了連續(xù)流動(dòng)(硫氰酸鉀)法(簡(jiǎn)稱 NM 法)測(cè)定煙草及其制品總植物堿含量國(guó)際共同實(shí)驗(yàn)方案，涉及乙酸或水萃取2種方式。該方法經(jīng)過(guò)2年多的CORESTA國(guó)際共同實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，現(xiàn)已被CORESTA國(guó)際組織認(rèn)可。

為了驗(yàn)證NM法和CRM35法測(cè)定煙草及其制品總植物堿結(jié)果的一致性，筆者提供了8個(gè)具代表性的樣品，分發(fā)給 10家國(guó)際共同實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行水萃取和5%乙酸萃取條件下的NM法和CRM35法測(cè)定總植物堿含量的國(guó)際共同實(shí)驗(yàn)。對(duì)CORESTA國(guó)際共同實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按ISO 5725—2[9]標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，采用重現(xiàn)性和再現(xiàn)性、配對(duì) T檢驗(yàn)、Bland–Altman、Passing– Bablok回歸方法進(jìn)行一致性對(duì)比。

1 材料與方法

1.1 材料

國(guó)際共同實(shí)驗(yàn)樣品，烤煙(A)、白肋煙(B)、香料煙(C)、曬紅煙(D)、中式烤煙(E)、中式混合型卷煙2(F)，由國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心提供；國(guó)際共同實(shí)驗(yàn)標(biāo)煙 CM7(G)和 3R4F(H)由 CORESTA常規(guī)化學(xué)分學(xué)組提供。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法

樣品水分含量按YC/T 31—1996方法測(cè)定。分別按 CRM35法(YC/T 160—2002)和 NM 法(YC/T 468—2013)測(cè)定煙草樣品的總植物堿含量。

1.3 一致性評(píng)價(jià)方法

運(yùn)用重現(xiàn)性和再現(xiàn)性[10]、配對(duì) T檢驗(yàn)[11–15]、Bland–Altman 檢驗(yàn)[16–20]、線性回歸法[21]4 種方法對(duì)10個(gè)實(shí)驗(yàn)室的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行一致性比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草樣品總植物堿的含量

圖1顯示了10家實(shí)驗(yàn)室水萃取和乙酸萃取下CRM35法和NM法測(cè)定8個(gè)煙草樣品總植物堿含量的平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。從圖1中可以看出，在相同的萃取方式下，CRM35法和NM法的結(jié)果差別較小；水萃取的結(jié)果略高于乙酸萃取的；部分實(shí)驗(yàn)室的測(cè)定結(jié)果可能是離群值，如5號(hào)實(shí)驗(yàn)室的樣品E的測(cè)定結(jié)果偏高，4號(hào)實(shí)驗(yàn)室的CRM35水萃取體系結(jié)果較其他實(shí)驗(yàn)室的偏高，10號(hào)實(shí)驗(yàn)室的乙酸萃取結(jié)果較其他實(shí)驗(yàn)室的都偏低。

圖1 10家實(shí)驗(yàn)室煙草樣品總植物堿的測(cè)定結(jié)果Fig.1 The measured data for total alkaloids of tobacco in the ten labs

為了剔除異常值，首先使用Grubb Test剔除實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的異常值，再按照ISO 5725—2方法，剔除包含異常值的實(shí)驗(yàn)室，結(jié)果見表 1。在計(jì)算時(shí)設(shè)定最多剔除2家實(shí)驗(yàn)室結(jié)果，以便保留足夠數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。經(jīng)過(guò)分析，6號(hào)、9號(hào)、10號(hào)實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)異常的情況較多，分別為10次、7次、6次。

表1 異常值檢驗(yàn)結(jié)果Table 1 Outlier test results

2.2 再現(xiàn)性限、重現(xiàn)性比對(duì)結(jié)果

剔除異常值后，8個(gè)樣品CRM35法、NM法的水萃取、乙酸萃取95%概率再現(xiàn)性限、重現(xiàn)性限值，以及實(shí)驗(yàn)室平均值分布見圖2。相同萃取條件下，2種方法的結(jié)果一致，相對(duì)偏差低于3.00%；水萃取結(jié)果略高于乙酸萃取結(jié)果，相對(duì)偏差低于4.00%。水萃取下，CRM35的重復(fù)性較大；乙酸萃取下，NM 的重復(fù)性較大。2種方法的再現(xiàn)性都較小。4種總植物堿測(cè)定方式的再現(xiàn)性限占比最大為26.93%，與CRM35方法再現(xiàn)性一致。

