翟露露，劉晶，謝幼華

復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點實驗室，上海 200032

目前全世界有3.5億乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染者[1]，深入研究HBV相關(guān)疾病的致病機制仍然任重而道遠(yuǎn)。HBV屬嗜肝DNA病毒科，其基因組為部分雙鏈環(huán)狀DNA。HBV DNA共有4個開放讀碼框架(open reading frame，ORF)，分別為表達(dá)外膜蛋白的preS/S基因、表達(dá)核心蛋白及e蛋白的C基因、表達(dá)聚合酶的P基因以及表達(dá)X蛋白的X基因[2]。

乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)是HBV表達(dá)的唯一非結(jié)構(gòu)蛋白，大量研究提示其在病毒感染、復(fù)制、致癌等過程中可能發(fā)揮重要作用。HBx全長154個氨基酸，相對分子質(zhì)量約17 000。HBx在肝細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位也存在爭議，在細(xì)胞核或胞質(zhì)中存在HBx均有報道[3-5]。在細(xì)胞內(nèi)，HBx具有廣泛的生物學(xué)功能，可通過與多個細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子如激活蛋白1(activator protein 1，AP-1)、AP-2、核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)、 CCAAT增強子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein，C/EBP)、轉(zhuǎn)錄激活因子(activating transcription factor，ATF)/cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)等相互作用，調(diào)控眾多細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄；另一方面，HBx又可與多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵因子作用，從而影響細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和自吞噬等多種生理過程的正常進(jìn)行[6]。

研究HBx對細(xì)胞凋亡的影響可為探索HBV相關(guān)的肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)致病機制提供更多依據(jù)。但目前不同的實驗室存在不同的研究結(jié)果。有報道稱HBx可通過調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、Fas、P53或轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)等發(fā)揮促凋亡的生物學(xué)功能[7-10]；而另一些實驗室發(fā)現(xiàn)，HBx可通過調(diào)節(jié)線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔(mitochondrial permeability transition pore)等途徑達(dá)到抑制凋亡的作用[11-13]。HBx對細(xì)胞凋亡的不同影響可能由2個原因造成，一是不同研究使用的細(xì)胞模型不同；二是HBx的表達(dá)水平不同。近來Bouchard等報道，HBx可在同一細(xì)胞模型中既促進(jìn)凋亡又抑制凋亡，不同的效應(yīng)與NF-κB活性的不同有關(guān)[14]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)HBx對細(xì)胞凋亡的雙向作用可能與其表達(dá)量有密切關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞株Huh7、人胚腎細(xì)胞株293T均由本實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1質(zhì)粒構(gòu)建pc-Flag-X及pc-Flag-X-GFP由本實驗室提供，其中HBx編碼序列位于Flag標(biāo)簽序列的下游，原始克隆載體均為pcDNA3.1(Invitrogen公司)。表達(dá)紅色熒光蛋白的質(zhì)粒pDsRed2-C1購自Clontech公司。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染Huh7、293T細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、0.03%谷氨酰胺)中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞以1×106個/皿傳代于60 mm培養(yǎng)皿中，12 h后將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)以2 μl脂質(zhì)體∶1 μg質(zhì)粒的比例與質(zhì)?；旌希尤氩缓宓腄MEM培養(yǎng)液中，8 h后換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3AnnexinV-FITC檢測Annexin V-FITC檢測試劑盒購自BD Biosciences公司(BD PharmingenTM)。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗2次；用0.5%胰酶消化，1 ml DMEM培養(yǎng)液吹勻后形成單細(xì)胞懸液。凋亡檢測相關(guān)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書，最后于流式細(xì)胞儀中上樣分析。

1.2.4線粒體和胞質(zhì)分離實驗主要采用線粒體分離試劑盒(購自普利萊基因技術(shù)公司)進(jìn)行線粒體分離。消化細(xì)胞后，加入1.5 ml冰預(yù)冷Mito-Cyto Buffer，用間隙嚴(yán)密的研杵研磨細(xì)胞30次，4 ℃、800g離心5 min，收集上清液，并轉(zhuǎn)移至新的離心管。4 ℃、12 000g離心10 min，上清液含胞質(zhì)成分，線粒體沉淀在管底，用50 μl Mito-Cyto Buffer 重懸線粒體。測定蛋白濃度后加入2×Loading Buffer，煮沸5 min，-20 ℃保存。

1.2.5免疫熒光檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用3.7%聚合甲醛固定10 min，0.5% Triton X-100作用10 min，含1% 牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和Tween-20的PBS(PBST)封閉30 min。用含抗NF-κB抗體(1∶200稀釋)的PBST封閉2 h，PBST洗滌后用標(biāo)記有紅色熒光的二抗(goat anti-rabbit IgG；Invitrogen公司)孵育1 h，PBST洗3次。用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色，封片劑封片，顯微鏡下觀察。4 ℃避光保存。

