吳彥慶，姜宇，趙大球，陶俊,*

(揚(yáng)州大學(xué) a.動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院；b.園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

芍藥查爾酮異構(gòu)酶基因CHI的表達(dá)特性分析

吳彥慶a，姜宇b，趙大球b，陶俊a,b*

(揚(yáng)州大學(xué) a.動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院；b.園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

為了揭示查爾酮異構(gòu)酶基因(chalcone isomerase gene，CHI)在芍藥花瓣中的表達(dá)規(guī)律與特點(diǎn)，以不同芍藥托桂型品種(‘金輝’ ‘彤云金焰’‘紅樓錦菊’)4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期(花蕾期、初開期、盛開期、衰敗期)中的內(nèi)、外花瓣為對(duì)象，用qPCR分別檢測(cè)CHI基因的表達(dá)水平，分析其在不同芍藥品種、不同發(fā)育時(shí)期以及內(nèi)外花瓣之間的表達(dá)差異。結(jié)果顯示：不同發(fā)育時(shí)期同一品種芍藥花瓣組織CHI基因的表達(dá)量存在一定差異，從花蕾期到衰敗期整體表現(xiàn)為上升趨勢(shì)；不同品種同一發(fā)育時(shí)期‘彤云金焰’花瓣組織(內(nèi)瓣和外瓣)CHI基因的表達(dá)水平明顯高于‘金輝’和‘紅樓錦菊’的；同一芍藥品種在相同發(fā)育時(shí)期內(nèi)瓣組織的CHI基因表達(dá)量均明顯高于外瓣組織的。鑒于不同芍藥品種、不同發(fā)育時(shí)期內(nèi)外花瓣間顏色存在差異，推測(cè)CHI基因表達(dá)量可能與芍藥花瓣顏色的形成有關(guān)。該結(jié)果可為深入研究芍藥CHI功能并開展芍藥花色遺傳改良分子育種研究提供技術(shù)支撐。

芍藥；查爾酮異構(gòu)酶基因CHI；花瓣；基因表達(dá)

芍藥(Paeonia lactiflora Pall.)是中國傳統(tǒng)名花，其花色優(yōu)劣不僅影響到觀賞植物的觀賞價(jià)值，而且直接關(guān)系到其商業(yè)開發(fā)價(jià)值。中國芍藥品種資源豐富，粉、紅、紫色系等芍藥品種諸多，而黃色品種極為稀少，因此，培育新奇花色如黃色的芍藥品種已是中國觀賞植物育種工作者當(dāng)前面臨的重要課題。目前所發(fā)現(xiàn)的與黃色形成有關(guān)的色素主要為類胡蘿卜素(carotenoids)和類黃酮(flavonoids)二大類，而在類黃酮生物合成中，黃色的形成均與查爾酮異構(gòu)酶基因(chalcone isomerase gene，CHI)有關(guān)[1]。在黃酮類生物合成中，CHI是一種非常穩(wěn)定的酶，它參與黃酮類生物合成的早期步驟，它具有立體專一性，能大大加快環(huán)化的查爾酮形成黃烷酮。CHI活性影響花色素合成和黃烷酮前體、苯丙氨酸類植保素的生物合成[2]，因此，CHI基因在黃色花的改良中起著十分重要的作用。鑒于CHI基因在黃色花改良中的重要性，有關(guān)學(xué)者對(duì)該基因開展了相關(guān)研究。1987年法國研究者第一次從蠶豆中分離出CHI基因的cDNA[3]，隨后，不同植物中的CHI基因被陸續(xù)分離出來，如茶樹[4](Camellia sinensis)、金銀花[5](Lonicera japonica)、大豆[6](Glycine max)、水仙[7](Narcissus tazetta)、銀杏[8](Ginkgo biloba)等。雖然研究者們克隆得到了許多物種中的CHI基因，但是主要集中于觀賞植物和草本植物，如喬中全等[5]成功克隆出金銀花葉片CHI基因cDNA全長序列，長 725 bp；馬春雷等[4]采用 ESTs測(cè)序技術(shù)和 T4RNA連接酶介導(dǎo)的 5′ RACE技術(shù)克隆了全長 1 163 bp的茶樹CHI基因。對(duì)于芍藥CHI基因而言，揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院花卉研究所前期采用RACE技術(shù)成功克隆出芍藥CHI基因的DNA全長序列1 163 bp，并用生物信息學(xué)對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)[9]。此外， CHI基因表達(dá)量的多少會(huì)直接影響到上游黃色查爾酮、下游無色或淡黃色花黃素以及紅色花色苷的積累，從而影響顏色或黃酮類化合物的變化。在矮牽牛突變體中，花藥中CHI的啟動(dòng)子突變后使CHI表達(dá)下降，導(dǎo)致花粉顏色變成黃色或綠色[10]；仙客來(Cyclamen persicum)中CHI基因的表達(dá)活性降低后，植物積累大量查爾酮，并產(chǎn)生黃色的花朵[11]，轉(zhuǎn)座子的插入失活造成CHI和DFR突變，從而導(dǎo)致康乃馨(Dianthus caryophyllus)的花色變?yōu)辄S色[12]；在洋蔥(Allium cepa)中，CHI基因失活會(huì)導(dǎo)致黃酮類化合物槲皮素含量減少[13]。鑒于CHI基因表達(dá)量與花瓣黃色形成相關(guān)，本研究中選取3個(gè)芍藥托桂型品種‘金輝’、‘彤云金焰’、‘紅樓錦菊’，分別以 4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期(花蕾期、初開期、盛開期、衰敗期)中內(nèi)外花瓣(外瓣紅色，內(nèi)瓣黃色)為試驗(yàn)材料，用qPCR檢測(cè) CHI基因在不同芍藥品種、不同發(fā)育時(shí)期以及內(nèi)外花瓣之間的表達(dá)差異，旨在揭示CHI基因在芍藥花中的表達(dá)規(guī)律及作用機(jī)理，為深入開展芍藥CHI基因功能驗(yàn)證提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)植物

