湯賓，李玉軍，趙燕，黃麗華，黃妤，張學文

(湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128)

十字花科植物17個物種PIN3基因的系統(tǒng)進化分析

湯賓，李玉軍，趙燕，黃麗華，黃妤，張學文*

(湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128)

為了探明十字花科植物不同物種PIN3基因之間的進化差異，運用Brassica Database數(shù)據(jù)庫及十字花科基因數(shù)據(jù)庫在線平臺，對擬南芥(Arabidopsis thaliala)、紅花薺菜(Capsella rubella)、蕪青(Brassica rapa)、油菜(Brassica napus)、甘藍(Brassica oleracea)等17個已完成基因組測序的十字花科物種的18個(油菜含有2個)PIN3同源性基因進行分析，并對其推導的編碼蛋白(PIN3)進行了系統(tǒng)進化分析。結(jié)果表明，18個PIN3序列間的相似性為86.74%，PIN3推導蛋白之間的相似度為90.93%，蛋白等電點約為7.15～9.44，蕪青PIN3等電點明顯偏高。PIN3的氨基酸比對分析結(jié)果表明，在多個糖基化位點出現(xiàn)具有種屬差異性和符合進化關系的氨基酸替換現(xiàn)象，鹽芥屬植物中條葉藍芥(Thellugiella parvula)PIN3在更多的位點出現(xiàn)氨基酸的替換，這可能是導致十字花科不同種屬PIN3蛋白的功能和活性出現(xiàn)差異的原因。

十字花科；PIN3基因；系統(tǒng)進化

十字花科(Brassicaceae)因其分布范圍廣、種類繁多、結(jié)實量大、生長周期短和培養(yǎng)體系成熟等特點，被廣泛應用于各類植物學的研究[1]。目前十字花科植物中已有 17個種的基因組測序數(shù)據(jù)，這給其分子水平的研究提供了充足的資料。

PIN是植物中獨有的蛋白質(zhì)家族，參與植物體內(nèi)生長素極性運輸，作為植物進化研究的指標有較好的參考價值[2]。PIN(PIN-FORMED)基因家族共有8個成員[3]。研究[4-6]表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)PIN蛋白負責調(diào)節(jié)生長素在胞內(nèi)的平衡及其代謝活動，而質(zhì)膜上PIN的不對稱分布參與了局部生長素濃度梯度的建立和維持，進而調(diào)控植物胚胎發(fā)育、器官發(fā)育、向性運動。

擬南芥中 PIN3主要參與諸多信號響應的細胞間生長素橫向的極性運輸[7]。PIN3介導生長素向重力作用方向的極性運輸導致局部生長素的不對稱分布[8-9]；植物向光性反應也與局部PIN3的不對稱極性分布有關，光信號通過對 PIN3的調(diào)控導致避光側(cè)生長素的累積，表現(xiàn)出向光生長的特點[10]。關于 PIN3的研究在整個植物發(fā)育事件調(diào)控機理的研究中有著重要的地位[11-12]。PIN3蛋白在植物的生長發(fā)育及生長素極性運輸中起著重要作用。本研究中，對十字花科17個已完成基因組測序物種的18個(油菜含有2個)PIN3同源性基因進行系統(tǒng)進化分析，有助于從分子水平了解十字花科植物間 PIN3基因的進化差異，為十字花科植物的生長素極性運輸研究提供理論依據(jù)。

1 工具與方法

1.1 生物信息學工具

1.1.1 所用數(shù)據(jù)庫

從擬南芥 TAIR數(shù)據(jù)庫(http：//www.arabidopsis.org/)獲得AtPIN3基因序列；ExPASy (http：//au.expasy.org/tools/peptident.html/)數(shù)據(jù)庫、PROSITE數(shù)據(jù)庫(http：//prosite.expasy.org/) 、 DOE Joint Genome Institute (http：//jgi.doe.gov/)等用于分析比對。

1.1.2 本地化分析平臺

由 http：//www.megasoftware.net/下載分子進化遺傳分析軟件 MEGA 6.0、多序列比對軟件Clustalw、分子生物學應用軟件DNAMAN、Fasttree等用于后續(xù)序列分析。

1.1.3 在線分析平臺

DNA與蛋白序列分析與格式化處理在線工具包(http：//www.bio-soft.net/sms/)；PROTTER(http：//wlab.ethz.ch/protter/start/)跨膜預測在線軟件；十字花科基因數(shù)據(jù)庫在線比對(http：//brassicadb.org/brad/blastPage.php)。

1.2 序列比對和系統(tǒng)發(fā)育進化樹構(gòu)建

運用Clustal W對從數(shù)據(jù)庫中獲得的17個物種共18個PIN3蛋白進行多重比對；采用本地化分析平臺Mega 6.0軟件以鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。為保證系統(tǒng)樹的質(zhì)量，將Bootstrap值統(tǒng)一設置為1 000[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 十字花科植物PIN3基因的鑒定及序列分析