1.2.6蛋白免疫印跡檢測樣品于十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)梯度膠中電泳分離后，于轉(zhuǎn)膜槽中將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜；在含5%脫脂奶粉的PBST中阻斷1 h，一抗4 ℃結(jié)合過夜或室溫結(jié)合2 h，二抗于室溫結(jié)合1 h。壓片，顯影。其中抗Flag鼠單克隆抗體購自Sigma公司，抗活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase 3)兔多克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司，抗細(xì)胞色素C鼠單克隆抗體購自BD公司，抗NF-κB兔多克隆抗體購自Santa Cruz公司。

2 結(jié)果

2.1 不同轉(zhuǎn)染量的HBx在Huh7細(xì)胞中發(fā)揮的促進(jìn)凋亡或抑制凋亡作用

2.1.1AnnexinV-FITC結(jié)果結(jié)果顯示，在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染較高劑量(>4 μg/60 mm培養(yǎng)皿)的質(zhì)粒DNA時，無論Huh7還是293T細(xì)胞的凋亡數(shù)量都明顯升高，這為研究HBx的表達(dá)量對細(xì)胞凋亡的影響提供了一個可用的系統(tǒng)。

將不同量的HBx表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，同時共轉(zhuǎn)染表達(dá)DsRed的質(zhì)粒，每個轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒總量通過加入克隆載體pcDNA3.1而調(diào)整到相同數(shù)量(8 μg)。流式細(xì)胞儀分析顯示(圖1)，在表達(dá)DsRed的細(xì)胞中，隨著HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量的增加，凋亡細(xì)胞數(shù)量先減少、后增多。在0.25 μg、0.5 μg轉(zhuǎn)染量時，細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例逐漸降低。當(dāng)轉(zhuǎn)染量逐漸增大到1 μg、2 μg、4 μg時，凋亡細(xì)胞比例逐漸上升，甚至超過初始水平。提示轉(zhuǎn)染低劑量HBx表達(dá)質(zhì)?？梢欢ǔ潭纫种萍?xì)胞凋亡，而轉(zhuǎn)染較高劑量反而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

Huh7 cells were transiently transfected with pc-Flag-X and DsRed-C2 at different concentrations. Flow cytometric detections were performed after staining cells with Annexin V-FITC. Apoptosis rate was measured as representing apoptotic cells among cells expressing DsRed.

圖1AnnexinV-FITC檢測驗證HBx對Huh7細(xì)胞凋亡的影響存在劑量依賴效應(yīng)

Fig.1Dose-dependentinfluenceofHBxonHuh7cellapoptosisdetectedbyAnnexinV-FITCstaining

2.1.2半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3降解體檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3是檢測細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)記物，不論是內(nèi)源性還是外源性凋亡都會引起半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 降解激活，所以可通過檢測其降解體(cl-cas3)的水平來跟蹤細(xì)胞凋亡情況。如圖2所示，當(dāng)HBx表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量為0.5 μg時，cl-cas3蛋白水平達(dá)最低，之后隨著HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量的增多，cl-cas3蛋白水平逐漸上升(圖2A)。

A: Caspase 3 cleavage. Huh7 cells were transfected with pc-Flag-X at different concentrations. The cleaved caspase 3 (cl-cas3) levels were detected by Western blot. B: Cytochrome C release. Cytochrome C levels in cytosol were detected by Western blot. Actin and GAPDH were used as loading controls, respectively. One out of two tests is shown in this figure.

圖2蛋白免疫印跡法檢測轉(zhuǎn)染不同劑量HBx質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞中各種凋亡標(biāo)記物

Fig.2DetectionofapoptosismarkersinHuh7cellstransfectedwithHBx-expressingplasmidatdifferentconcentrationsbyWesternblot

2.1.3細(xì)胞色素C自線粒體外漏通常細(xì)胞色素C集中在線粒體，但當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)，線粒體膜的通透性發(fā)生變化，細(xì)胞色素C會從線粒體進(jìn)入胞質(zhì)，因此成為檢測細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)記物。

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后，進(jìn)行線粒體和胞質(zhì)分離，吸取胞質(zhì)，用蛋白免疫印跡法檢測胞質(zhì)中細(xì)胞色素C表達(dá)水平。結(jié)果顯示，隨著HBx轉(zhuǎn)染量增高，胞質(zhì)中細(xì)胞色素C水平先下降、后上升。在0.5 μg轉(zhuǎn)染量時，胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的量降至最低。當(dāng)轉(zhuǎn)染量逐漸增大到1 μg、2 μg、4 μg時，胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的量逐漸增加(圖2B)。