以芍藥托桂型品種‘金輝’‘彤云金焰’‘紅樓錦菊’為材料。3個(gè)品種芍藥的外瓣均為紅色，內(nèi)瓣均為黃色。分別采其花蕾期、初開期、盛開期和衰敗期的內(nèi)、外花瓣作為基因表達(dá)的材料。所有植物花瓣均采自揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院芍藥種質(zhì)資源圃?；ò杲?jīng)液氮速凍后，置于-80 ℃冰箱中，備用。

1.2 主要試劑

DL2000、dNTP、PCR Buffer、RNA純化試劑盒DNase I、DNA凝膠回收試劑盒、LATaq DNA聚合酶等均購于 TaKaRa；逆轉(zhuǎn)錄酶 SuperScriptIII Reverse Transcriptase (R250-01)和熒光染料 SYBR Green I(CS7561)均購于Invitrogen；cDNA序列測(cè)定和引物合成均委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)[9]中方法獲得芍藥 CHI基因 cDNA序列。用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性表達(dá)引物(表1)。內(nèi)參采用芍藥的β-Actin基因(JN105299)。所有引物送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 CHI基因的定量引物信息Table 1 Primer information of CHI gene

1.4 總RNA的提取及cDNA的合成

芍藥總RNA采用Trizol法提取，用DEPC水溶解，-80 ℃保存?zhèn)溆?。cDNA 合成體系 10 μL：1 μL總 RNA，1 μL 3′ RACE Adaptor(5 μmol)，2 μL 5×M-MLV Buffer，1 μL dNTP Mixture(10 mmol/μL)，0.25 μL RNase Inhibitor，0.25 μL Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)，4.5 μL RNase Free ddH2O。反應(yīng)條件：42 ℃孵育60 min，70 ℃加熱15 min后終止反應(yīng)。反應(yīng)液于－20 ℃保存。

1.5 qPCR分析

以反轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系 25 μL：12.5 μL SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)，0.5 μL PCR Forward Primer，0.5 μL PCR Reverse Primer，0.5 μL Rox Reference Dye Ⅱ(50×)，2 μL cDNA模板，最后補(bǔ)充ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用 2-ΔΔCt法[14]進(jìn)行處理。ΔΔCt =(待測(cè)組目的基因平均 Ct值－待測(cè)組看家基因平均 Ct值)－(對(duì)照組目的基因平均Ct值－對(duì)照組看家基因平均Ct值)。每份樣本進(jìn)行3次實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，取平均值。用SPSS 16.0軟件對(duì)不同品種、不同發(fā)育時(shí)期以及內(nèi)外花瓣間 CHI基因表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 同一發(fā)育時(shí)期不同芍藥品種花瓣組織 CHI基因表達(dá)量的差異