圖2 CRM35和NM法的重現(xiàn)性和再現(xiàn)性結(jié)果Fig.2 The repeatability and reproducibility by CRM35 and NM methods

2.3 配對(duì)T檢驗(yàn)法判斷一致性結(jié)果

使用雙尾配對(duì)T檢驗(yàn)，分別對(duì)10家實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果進(jìn)行分析。剔除異常值后，結(jié)果見表2。使用實(shí)驗(yàn)室總體均值計(jì)算時(shí)，只有水萃取體系時(shí)，2種方法的結(jié)果系統(tǒng)誤差小，P值大于0.05。乙酸萃取條件下2種方法的偏差很小，仍然無(wú)法通過(guò)配對(duì)T檢驗(yàn)。原因可能是配對(duì)T檢驗(yàn)容易受隨機(jī)誤差影響，需要和其他方法輔助進(jìn)行分析。單個(gè)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的配對(duì) T檢驗(yàn)結(jié)果差別較大，無(wú)法得出統(tǒng)一的結(jié)論，因此需要采用其他方法進(jìn)一步分析。

表2 配對(duì)T檢驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of paired-t test

2.4 Bland-Altman法判斷一致性結(jié)果

遵循Bland–Altman方法的指導(dǎo)原則，使用原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。8個(gè)樣品實(shí)驗(yàn)室均值的 Bland–Altman比對(duì)結(jié)果見圖3。圖中藍(lán)色虛線為方法間差值的平均值，紅色實(shí)線為95%一致性限，陰影部分為一致性限的置信限。不同萃取條件下，CRM35法結(jié)果的差值和平均值的相關(guān)系數(shù)為0.988，NM 法的乙酸萃取為0.971，因而參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行了線性校正，結(jié)果如圖3–C、圖3–D所示。藍(lán)色虛線是校正后方法間差值的均值分布。從圖3–A、圖3–B看出，相同萃取條件下，2種方法的差異非常小，都在0附近波動(dòng)。同樣方法在不同萃取條件下，方法間偏差都隨樣品濃度增加而增加，且具有較好的線性關(guān)系(圖 3–C、圖 3–D)。4種比較方式的 Bland–Altman分析結(jié)果都在95%一致性限內(nèi)，表明方法間結(jié)果一致。此外，還計(jì)算了10家實(shí)驗(yàn)室的Bland–Altman結(jié)果，所有實(shí)驗(yàn)室的4種比較方式的結(jié)果都位于95%一致性限內(nèi)。

為了比較各家實(shí)驗(yàn)室的Bland–Altman結(jié)果，表3列出了各家實(shí)驗(yàn)室及所有實(shí)驗(yàn)室Bland–Altman法95%一致性限。若結(jié)果經(jīng)過(guò)回歸校正，表3中列出方法差異平均值對(duì)應(yīng)的上限和下限。排除受異常值影響嚴(yán)重的5號(hào)實(shí)驗(yàn)室，其余實(shí)驗(yàn)室的95%一致性區(qū)間都很窄，4種測(cè)定方式的單個(gè)實(shí)驗(yàn)室一致性限范圍的中位值分別為0.227 5、0.185 4、0.163 4、0.165 2，表明方法間的一致性較好。

圖3 Bland-Altman法結(jié)果Fig.3 Bland-Altman results

表3 Bland-Altman檢驗(yàn)95%一致性限結(jié)果Table3 Results with 95% agreement limits determined by Bland-Altman method

2.5 Passing-Bablok回歸分析

由Bland–Altman法比對(duì)知，水萃取和乙酸萃取結(jié)果之間的偏差與樣品總植物堿含量呈線性關(guān)系。圖4為4種比較方式結(jié)果的Passing–Bablok法線性回歸圖。表4列出了測(cè)定結(jié)果間的相關(guān)系數(shù)、擬合前均方根誤差(RMSE)、線性回歸的預(yù)測(cè)均方根誤差(RMSEP)。從圖4–A和圖4–B看出，相同萃取條件下，2種方法的測(cè)定值的擬合線與正比例函數(shù)(y=x)線非常接近。相關(guān)系數(shù)均大于0.989 6，表明4種比較方式結(jié)果之間都具有線性關(guān)系，可以通過(guò)線性回歸進(jìn)行校正。圖4–C和圖4–D分別顯示了CRM35、NM在不同萃取條件下結(jié)果的線性關(guān)系。經(jīng)過(guò)線性回歸后，相同方法在不同萃取條件下結(jié)果的均方根誤差明顯減小(表4)，表明可以通過(guò)轉(zhuǎn)換降低不同萃取條件下測(cè)定結(jié)果間的差異。