2.2 凋亡誘導(dǎo)劑作用下HBx影響Huh7細(xì)胞凋亡作用的劑量依賴效應(yīng)

進(jìn)一步研究在凋亡誘導(dǎo)劑喜樹堿(campothecin)存在時，轉(zhuǎn)染低劑量HBx表達(dá)質(zhì)粒對細(xì)胞凋亡的抑制作用。喜樹堿是一種重要的抗癌藥物，許多實驗研究表明其可誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡，作用機制主要是與細(xì)胞核內(nèi)的拓?fù)洚悩?gòu)酶I DNA復(fù)合體結(jié)合，導(dǎo)致雙鏈DNA發(fā)生斷裂。

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，24 h后吸去培養(yǎng)液，加入含有1 μmol/L喜樹堿的DMEM培養(yǎng)液(1號培養(yǎng)皿除外)；繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行線粒體和胞質(zhì)分離，檢測胞質(zhì)中細(xì)胞色素C水平。結(jié)果顯示，在喜樹堿作用下，轉(zhuǎn)染低劑量HBx表達(dá)質(zhì)粒時，胞質(zhì)中細(xì)胞色素C水平明顯下降，且促進(jìn)細(xì)胞凋亡的HBx劑量比不加喜樹堿時顯著增高，表現(xiàn)為HBx轉(zhuǎn)染量為4 μg時，細(xì)胞色素C的量才顯著增多(圖3)。

Huh7 cells were transfected with HBx-expressing plasmid at different concentrations. Cells were collected 24 h after treatment with 1 μmol/L campothecin. Cytochrome C levels in cytosol were detected by Western blot. One out of two tests is shown in this figure.

圖3凋亡誘導(dǎo)劑喜樹堿作用下轉(zhuǎn)染不同劑量HBx質(zhì)粒對Huh7細(xì)胞中細(xì)胞色素C含量的影響

Fig.3Dose-dependentinfluenceofHBxoncytochromeClevelincampothecin-treatedHuh7cellstransfectedwithHBx-expressingplasmidatdifferentconcentrations

2.3 不同轉(zhuǎn)染量的HBx對 293T 細(xì)胞凋亡存在類似效應(yīng)

為驗證HBx對細(xì)胞凋亡存在劑量依賴效應(yīng)是否是肝癌細(xì)胞的特有性質(zhì)，我們選擇胚腎細(xì)胞293T，按2.1.1中相同條件進(jìn)行Annexin V-FITC流式檢測，并按2.1.3中相同條件轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后檢測細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C 的含量。結(jié)果顯示，在293T中也存在相似結(jié)果(圖4)。

2.4 不同劑量的HBx 對NF-κB在細(xì)胞內(nèi)分布的可能影響

Bouchard等發(fā)現(xiàn)，HBx對細(xì)胞凋亡存在截然不同的效應(yīng)，這一看似矛盾的結(jié)果與NF-κB的活性有關(guān)。NF-κB只有入核才可抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生，因此我們猜測不同表達(dá)量的HBx對細(xì)胞凋亡影響的不同作用可能與NF-κB的細(xì)胞內(nèi)分布有關(guān)，即HBx的不同表達(dá)水平可能影響NF-κB的入核或出核。將pc-Flag-X-GFP質(zhì)粒梯度轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，以抗NF-κB抗體檢測，用帶有紅色熒光的二抗作標(biāo)記，顯微鏡下觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NF-κB在不同劑量HBx作用下確實發(fā)生了細(xì)胞內(nèi)定位的變化。NF-κB在未表達(dá)HBx-GFP時主要位于胞質(zhì)中，核內(nèi)幾乎沒有。當(dāng)?shù)蛣┝縃Bx-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，NF-κB入核。HBx-GFP的轉(zhuǎn)染量逐漸增高到4 μg時，細(xì)胞核已凝縮成團(tuán)，而NF-κB在細(xì)胞核中分布存在明顯空洞(圖5)。

A: Annexin V-FITC staining. 293T cells were transfected as that in 2.1.1. Apoptosis rate was measured as representing apoptotic cells among cells expressing DsRed. B: Cytochrome C release. 293T cells were transfected as that in 2.1.3. Cytochrome C levels in cytosol were detected by Western blot. One out of two tests is shown in this figure.

