王耀輝，丁煥平，王燏嬋，袁正宏,,

1. 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032； 2. 復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200032； 3.上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

目前，全球約有1.7億人感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)，約占總?cè)丝诘?%[1]，且發(fā)病率越來越高，尤其是在發(fā)展中國家[2]。HCV感染個體后在宿主體內(nèi)長時間保持低水平復(fù)制，與慢性肝炎、肝硬化及肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。目前尚沒有針對HCV的有效疫苗，治療方案主要是Ⅰ型干擾素與利巴韋林聯(lián)合應(yīng)用，但只有一半左右患者對此有反應(yīng)，且多伴有并發(fā)癥[3-5]。因此，對HCV復(fù)制、致病機(jī)制及抗病毒治療策略的研究尤為重要。

非結(jié)構(gòu)蛋白5B(nonstructural protein 5B，NS5B)是RNA依賴的RNA聚合酶[6], 在HCV復(fù)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，長期以來一直被看作潛在的抗病毒靶點(diǎn)[7,8]。近年來，也有不少報(bào)道提示NS5B除作為聚合酶參與復(fù)制外，還通過與宿主蛋白直接相互作用參與調(diào)控病毒的生活周期和致病過程, 但詳細(xì)機(jī)制尚有待進(jìn)一步闡明[9-13]。為進(jìn)一步了解NS5B的功能及其對細(xì)胞的影響，我們利用可誘導(dǎo)的人肝母細(xì)胞瘤(HepG2)穩(wěn)定細(xì)胞株(Tet-On系統(tǒng))，構(gòu)建了可由四環(huán)素誘導(dǎo)的NS5B穩(wěn)定HepG2細(xì)胞株(HepG2 Tet-On NS5B)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

實(shí)驗(yàn)用材料和試劑包括HepG2 Tet-on細(xì)胞(Clontech公司)；MEM、胎牛血清(Gibco公司)，不含四環(huán)素的胎牛血清(Clontech公司)，青霉素(1×105u/L)、鏈霉素(0.1 g/L)、多西環(huán)素(強(qiáng)力霉素)和 G418 (Sigma公司)，潮霉素B(Roche公司)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板(Corning公司)；限制性內(nèi)切酶(NEB公司、MBI公司)；轉(zhuǎn)染試劑FuGENE HD(Roche公司)；抗Flag 抗體和抗actin抗體(鼠源，Sigma公司)，抗NS5B 抗體(兔源，VIROGEN公司)；硝酸纖維素膜(0.22 μm， Schleicher & Schuell BioScience公司)；宿主菌TOP10F’(Invitrogen公司)；質(zhì)粒抽提試劑盒(Qiagen公司、Macherey Nagel公司)。pcDNA3.1/3×Flag NS5B由本室構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染HepG2 Tet-On細(xì)胞培養(yǎng)于MEM培養(yǎng)基(含15%胎牛血清、1×105u/L青霉素、0.1 g/L鏈霉素、100 μg/ml G418、1×非必需氨基酸)中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。

將細(xì)胞鋪于35 mm培養(yǎng)板，約80%融合時更換新鮮培液，2 h后用脂質(zhì)體(FuGENE HD)進(jìn)行轉(zhuǎn)染：將2 μl FuGENE HD加入100 μl不含血清和抗生素的純MEM培養(yǎng)基中，混勻；然后加入1 μg質(zhì)粒，混勻后室溫孵育20 min，將孵育好的混合物均勻加入細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2NS5B質(zhì)粒的構(gòu)建用帶四環(huán)素反應(yīng)元件的 pTRE2hyg 作為載體，載體圖譜如圖1A所示。首先以pcDNA 3.1/3×Flag NS5B質(zhì)粒為模板，將帶有3×Flag標(biāo)簽的全長NS5B經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增后插入pTRE2hyg 載體中(酶切位點(diǎn)：BamH I、NotI)。引物序列為：sense (5′-3′)- TTGGATCCATGG- CATCAATGCAGAAG；antisense (5′-3′)- AAGC- GGCCGCTCATCGGTTGGGGAGCAG。