圖4 使用最小二乘法判斷一致性結(jié)果Fig.4 Least squares regression results

表4 Passing-Bablok法回歸結(jié)果Table 4 Results of Passing-Bablok method

CRM35法和NM法都基于萃取液中的總植物堿(以煙堿計(jì))與對(duì)氨基苯磺酸和氯化氰反應(yīng)機(jī)理，差別在于氯化氰的生成方式不同，2種方法在水溶液中都會(huì)產(chǎn)成 ClO–，如果體系環(huán)境偏酸性，ClO–可能會(huì)與植物堿發(fā)生氧化還原反應(yīng)，致使最終檢測(cè)到的植物堿含量偏低[11]，乙酸萃取體系顯酸性，所以其結(jié)果低于中性的水萃取體系結(jié)果。

3 結(jié)論

對(duì)CRESTA的10家共同實(shí)驗(yàn)室8個(gè)煙草樣品的水萃取和乙酸萃取的2種方法檢測(cè)總植物堿結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明，相同萃取條件下，CRM35、NM檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)偏差小于3.00%；不同萃取條件下，CRM35和 NM 檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)偏差小于4.00%，水萃取體系結(jié)果略高。使用配對(duì)T檢驗(yàn)方法比對(duì)不同實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)值呈現(xiàn)不一致性結(jié)果，需要其他方法輔助進(jìn)行分析。Bland–Altman法結(jié)果表明，4種比較方式下，方法之間的結(jié)果都是一致的；不同萃取條件下的結(jié)果需要經(jīng)過(guò)線性回歸校正。使用Passing–Bablok法得出了不同萃取條件下，結(jié)果之間的線性關(guān)系，可以通過(guò)該法實(shí)現(xiàn)不同萃取體系結(jié)果的相互轉(zhuǎn)化。

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責(zé)任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅 維

A comparative study of international collaborative methods for determination of total alkaloids in tobacco

LI Pao1, MA Yanjun2, MA Li2, ZHANG Wei3, ZHOU Jun2, DU Guorong1,2*
(1.College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Beijing Work Station, Technology Center, Shanghai Tobacco Group Co. Ltd., Beijing 101121, China; 3.China National Tobacco Quality Supervise and Test Center, Zhengzhou 450001, China)

Eight tobacco samples were tested in cooperation centre for scientific research relative to tobacco（CORESTA）collaborative study by ten laboratories. The total alkaloids were extracted by water and acetic acid and determined by NM method and CRM35 method, respectively. The total alkaloids are ranging from 1% to 5%. The repeatability and reproducibility were calculated and comparative study was achieved by paired–t test, Bland–Altman analysis and Passing–Bablok regression. Results show that agreement results were obtained by NM and CRM35 whether water or acetic acid is used. The results with water extraction were higher than that with acetic acid extraction for both NM and CRM35, and the relative deviation was lower than 4%. Besides, there is a linear relationship between the results of water extraction and acetic acid extraction and the differences caused by extractions can be modeled by Passing–Bablok regression analysis. NM method avoid the use of KCN, and the results obtained were agreeable to those obtained by CRM35 method which used KCN, indicating NM is suitable for the determination of total alkaloid in tobacco.

tobaccos; total alkaloids; paired–t test; Bland–Altman; Passing–Bablok

S572.01

A

1007-1032(2017)04-0388-06

2017–04–12

2017–05–22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目( 31601551)；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)青年基金項(xiàng)目(15YJ08)；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院青年科學(xué)基金項(xiàng)目

李跑(1989—)，男，湖南長(zhǎng)沙人，博士研究生，主要從事煙草化學(xué)與數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析研究，lipao@live.cn；*通信作者，杜國(guó)榮，博士研究生，主要從事煙草化學(xué)與數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析研究，nkchem09@126.com