從擬南芥TAIR數(shù)據(jù)庫中獲得擬南芥PIN3基因序列(AT1G70940)，在數(shù)據(jù)庫 Brassica Database和DOE Joint Genome Institute中進行檢索，并與NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的PIN3序列進行對比，獲得十字花科17個物種共18個PIN3基因序列及相關信息。甘藍型油菜(Brassica napus)中有2個PIN3基因，呈現(xiàn)基因進化的擴展趨勢。這 18個 PIN3基因在cDNA序列上具有較高的一致性，相似性為86.74%，而其序列的細微差異可能正是十字花科各PIN3蛋白的功能和活性區(qū)別的關鍵。

在系統(tǒng)發(fā)育進化關系上，所列 PIN3序列整體上進化方向分為2類：蕓薹屬作物歸為1類；另1類包括薺屬、鼠耳芥屬、鹽芥屬等，此類聚類關系較為復雜，分支較多，其中阿拉伯巖芥(Aethionema arabicum)和 Brassica rapafpsc 單獨成支(圖 1)。

圖1 十字花科PIN3基因序列同源比對構(gòu)建系統(tǒng)進化發(fā)育樹Fig.1 The unrooted neighbor joining phylogenetic tree of PIN3 gene in Brassicaceae specie

2.2 十字花科植物PIN3基因信息比對及跨膜分析

通過 BRAD十字花科基因數(shù)據(jù)庫在線平臺獲得十字花科17個物種共18個PIN3基因內(nèi)含子數(shù)目[14]。從表1可知，琴葉擬南芥(Arabidopsis lyrata)PIN3基因中只有3個內(nèi)含子，這可能與其進化程度較低相關。而與其同源性極高、親緣關系也很近的擬南芥的內(nèi)含子數(shù)目只有5個。薺屬類的Capsella grandiflora、Capsella rubella、Capsella bursa–pastoris內(nèi)含子數(shù)目都為6個，而內(nèi)含子數(shù)目最多(9個)的 Aethionema arabicum在進化方向上差異最大。這可能是在進化過程中進化方向上的距離增大所致[15]。

在Brassica Database和NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取十字花科物種的PIN3氨基酸序列，使用ExPASy數(shù)據(jù)庫、PROSITE數(shù)據(jù)庫和PROTTER在線分析平臺預測相關物種PIN3蛋白的氨基酸數(shù)量、等電點、分子量、磷酸化位點等。由表1可知，PIN3蛋白序列長度為 552～649，蛋白大小為 59 764.0～ 69 998.5，等電點為 7.15～9.44。甘藍型油菜和水蒜芥 PIN3蛋白序列長度明顯偏短，水蒜芥和亞麻薺的等電點偏低，而蕪青的等電點則明顯偏高。PIN3蛋白等電點的變化可能是十字花科不同物種適應不同生活環(huán)境的結(jié)果，同時也可能與蛋白結(jié)構(gòu)和氨基酸組成相關。蕪青PIN3蛋白比對顯示其一段跨膜區(qū)域的氨基酸序列出現(xiàn)較大差異，這可能是蕪青PIN3蛋白等電點高達9.44的原因。等電點的變化可能導致潛在的蛋白功能和活性的變化[16-18]。

通過在線分析軟件PROTTER跨膜預測，對已獲得的17個物種共18個PIN3蛋白進行跨膜結(jié)構(gòu)預測，分析并初步確立相關跨膜結(jié)構(gòu)模型(圖2)。以擬南芥、Brassica rapafpsc、蕪青、水蒜芥為例， PIN3蛋白跨膜初步分為4種模型。不同的聚類物種的跨膜次數(shù)出現(xiàn)差異，這種差異隨著親緣關系的增大愈明顯。有些物種 PIN3蛋白的羧基端出現(xiàn)在胞外，且這些物種的分布趨勢符合 PIN3蛋白系統(tǒng)進化樹中的進化關系，大致以阿拉伯巖芥為界。

表1 十字花科PIN3基因及其編碼蛋白信息Table 1 The information of PIN3 gene in Brassicaceae

圖2 十字花科PIN3蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測Fig.2 Transmembrane structure prediction of PIN3 protein in Brassicaceae

2.3 十字花科PIN3蛋白比對及系統(tǒng)進化分析

PIN3蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進化關系(圖3)與PIN3序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育關系相似。整體上進化方向分為2支：蕓薹屬為1支；其他物種為另1支進化方向。

圖3 十字花科PIN3蛋白同源比對構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The unrooted neighbor joining phylogenetic tree of PIN3 protein in Brassicaceae specie

為了解十字花科PIN3蛋白的差異，對PIN3蛋白氨基酸序列進行多重比對分析(圖4)。PIN3蛋白相似度高達 90.93%，符合 ZAZIMALOVA等[19]建立的PIN蛋白結(jié)構(gòu)模式。對PIN3多次比對分析后發(fā)現(xiàn)，在 80、83、91、128、135、245、288、492、597、603十個位置具有種屬差異性和符合進化關系的氨基酸替換現(xiàn)象，特別是適應極端環(huán)境的鹽芥屬中條葉藍芥(Thellugiella parvula)在更多的位點出現(xiàn)氨基酸的替換。