圖4不同轉(zhuǎn)染量的HBx對293T細(xì)胞凋亡具有不同的影響

Fig.4Dose-dependentinfluenceofHBxon293Tcellapoptosis

3 討論

很多文獻(xiàn)報道HBx影響肝細(xì)胞凋亡的作用，但結(jié)果不盡相同，甚至相反。近年來，Bouchard等利用大鼠原代肝細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)HBx對大鼠原代肝細(xì)胞的凋亡存在雙向(促進(jìn)和抑制)作用，且這種雙向作用與NF-κB的活性狀態(tài)有關(guān)[14]；但作者并沒有對HBx自身的表達(dá)水平進(jìn)行研究以探尋造成上述現(xiàn)象的原因。本研究發(fā)現(xiàn)，HBx對Huh7和293T細(xì)胞凋亡的雙向作用與HBx在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量相關(guān)。在原代肝細(xì)胞中是否也如此，還有待進(jìn)一步的研究。

事實上，病毒蛋白對細(xì)胞凋亡的雙向作用在其他病毒中也有報道。研究發(fā)現(xiàn)，腺病毒表達(dá)的E1A與E1B蛋白既可促進(jìn)凋亡又可抑制凋亡，乳頭瘤病毒中的E6與E7也存在類似現(xiàn)象。

106Huh7 cells were transfected with pc-Flag-X-GFP plasmid at different concentrations. Forty-eight hours after transfection, NF-κB P65 was detected by anti-NF-κB and confocal microscopy. The nuclei were stained with DAPI.

圖5HBx和NF-κB在Huh7細(xì)胞內(nèi)的定位

Fig.5CellularlocalizationofNF-κBandHBx

由于細(xì)胞凋亡會使細(xì)胞產(chǎn)生一系列變化，包括染色質(zhì)聚集、分塊以至斷裂，形成凋亡小體，線粒體膜通透性改變，內(nèi)容物外漏，細(xì)胞膜外翻等。由于凋亡的發(fā)生是極其復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象，所以不能簡單通過單一的凋亡標(biāo)記物來認(rèn)定細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究選擇了3種細(xì)胞凋亡的檢測方法(Annexin V- FITC檢測、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3降解體檢測和線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C水平檢測)，反復(fù)確定HBx對細(xì)胞凋亡存在雙向作用的現(xiàn)象。并且，在胚腎細(xì)胞株293T細(xì)胞中也得到類似結(jié)果，說明這一現(xiàn)象不具備肝癌細(xì)胞特異性。

肝癌的發(fā)生是一個慢性漸變、積累的過程，其致病因素多樣而復(fù)雜。在眾多誘發(fā)因素中，HBV的持續(xù)感染發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在HBV表達(dá)的所有蛋白中，HBx在影響病毒感染、復(fù)制、致病等過程中發(fā)揮重要作用[6, 15]。有研究顯示，在HBV相關(guān)的慢性肝炎、肝硬化及肝癌患者的肝組織中可檢測到HBx持續(xù)表達(dá)[16-18]，并發(fā)現(xiàn)在HBV相關(guān)HCC患者的血清及肝組織中檢出HBx蛋白的陽性率要遠(yuǎn)高于慢性乙型肝炎患者[19]。遺憾的是，在患者肝組織中對HBx表達(dá)進(jìn)行定量極為困難。其原因：一方面，編碼HBx的0.8 kb mRNA的序列完全與3.5 kb病毒前基因組RNA重疊，無法設(shè)計特異性引物來檢測HBx mRNA水平；另一方面，HBx蛋白極易被宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體降解[20]。目前針對HBx蛋白的抗體仍然存在特異度和靈敏度等方面的不足，導(dǎo)致很難做到定量檢測HBx蛋白水平。因此，對自然感染HBV狀態(tài)下肝細(xì)胞中HBx濃度范圍的檢測，還難以準(zhǔn)確定量。

2001年有文獻(xiàn)報道，HBx在細(xì)胞內(nèi)的分布可能與HBx的表達(dá)水平有關(guān)。當(dāng)HBx極低表達(dá)時，HBx集中在細(xì)胞核內(nèi)；HBx高表達(dá)時，HBx會在胞質(zhì)中檢測到[3,4]。我們在實驗中也發(fā)現(xiàn)同樣現(xiàn)象(圖5)，另外伴隨著HBx定位的變化，NF-κB也發(fā)生細(xì)胞內(nèi)分布的變化。我們推測，HBx可能與NF-κB存在直接或間接的相互作用。在HBx低表達(dá)時，HBx主要集中分布于細(xì)胞核，而NF-κB可與之相互結(jié)合被帶入核中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，進(jìn)而抑制凋亡的發(fā)生；當(dāng)HBx表達(dá)量逐漸上升，部分HBx出核，部分NF-κB也隨之出核，進(jìn)而影響其他信號通路，可能拮抗了核內(nèi)NF-κB抑制凋亡的作用，綜合表現(xiàn)為促進(jìn)凋亡。這一推測還有待深入研究。

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