1.2.3穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選將轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒24 h后的細(xì)胞用胰酶消化，并重新鋪于10 cm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁后更換新鮮培養(yǎng)液，加入潮霉素B至終濃度為200 μg/ml，持續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞出現(xiàn)死亡，即更換含潮霉素B的新鮮培養(yǎng)液。2周后克隆出現(xiàn)，挑取單克隆于48孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿后依次向24孔板、12孔板、6孔板和25 cm2培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移。分出部分細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)、鑒定。

1.2.4免疫熒光檢測將預(yù)處理的玻片放入24孔板，加入混勻的細(xì)胞懸液(0.5 ml)。待細(xì)胞貼壁生長適當(dāng)時加入四環(huán)素誘導(dǎo)，在特定時間收集細(xì)胞。收集細(xì)胞時，用磷酸緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗1次；加入3.5%聚合甲醛置室溫固定15 min，然后吸去固定液；加30 mmol/L甘氨酸終止反應(yīng)5 min，PBS 洗3次，每次5min；加入0.1% Triton X-100置室溫穿透5 min，PBS洗1次；加入3% 牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉1 h以上，然后加BSA稀釋的一抗(抗Flag抗體)，4 ℃孵育過夜，PBS洗3次；加入BSA稀釋的二抗(CY3耦聯(lián)的抗鼠IgG)，室溫孵育1 h以上，PBS洗 3次；用 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染核2 min，最后Mowiol封片，置激光共聚焦顯微鏡(TCS-NT，Leica)下觀察。

A: The vector used in this study and its MCS sequence. B: Identification of NS5B fragments after digestion.

圖1構(gòu)建克隆所用載體及構(gòu)建后酶切鑒定

Fig.1ThevectorusedinthisstudyandtheidentificationofNS5Bfragmentsafterplasmidconstruction

1.2.5蛋白免疫印跡法標(biāo)本經(jīng)10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)后，電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶﹝用含0.05% Tween-20的PBS(PBST)配制﹞封閉1 h以上，分別加抗Flag、抗NS5B、抗actin抗體，置濕盒內(nèi)4 ℃過夜；然后以PBST洗膜3次，每次10 min；加入相應(yīng)辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h以上，以PBST洗膜3次，每次10 min；行增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)檢測(PerkinElmer公司)。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒的鑒定

本研究選用帶四環(huán)素反應(yīng)元件的 pTRE2hyg 作為載體，將構(gòu)建好的pTRE2hyg 3×Flag NS5B經(jīng)酶切(BamH I、NotI)后進(jìn)行瓊脂糖電泳鑒定，在1.8 kb附近可見清晰的條帶(圖1B)。質(zhì)粒擴(kuò)增后經(jīng)測序顯示正確(博尚公司)。

2.2 標(biāo)簽抗體檢測穩(wěn)定細(xì)胞中NS5B的表達(dá)

用FuGENE HD將構(gòu)建好的pTRE2hyg 3×Flag NS5B質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HepG2 Tet-On 細(xì)胞，經(jīng)潮霉素B篩選后建立穩(wěn)定細(xì)胞株，并通過蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞株中NS5B的表達(dá)情況。細(xì)胞經(jīng)不同濃度的多西環(huán)素誘導(dǎo)48 h 后，用標(biāo)簽抗體(抗Flag抗體)檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素濃度為0.01 μg/ml時，可檢測出NS5B蛋白表達(dá)；當(dāng)多西環(huán)素濃度達(dá)到1 μg/ml時，蛋白表達(dá)量最高。而未誘導(dǎo)組沒有蛋白表達(dá)(圖2A)。另外，經(jīng)1 μg/ml多西環(huán)素誘導(dǎo)，在不同時間點(diǎn)收集細(xì)胞后用蛋白免疫印跡法檢測，發(fā)現(xiàn)2 h即可檢測出蛋白表達(dá)。隨著時間推移，蛋白的表達(dá)量增高，24 h達(dá)峰值(圖2B)。

2.3 抗NS5B抗體檢測穩(wěn)定細(xì)胞株中NS5B的表達(dá)