由表2可見，在花蕾期，‘彤云金焰’內(nèi)瓣組織的CHI基因表達(dá)量極顯著高于‘金輝’和‘紅樓錦菊’內(nèi)瓣組織的(P＜0.01)，外瓣組織的CHI基因表達(dá)量顯著高于‘金輝’和‘紅樓錦菊’外瓣組織的(P＜0.05)；在初開期，‘彤云金焰’花瓣組織(內(nèi)瓣和外瓣)的CHI基因表達(dá)量均極顯著高于‘金輝’和‘紅樓錦菊’花瓣組織的(P＜0.01)；在盛開期，‘彤云金焰’內(nèi)瓣組織的CHI基因表達(dá)量極顯著高于‘金輝’和‘紅樓錦菊’內(nèi)瓣組織的(P＜0.01)，外瓣組織的 CHI基因表達(dá)量極顯著高于‘金輝’的(P＜0.01)，顯著高于‘紅樓錦菊’外瓣組織的(P＜0.05)；在衰敗期，‘彤云金焰’內(nèi)瓣組織的CHI基因表達(dá)量極顯著高于‘金輝’和‘紅樓錦菊’內(nèi)瓣組織的(P＜0.01)，外瓣組織的 CHI基因表達(dá)量極顯著高于‘紅樓錦菊’的(P＜0.01)?？傮w而言，在同一發(fā)育時(shí)期，‘彤云金焰’品種花瓣組織(內(nèi)瓣和外瓣)CHI基因表達(dá)水平明顯高于‘金輝’和‘紅樓錦菊’的。

表 2 不同發(fā)育時(shí)期各品種芍藥內(nèi)瓣和外瓣組織 CHI基因的表達(dá)量Table 2 Expression level of CHI gene in inne r-petal and o uterpetal tissues from different Paeonia lactiflora cultivars at different growing stages

2.2 同一品種芍藥不同發(fā)育時(shí)期花瓣組織中 CHI基因表達(dá)量的差異

‘金輝’品種花蕾期、初開期、盛開期和衰敗期之間花瓣組織(內(nèi)瓣和外瓣)CHI基因表達(dá)量間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；‘彤云金焰’花蕾期內(nèi)瓣組織的 CHI基因表達(dá)量顯著低于衰敗期內(nèi)瓣組織的(P＜0.05)，而4個(gè)時(shí)期外瓣組織CHI基因表達(dá)量間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；‘紅樓錦菊’盛開期內(nèi)瓣組織的CHI基因表達(dá)量顯著高于花蕾期、初開期內(nèi)瓣組織的(P＜0.05)，衰敗期外瓣組織的CHI基因表達(dá)量顯著低于盛開期、初開期外瓣組織的(P＜0.05)。從整體來看，同一品種芍藥花瓣組織的CHI基因表達(dá)量在不同發(fā)育時(shí)期存在一定的差異，從花蕾期到衰敗期整體表現(xiàn)為上升趨勢(shì)。

2.3 同一芍藥品種在相同發(fā)育時(shí)期內(nèi)、外花瓣組織CHI基因表達(dá)量的差異

由表2可見，在花蕾期，‘金輝’內(nèi)瓣組織的CHI基因表達(dá)量極顯著高于外瓣組織的(P＜0.01)；在初開期，‘金輝’內(nèi)瓣組織的CHI基因表達(dá)量顯著高于外瓣組織的(P＜0.05)；在盛開期，‘金輝’內(nèi)瓣組織的CHI基因表達(dá)量顯著高于外瓣組織的(P＜0.05)，‘彤云金焰’內(nèi)瓣組織的 CHI基因表達(dá)量極顯著高于外瓣組織的(P＜0.01)，‘紅樓錦菊’內(nèi)瓣組織的 CHI基因表達(dá)量顯著高于外瓣組織的(P＜0.05)；在衰敗期，‘彤云金焰’內(nèi)瓣組織的CHI基因表達(dá)量顯著高于外瓣組織的(P＜0.05)，‘紅樓錦菊’內(nèi)瓣組織的 CHI基因表達(dá)量極顯著高于外瓣組織的(P＜0.01)。整體而言，同一芍藥品種在相同發(fā)育時(shí)期內(nèi)瓣組織的CHI基因表達(dá)量明顯高于外瓣組織的。

3 結(jié)論與討論

CHI基因的表達(dá)具有發(fā)育階段特異性、組織特異性和空間特異性。在‘巨峰’葡萄(Vitis vinifera)中，CHI基因在幼葉、幼根、果皮、果肉和種子中均有表達(dá)，但不同組織中的表達(dá)方式不同。CHI基因在花后30、90 d果皮和在花后90 d果肉及在花后45 d種子中均高度表達(dá)[15]。 果實(shí)成熟階段，‘國慶4號(hào)’溫州蜜柑(Citrus unshiu)果皮中 CHI的表達(dá)量均逐漸下降，而果肉中CHI的表達(dá)量均有一定程度的上升[16]。在金花茶(Camellia nitidissima)花芽發(fā)育過程中，CHI基因的表達(dá)呈現(xiàn)出先急劇上升而后平緩下降的趨勢(shì)，金花茶CHI基因主要在花芽發(fā)育的早期進(jìn)行表達(dá)；CHI基因在苞片、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊中均有表達(dá)，但在雌蕊中的表達(dá)量最高，其次是在雄蕊中的[17]。本研究中，芍藥內(nèi)瓣CHI基因的表達(dá)量顯著高于外瓣的，在4個(gè)發(fā)育時(shí)期(花蕾期，初開期，盛開期，衰敗期)大部分均呈現(xiàn)先增加后減少的表達(dá)趨勢(shì)，且‘彤云金焰’的表達(dá)水平明顯高于‘紅樓錦菊’和‘金輝’的。由于其外瓣均為粉紅色，內(nèi)瓣為黃色，不同發(fā)育階段顏色深淺也發(fā)生變化，‘彤云金焰’的顏色較深，因此，可推測(cè) CHI基因的表達(dá)量與芍藥花瓣黃色的調(diào)控密切相關(guān)。

