彭旺，唐小明，葛猛，楊濤濤，屈泰龍，余興龍*

(1.湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南 長沙 410128；2. 湖南省動物疫病預防控制中心，湖南 長沙 410007)

豬薩佩羅病毒間接免疫熒光方法的建立與初步應用

彭旺1，唐小明2，葛猛1，楊濤濤1，屈泰龍1，余興龍1*

(1.湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南 長沙 410128；2. 湖南省動物疫病預防控制中心，湖南 長沙 410007)

以分離的豬薩佩羅病毒PSV HuN1/2016株感染PK15細胞，制備抗原板，建立檢測豬血清中PSV 抗體的間接免疫熒光(IFA)方法。結果表明：一抗最佳稀釋濃度為1∶300；FITC標記的羊抗豬熒光二抗最佳稀釋濃度為1∶300。該方法特異性強，敏感度高，既能將PSV抗體與PRRSV、FMDV、PCV、CSFV抗體區(qū)分開，也可以檢測到中和效價 0.128的陽性血清。用該方法檢測湖南省部分規(guī)?；i場 208份臨床血清樣品的總陽性率為68%，表明PSV在湖南省流行普遍，且其感染主要發(fā)生在保育階段。

豬薩佩羅病毒；間接免疫熒光；抗體檢測；湖南

豬薩佩羅病毒(Porcine sapelovirus, PSV)是單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科薩佩羅病毒屬[1]。PSV曾被命名為PEV-8，被歸類為豬腸道病毒A(PEV-A)[2]。因PSV病毒特有的L蛋白和結構高度特異的 2A 基因及 5′端非編碼區(qū)(UTR)能將其與其他的腸道病毒區(qū)分開，后來將其歸類為一個新的屬[3-4]，2009年，國際病毒分類委員會(ICTV)正式將豬腸道病毒A(Porcine enterovirus A)更名為豬薩佩羅病毒(Porcine sapelovirus)[1]。薩佩羅病毒屬包含豬薩佩羅病毒(Porcine sapelovirus)、禽薩佩羅病毒(Avian sapelovirus)和猿薩佩羅病毒(Simian sapelovirus)。豬薩佩羅病毒只有一個血清型，家豬和野豬均可感染[5]，且感染豬只康復后依然會繼續(xù)排毒，成為重要的病毒傳染源[6]，因此，該病毒在飼養(yǎng)的豬群中感染率很高[7]。該病毒最早于1960年在英國被發(fā)現[8]，隨后在加拿大、日本、澳大利亞等世界范圍內的其他國家相繼報道[9-11]。PSV可引起豬腦脊髓灰質炎、肺炎、繁殖障礙、心包炎、心肌炎、皮膚損傷、腹瀉等多系統(tǒng)綜合征，同時也可出現無明顯特征的亞臨床癥狀[12]。無論 PSV以何種形式存在，都對養(yǎng)豬業(yè)具有潛在的危害。

PSV的實驗室診斷方法主要包括病毒的分離與鑒定、RT-PCR等，但這些方法主要用于檢測病原，且對試驗條件和技術要求較高。目前還沒有關于豬薩佩羅病毒血清流行學方法的報道，還很難準確認識本病在豬群中的流行與感染情況。本研究中以實驗室分離的豬薩佩羅病毒 PSV HuN1/2016株為標準制備細胞抗原板，建立檢測豬血清中PSV抗體的間接免疫熒光(IFA)方法，旨在為 PSV的血清流行病學調查提供一種高敏感度和高特異性的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 毒株與細胞

PSV HuN1/2016分離株(GenBank登錄號為KX354740)、PK15細胞由湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學院動物微生物免疫實驗室分離與保存。

1.2 血清

PSV陰性血清采集于健康生長的豬。PSV陽性血清采集于受 PSV病毒感染的豬。經中和試驗驗證，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、豬圓環(huán)病毒 2型(PCV-2)和豬瘟病毒(CSFV)陽性而PSV陰性的抗體的由1.1中實驗室制備與保存。臨床血清樣品采自湖南省長沙、株洲、岳陽、邵陽等地的6個規(guī)?；i場。

1.3 主要試劑

羊抗豬IgG熒光二抗(FITC-IgG)為KPL公司產品；多聚甲醛、伊文思藍和無熒光甘油均為中國產品。

1.4 抗原板的制備

將 PK15細胞于 96孔板培養(yǎng)至單層后接種200TCID50PSV HuN1/2016，以未接毒細胞為對照。當20%細胞出現病變后棄去培養(yǎng)液，PBST洗滌后用4%多聚甲醛室溫固定20 min，-20 ℃保存，備用。

1.5 間接免疫熒光法(IFA)

將已固定的細胞抗原板用PBST洗滌3次，每次5 min，每孔加入10%山羊血清，37 ℃封閉2 h，棄掉封閉液，每孔加入100 μL稀釋的血清，4 ℃孵育12 h。PBST洗滌3次，每次5 min，每孔加入100 μL稀釋的羊抗豬IgG熒光二抗，37 ℃作用30 min。PBST洗滌3次，每次5 min，每孔加入50 μL 0.01%伊文思藍水溶液，室溫染色20 s，PBST洗滌3次，每次5 min，每孔加入30 μL無熒光甘油封底，用熒光倒置顯微鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 血清和熒光二抗的最佳稀釋度