為進(jìn)一步確認(rèn)蛋白表達(dá)的特異性，用抗NS5B抗體做進(jìn)一步檢測，方法同上。蛋白免疫印跡結(jié)果見圖3。與對照組相比，經(jīng)不同濃度多西環(huán)素或不同時間誘導(dǎo)后，抗NS5B 抗體可清晰檢測到內(nèi)源性NS5B蛋白的表達(dá)。

2.4 免疫熒光法檢測NS5B的表達(dá)及胞內(nèi)定位

穩(wěn)定細(xì)胞株經(jīng)多西環(huán)素誘導(dǎo)48 h后，用免疫熒光法檢測NS5B的表達(dá)及其在胞內(nèi)的定位。結(jié)果顯示，多西環(huán)素誘導(dǎo)后可觀察到NS5B的表達(dá)(圖4A，紅色)，主要分布于胞質(zhì)且靠近核周，與以前報(bào)道一致[14]；而未誘導(dǎo)組沒有熒光信號(圖4A)。同時用蛋白免疫印跡法驗(yàn)證NS5B 的表達(dá)(圖4B)。

A: HepG2 Tet-On stable cells expressing NS5B induced by doxycycline (Dox) at different concentrations, and then detected by Western blot with anti-Flag antibody. B: HepG2 Tet-On stable cells expressing NS5B induced by 1 μg/ml Dox and harvested at indicated time points, and then detected by Western blot with anti-Flag antibody.

圖2抗Flag抗體檢測NS5B的表達(dá)

Fig.2TheexpressionofNS5Bdetectedbyanti-Flagantibody

A: HepG2 Tet-On stable cells expressing NS5B induced by 1 μg/ml Dox and harvested at indicated time points, and then detected by Western blot with endogenous anti-NS5B antibody. B: HepG2 Tet-On stable cells expressing NS5B induced by Dox at different concentrations, and then detected by Western blot with endogenous anti-NS5B antibody.

圖3內(nèi)源性抗體檢測NS5B的表達(dá)

Fig.3TheexpressionofNS5Bdetectedbyendogenousanti-NS5Bantibody

A: The expression of NS5B and its subcellular localization detected by immunofluorescence assay (63×). B: The expression of NS5B in A detected by Western blot.

圖4免疫熒光法檢測NS5B的表達(dá)及其細(xì)胞內(nèi)定位

Fig.4TheexpressionofNS5Banditssubcellularlocalizationdetectedbyimmunofluorescenceassay

3 討論

自1989年HCV被鑒定以來[15]，一直受到人們的極大關(guān)注。HCV基因組可編碼結(jié)構(gòu)蛋白(Core、E1、E2) 和非結(jié)構(gòu)蛋白(P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)[16,17]。其中NS5B是RNA依賴的RNA聚合酶，參與病毒RNA的從頭合成。NS5B還通過與諸多宿主蛋白的直接相互作用發(fā)揮其在復(fù)制和致病過程中的功能，如與人囊泡相關(guān)膜蛋白相關(guān)蛋白A(human vesicle-associated membrane protein-associated protein A, hVAP-A)的結(jié)合參與復(fù)制復(fù)合體的形成[10]；與α輔肌動蛋白(α-actinin)相互作用可維持復(fù)制復(fù)合體的數(shù)目，并調(diào)節(jié)復(fù)制效率[11]；而與核仁蛋白(nucleolin)的相互作用，可調(diào)控病毒從復(fù)制到翻譯的轉(zhuǎn)換[12]。 這些相互作用與聚合酶活性和病毒復(fù)制密切相關(guān)。另有報(bào)道稱NS5B可與抑癌基因Rb相互作用，并使其經(jīng)泛素蛋白酶體途徑降解或通過誘生干擾素影響細(xì)胞周期[13,18]；也可與毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變蛋白(ataxia-telangiectasia mutated，ATM)相互作用，參與DNA損傷和基因組穩(wěn)定性的調(diào)控[19]，具體機(jī)制尚不完全清楚。因此，NS5B細(xì)胞株的建立，有助于深入了解NS5B與宿主蛋白的相互作用及參與病毒復(fù)制和致病的各個過程。