PIN3蛋白的磷酸化是產(chǎn)生和保持指定PIN3極性的關鍵，其磷酸化位點(T/SX2E/D)分布在親水環(huán)的保守區(qū)域。十字花科的18個PIN3蛋白氨基酸序列在M3磷酸化基序上高度保守，這與已有的PIN3磷酸化研究結(jié)果相符。其他3個推測的磷酸化位點上，所列 PIN3蛋白也表現(xiàn)出了高度保守性。這說明磷酸化可能不是導致 PIN3蛋白功能和活性出現(xiàn)差異的原因。

PIN3蛋白預測的糖基化位點差異較大。糖基化位點(GlcNAc)分散于整個親水環(huán)區(qū)域，在約498位氨基酸處發(fā)現(xiàn)負責內(nèi)吞作用的內(nèi)在化基序NPXXY[20]。在涉及糖基化作用位點的第91位氨基酸可分為異亮氨酸及苯丙氨酸兩大類，在系統(tǒng)樹(圖3)上也表現(xiàn)出以 Aethionema arabicum為界的明顯物種進化差異；在245氨基酸位置，只有Brassica rapafpsc為特異性的谷氨酰胺，其在系統(tǒng)樹中單獨成支，很可能與這一糖基化差異相關。推測十字花科物種的PIN3蛋白糖基化差異與系統(tǒng)樹進化關系聯(lián)系較為緊密，在環(huán)境壓力下，通過對 PIN3功能的逐步微調(diào)，得以適應環(huán)境，擴大物種分布。

圖4 十字花科17 個物種的18 個PIN3蛋白氨基酸序列比對Fig.4 Multiple alignment of the 18 PIN3 proteins from 17 Brassicaceae species

3 結(jié)論與討論

本研究通過對十字花科17個物種的18個PIN3同源性基因(油菜含2個PIN3同源基因)進行分析，依據(jù)蛋白跨膜分析結(jié)果分為4種類型，其跨膜次數(shù)差異隨親緣關系距離的增加愈明顯。其同源性比較結(jié)果表明，18個預測PIN3 cDNA序列的相似性為86.74%，PIN3推導蛋白之間的相似性為90.93%。各 PIN3基因內(nèi)含子數(shù)目跨度較大，Aethionema arabicum在進化方向上單獨成支，其內(nèi)含子數(shù)目(9個)也最高，其他基因內(nèi)含子數(shù)目大多為 5～7個。PIN3蛋白等電點大部分約為8.00，蕪青PIN3蛋白等電點高達9.44，分析后認為與其一部分跨膜區(qū)域的氨基酸序列差異較大有關。PIN3的氨基酸比對分析發(fā)現(xiàn)，在磷酸化位點上 PIN3蛋白表現(xiàn)出高度的保守性，而在多個糖基化位點出現(xiàn)具有種屬差異性和符合進化關系的氨基酸替換現(xiàn)象，可能通過影響PIN3的糖基化過程，導致PIN3蛋白的功能和活性出現(xiàn)差異。

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責任編輯：尹小紅

英文編輯：梁 和

The phylogenetic analysis of PIN3 genes in 17 species of Brassicaceae family

TANG Bin, LI Yujun, ZHAO Yan, HUANG Lihua, HUANG Yu, ZHANG Xuewen*
(College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

In order to explore the evolutionary differences between PIN3 genes in different species of Brassicaceae, the Brassica database and the Brassicaceae gene database were used. In this paper 18 PIN3 genes were identified by sequences blast in the database of 17 sequenced Brassicaceae species (there were two homologous PIN3 in Brassica napus). The phylogenetics of the genes and their predicted proteins (PIN3) were carried out by bioinformatics analysis.The results indicated that the similarity of 18 PIN3 gene sequences in the Brassicaceae species was 86.74%, while the proteins similarity was 90.93%.The PI of PIN3 protein was form 7.15 to 9.44, the PI of Brassica rapa was higher than those of others. The amino acid difference was found in several glycosylation sites of PIN3 protein with species diversity,which conformed to the amino acid substitution phenomenon and may result in difference function and activity of the protein in evolutionary relationships.

Brassicaceae; PIN3 gene; phyletic evolution

Q949.748.3

A

1007-1032(2017)04-0366-06

2017-03-17

2017-06-15

湖南省教育廳高校重點實驗室開放項目(15K060)

湯賓(1991—)，男，湖南岳陽人，碩士研究生，主要從事細胞分子生物學研究，frentwu@gmail.com；*通信作者，張學文，博士，教授，主要從事植物發(fā)育分子生物學研究，xwzhang@hunau.edu.cn