用0.01 mol/L pH7.4的PBS緩沖液將陽性和陰性血清按1∶100、1∶200、1∶300、1∶400稀釋，熒光二抗按 1∶100、1∶200、1∶300、1∶400稀釋。根據方陣試驗確定血清最佳稀釋度為1∶300，熒光二抗最佳稀釋度為1∶300。在熒光顯微鏡下，陽性血清孔可見細胞漿內和膜上有綠色熒光染色(圖1-A)，陰性血清孔沒有非特異性熒光染料附著，且在伊文思藍染色下呈紅色(圖 1-B)。以此為標準對被檢測的血清進行判定。

圖1 PSV間接免疫熒光法檢測血清的陰性和陽性結果(20×10)Fig.1 Reaction of antibodies from serum samples against PSV detected by IFA(20×10)

2.2 特異性試驗結果

用PRRSV、FMDV、PCV-2和CSFV抗體進行交叉性試驗，確定抗原板的特異性。結果顯示：4種參考陽性血清檢測孔均未見任何特異性熒光，表現為陰性，表明該方法具有很好的特異性。

2.3 敏感度試驗結果

將 PSV 陽性血清(中和效價為 1∶128)依次做1∶10、1∶100、1∶1 000的10倍梯度稀釋，進行間接免疫熒光敏感度試驗。結果顯示：當陽性血清稀釋到1∶1 000時，血清檢測孔仍然有特異性熒光，表明該方法可以檢測到中和效價0.128的陽性血清。

2.4 對臨床血清樣品的檢測結果

用該方法對湖南省6個規(guī)?；i場(記為A、B、C、D、E、F)208份臨床血清樣品進行檢測，結果顯示：有142份樣品為陽性，樣品總陽性率為68%，表明PSV在湖南省流行普遍。

表1 臨床樣品的檢測結果Table 1 Results on clinic serum samples detected by IFA

3 結論與討論

對PSV的檢測目前主要以RT-PCR病原檢測為主，但RT-PCR檢測容易出現假陽性，且組織中病毒含量低時難以檢測出結果，檢測出的感染率可能會低于實際感染率。RT-PCR病原檢測也不適于曾經感染病毒但病毒已在豬體內消失的情況，而針對抗體檢測的免疫熒光方法可有效解決這一問題，有利于更加全面和系統(tǒng)地了解PSV的流行情況。

在本試驗 PSV抗體的間接免疫熒光方法建立過程中，將參考陽性血清稀釋到1 000倍時仍然能夠檢測到特異性熒光，但將弱陽性血清稀釋400倍時的檢測結果與陰性結果相差不大，而當血清稀釋倍數小于200倍時，部分檢測血清存在一定程度的非特異性熒光干擾，這可能與豬血清的非特異性吸附[13]有關，因此，臨床大批量檢測的血清最佳稀釋倍數為300倍。在減少非特異性熒光干擾試驗中，用10%山羊血清作為封閉液比用5%脫脂奶粉封閉液的效果好，推測這與本試驗中使用與熒光二抗羊抗豬來源同系的非免疫血清封閉有關。此外，本研究中建立的檢測 PSV抗體的間接免疫熒光方法與PRRSV、FMDV、PCV-2和PRV抗體無交叉反應，具有很好的特異性。

用建立的檢測方法檢測湖南省6個規(guī)模化豬場的208份臨床血清樣品，其中有142份樣品為陽性，樣品總陽性率為68%。進一步分析不同年齡階段豬群的 PSV抗體情況，結合 1.1中實驗室建立的ELISA方法檢測不同日齡豬血清的檢測結果，仔豬群的陽性率低，保育豬的陽性率升高，育肥豬的陽性率居高不下，依此可以推測PSV的感染規(guī)律：哺乳仔豬群因有母源抗體保護，抗體保護力較強；斷奶后隨著母源抗體消退，抗體保護力減弱；保育階段豬群出現PSV感染，育肥階段豬群抗體陽性率居高不下，表明PSV抗體在豬體內維持的時間比較長。

目前關于PSV血清學研究的報道尚少。本研究中建立的適用于快速、大批量檢測豬血清中PSV抗體的間接免疫熒光檢測方法，可為PSV血清流行病學研究提供參考。

參考文獻：

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責任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫

Establishing the indirect immunofluorescence assay for antibody detection from Porcine sapelovirus

PENG Wang1, TANG Xiao ming2, GE Meng1, YANG Taotao1, QU Tailong1, YU Xinglong1*
(1.College of Veterinary Medicine, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China; 2.Animal Disease Control Center of Hunan Province, Changsha 410007, China)

Indirect immunofluorescence assay (IFA) for detecting antibody of Porcine sapelovirus (PSV) from porcine serum was established by employed the strain PSV HuN1 cultured in PK-15 cells as antigen coating in plate. The primary antibody and fluorescent secondary antibody in the test were diluted to 300 times. The results showed that the approach not only had high specificity and sensitivity which could discriminate PSV from other porcine virus antigens(such as PRRSV, FMDV, PCV, and CSFV), but also could detect positive serum sample with concentration low to 0.128 SN titer. The fact detected by the established method that 68% samples out of 208 serums from commercial farms scattered in Hunan province were positive indicated that the PSV was widely prevalent in the region, and the infection was mainly occurred in the weaning period.

Porcine sapelovirus; indirect immunofluorescence assay; antibody detection; Hunan province

S858.28

A

1007-1032(2017)04-0423-04

2017-02-20

2017-03-11

彭旺(1991—)，男，湖南衡陽人，碩士研究生，主要從事動物病原分子學與免疫學研究，xuyi2030@163.com；*通信作者，余興龍，博士，教授，主要從事動物病原分子學與免疫學研究，xlyu999@126.com