為探討目的蛋白在細(xì)胞中的作用，人們采用各種方法將外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，觀察其對細(xì)胞的影響。目前常用的有瞬時轉(zhuǎn)染法，主要包括磷酸鈣法、脂質(zhì)體法及電轉(zhuǎn)染法；但這些方法尚存在穩(wěn)定性差、操作步驟較繁瑣、陽性率低、細(xì)胞毒性高、費(fèi)用較高等缺點(diǎn)。另外，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染也正越來越多被采用。在普通穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建中，對照細(xì)胞株常為不包括目的基因的空載體，即插入基因組的DNA長度不一致，可能會影響結(jié)果且需要另外篩選。本研究在HepG2細(xì)胞中建立了可由四環(huán)素調(diào)控(Tet-On)的NS5B穩(wěn)定細(xì)胞株。Tet-On (rtTA依賴)系統(tǒng)是目前常用的可控性誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)[20]，在四環(huán)素或四環(huán)素衍生物存在的情況下，轉(zhuǎn)錄因子rtTA與反應(yīng)元件結(jié)合，從而使目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯。該細(xì)胞株經(jīng)1次轉(zhuǎn)染，篩選成功后即可用低濃度的抗生素維持，可長期培養(yǎng)，費(fèi)用低、穩(wěn)定性好。需要目的蛋白表達(dá)時，只需在培養(yǎng)液中加入四環(huán)素進(jìn)行誘導(dǎo)，理論上陽性率為100%。在不加四環(huán)素誘導(dǎo)時，可直接作為陰性對照。另外，該系統(tǒng)通過四環(huán)素的存在與否決定目的蛋白的表達(dá)，能盡量減少維持培養(yǎng)時外源蛋白對細(xì)胞本身的影響，且可通過加入四環(huán)素的濃度和時間對蛋白表達(dá)進(jìn)行時間和量的控制。操作簡單、靈活，能適應(yīng)不同條件的研究需要。鑒于Tet-On系統(tǒng)的諸多優(yōu)點(diǎn)，其已被廣泛用于生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域，包括病毒學(xué)研究。Zhang等利用 Tet-On系統(tǒng)在HeLa細(xì)胞中研究柯薩奇病毒感染與蛋白未折疊反應(yīng)和凋亡的關(guān)系[21]；Tang等也在HepG2細(xì)胞中建立了Tet-On HBx 穩(wěn)定細(xì)胞株來研究HBx的功能[22]；另外，該系統(tǒng)也用于人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的很多研究中。

本研究構(gòu)建的HepG2 Tet-On NS5B穩(wěn)定細(xì)胞株在誘導(dǎo)后可被標(biāo)簽抗體和抗NS5B抗體檢測到，免疫熒光法進(jìn)一步證實(shí)了NS5B存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，加入誘導(dǎo)劑后可便捷地對目的蛋白的表達(dá)進(jìn)行時間和量的控制。該穩(wěn)定株在未誘導(dǎo)情況下經(jīng)CCK-8試劑盒檢測，細(xì)胞生長沒有明顯改變。另外，持續(xù)培養(yǎng)40代后的穩(wěn)定株經(jīng)多西環(huán)素誘導(dǎo)仍能用質(zhì)譜鑒定出NS5B表達(dá)，說明其穩(wěn)定性和特異性良好。應(yīng)用該細(xì)胞株可檢測在不同誘導(dǎo)濃度或不同時間點(diǎn)NS5B表達(dá)對細(xì)胞內(nèi)特定蛋白或信號通路的影響及細(xì)胞表型的變化；可通過免疫沉淀法沉淀與NS5B相互作用的蛋白，進(jìn)一步質(zhì)譜鑒定，從而發(fā)現(xiàn)一些新的蛋白；亦可用來驗(yàn)證一些體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以便從細(xì)胞水平深入了解NS5B的功能，進(jìn)一步闡明感染宿主后HCV的復(fù)制和致病機(jī)制。

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