牡丹 CHI基因過表達(dá)載體導(dǎo)入煙草高效遺傳轉(zhuǎn)化體系后，轉(zhuǎn)基因煙草的總黃酮和黃酮含量比野生型的提高了3倍，其花色苷含量和花色強(qiáng)度均明顯降低[18]。NISHIHARA等[19]用RNAi干涉技術(shù)抑制煙草內(nèi)源CHI基因表達(dá)，煙草的花瓣和花粉顏色變淡，黃酮含量發(fā)生改變。甘油型油菜(Scutellaria baicalensis)CHI基因的RNAi載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜黑籽品種雙 10號(hào)的下胚軸中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因植株花瓣的顏色在花蕾早期明顯變淺[20]。 采用超量表達(dá)引發(fā)共抑制和反義抑制的方法將水母雪蓮(Saussurea medusa)的CHI基因?qū)氲桨珷颗：?，深紅色的矮牽?；ㄉ儨\，并出現(xiàn)深色網(wǎng)狀紋路，部分還帶有不同表達(dá)模式的白色斑塊，柱頭顏色也由深綠色變成淺綠色[21]。本研究中 CHI基因在不同芍藥內(nèi)外花瓣的表達(dá)差異和不同發(fā)育階段表達(dá)規(guī)律的發(fā)生機(jī)理，還有待用RNAi[22]和過表達(dá)[23]等技術(shù)對(duì)CHI基因的功能進(jìn)行驗(yàn)證。

芍藥查爾酮異構(gòu)酶(CHI)基因在芍藥不同品種、不同發(fā)育時(shí)期、內(nèi)外花瓣之間的表達(dá)水平均存在一定的差異，其中，內(nèi)瓣組織CHI基因的表達(dá)水平顯著高于外瓣的(P＜0.05)，‘彤云金焰’的表達(dá)量顯著高于‘金輝’和‘彤云金焰’的(P＜0.05)，4 個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的CHI基因表達(dá)量在一定程度上也存在差異。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫

Expression pattern analysis on the chalcone isomerase (CHI) gene in Paeonia lactiflora cultivars

WU Yanqinga, JIANG Yub, ZHAO Daqiub, TAO Juna,b*
(a.College of Animal Science and Technology; b.College of Horticulture and Plant Protection, Yangzhou University,Yangzhou, Jiangsu 225009, China)

Chalcone isomerase (CHI) is a key gene in regulating the formation of yellow petals. Inner and outer petals from different Paeonia lactiflora cultivars including Jinhui, Tongyunjinyan, Hongloujinju at four growing stages(flower-bud stage, initiating bloom stage, bloom stage, wither stage) were selected as materials to study expression pattern and characteristic of CHI gene. Expression difference of CHI gene in inner and outer petal at four growing stages among different Paeonia lactiflora cultivars were conducted using qPCR technology. The results showed that the expression level of CHI gene exhibited difference in petal tissues from the same cultivar and showed a rise trend from flower bud stage to wither stage; For different cultivars, the expression level of CHI gene in petal tissues of Tongyunjinyan was apparently higher than that of Jinhui and Tongyunjinyan at the same growing stages, furthermore, it was apparently higher in inner petals than that in outer petals for the same cultivars at same growing stages. Considering color difference in inner and outer petals at different growing stages and different Paeonia lactiflora cultivars, it was speculated that the expression level of CHI gene might be related to the color formation of petals in Paeonia lactiflora.The result could provide theoretical guidance for further research on the CHI function and genetic improvement to flower color of Paeonia lactiflora.

Paeonia lactiflora; chalcone isomerase (CHI) gene; petal; gene expression

Q939.5

A

1007-1032(2017)04-0372-05

2016-12-05

2017-05-05

國家自然科學(xué)基金(31372097，31400592)；江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目(13KJA210005)

吳彥慶(1988—)，男，江蘇揚(yáng)州人，碩士研究生，主要從事觀賞園藝研究，yqwu19880928@126.com；*通信作者，陶俊，研究員，主要從事觀賞植物栽培生理、遺傳育種與分子生物學(xué)研究，taojun@yzu.edu.cn