張彥，姜敘誠，郭曉奎，湯道強

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，上海 200025； 2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，上海 200025； 3. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院, 上海 200127

鉤端螺旋體病(leptospirosis，簡稱鉤體病)是一種由致病性鉤端螺旋體(Leptospira，簡稱鉤體)感染引起的常見的、威脅人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)的全球性人畜共患病[1]。自1955年該病被列入法定乙類傳染病以來，我國許多地區(qū)均有鉤體病報告，尤其是在年降雨量多、年平均氣溫較高的長江流域及其以南省、自治區(qū)，鉤體病發(fā)病率高。

致病性鉤體具有很強的侵襲力，帶菌動物的尿液污染環(huán)境和水源后可通過破損的皮膚或黏膜侵入人體，進(jìn)入血管后隨血流或經(jīng)淋巴管和組織間隙播散并定植在全身多個臟器，導(dǎo)致鉤體病。鉤體病的主要臨床表現(xiàn)較不典型，常有發(fā)熱、肌肉酸痛、乏力和眼結(jié)膜充血等，嚴(yán)重者可出現(xiàn)黃疸和肝、腎、肺等多臟器廣泛出血，引起臟器功能障礙或衰竭而導(dǎo)致死亡。急性重癥鉤體病的病理形態(tài)學(xué)特點主要表現(xiàn)為肝、腎、肺等多臟器和黏膜等組織彌漫性出血和輕度炎性反應(yīng)，發(fā)病機制尚不明確[2]。研究發(fā)現(xiàn)，不同毒力鉤體引起豚鼠體內(nèi)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平不同[3]。據(jù)報道，鉤體糖脂蛋白可誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞釋放炎癥細(xì)胞因子[4,5]，Tajiki等也發(fā)現(xiàn)鉤體病患者血清中有較高水平的炎癥細(xì)胞因子[6]。細(xì)胞因子在鉤體病發(fā)病機制中的作用還不清楚，我們通過3種不同毒力鉤體與誘導(dǎo)后的人單核巨噬細(xì)胞株THP-1相互作用，應(yīng)用實時聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素12(interleukin 12，IL-12)和單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)在基因水平表達(dá)的改變，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測鉤體與細(xì)胞混合液上清液中TNF-α、IFN-γ、IL-12、MCP-1水平變化；同時應(yīng)用實時PCR檢測細(xì)胞表面Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)、TLR4及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)基因表達(dá)的改變，比較3株鉤體在激活巨噬細(xì)胞信號通路中的差異，探討鉤體的致病機制。

1 材料和方法

1.1 材料

問號鉤體賴型Lai株來源于四川省鉤體病患者，由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病研究所提供。Lai株定期感染豚鼠，然后取發(fā)病期豚鼠肝或腎組織在鉤體培養(yǎng)基(EMJH)中置28 ℃需氧培養(yǎng)7～14 d，待鉤體長出，以此保持其毒力。問號鉤體賴型減毒株IPAV株由法國巴斯德研究所Saint-Girons教授和Picardeau博士饋贈。IPAV株是由有毒株Lai株在體外多次傳代毒力喪失形成的減毒株，Zhong等已完成其毒力鑒定及基因組和蛋白質(zhì)組分析[7]。腐生性雙曲鉤體Patoc型Patoc l株由本研究中心保存。3株鉤體均在EMJH培養(yǎng)基中置28 ℃需氧培養(yǎng)至對數(shù)期備用。佛波酯(phorbol myristoyl acetate, PMA)購自Sigma公司，SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit購自大連TaKaRa公司，人細(xì)胞因子ELISA試劑盒購自R&D公司，ABI 7500 Fast為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化將人單核巨噬細(xì)胞株THP-1置含10%胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長接近融合時傳代，2～3代后的細(xì)胞用于實驗。調(diào)整好細(xì)胞濃度后加入終濃度為100 nmol/L的佛波酯, 加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中誘導(dǎo)24～48 h；細(xì)胞貼壁轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞后吸出上清液，再用已滅菌的0.01 mol/L磷酸緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗3次；加入無血清RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化，然后與鉤體相互作用。

1.2.2鉤體與細(xì)胞的相互作用3株鉤體均在EMJH培養(yǎng)基中置28 ℃需氧培養(yǎng)至對數(shù)期，暗視野顯微鏡下計數(shù)并計算鉤體濃度；4 000g離心20 min，用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸鉤體沉淀物；調(diào)整濃度后加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，使細(xì)胞與鉤體的比例為1∶100，作用0、2、12、24、48 h 后收集細(xì)胞與鉤體混合液上清液，-80 ℃保存。

1.2.3引物設(shè)計針對TLR2、TLR4、iNOS和細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-12、MCP-1及β-actin基因設(shè)計實時PCR引物(表1)，并通過PCR和熔解曲線檢測引物的擴(kuò)增效果和特異性。

表1Toll樣受體和各種細(xì)胞因子對應(yīng)的引物

Tab.1Toll-likereceptorsandprimersofcytokines

CytokineSequence of oligonucleotide (5'-3')Size (bp)TLR2TLR4iNOSTNF-αIFN-γIL-12MCP-1β-actinGATGACTCTACCAGATGCCTCCCCAAATGAAGTTATTGCCACCAGCCGGGTAAGGAATGAGCTAGTAAAGGTGCTGGGACACCACAACAATCCCCAGCCTCAAGTCTTATTTCGCAAGTTCCATCTTTCACCCACGACGTGTACGTGGTAGAGTTGGCCTGGATGGTGAGGGTTTTACCCTGCCCCAATCCCTTTATCCCTAAGCCCCCAATTCTCTTTCAATGGGACGCTCTTTGTAGTCCTTCTTCGTTTCCTCTGGGCAGAAGTGGGTTCAGGATTCCTGGGTTGTGGAGTGAGTGTTCAGTGAAGGTGACAGCAGTCGGTTGAAGTGGGGTGGCTTTTAGGAT1441621791808016190157

1.2.4RNA抽提、純化和反轉(zhuǎn)錄將THP-1細(xì)胞沉淀物加入RNA抽提液TRIzol中，振蕩均勻后加入三氯甲烷劇烈振蕩，室溫靜置10 min，4 ℃、10 000g離心20 min。取上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入等體積異丙醇，混勻沉淀，室溫放置10 min，4 ℃、12 000g離心10 min。去上清液，用無水乙醇洗滌沉淀物，離心后保留沉淀物，室溫干燥。待沉淀物干燥后，用不含RNase酶的ddH2O溶解RNA并測定濃度。用不含RNase酶的DNase酶消化RNA抽提中殘留基因組DNA以防污染，并用酚/氯仿抽提消除蛋白酶對后續(xù)實驗的影響。

1.2.5實時PCR檢測取1 μg純化的RNA用PrimeScriptTMRT Kit反轉(zhuǎn)錄為cDNA。取反轉(zhuǎn)錄后的cDNA溶液1 μl，用相對定量法檢測TLR2、TLR4、iNOS、TNF-α、IFN-γ、IL-12、MCP-1及β-actin基因的表達(dá)變化。所用熒光染料為SYBE GreenⅠ，計算方法為Ct值比較法，即2- ΔΔCt法，內(nèi)參基因采用β-actin，用待測細(xì)胞因子與0小時對照組相應(yīng)細(xì)胞因子的比值來間接表示THP-1細(xì)胞與3株鉤體相互作用后上述基因表達(dá)的變化。

1.2.6ELISA檢測將不同時間點的細(xì)胞與鉤體混合上清液4 ℃、4 000g離心20 min，取上清液稀釋1倍后用人細(xì)胞因子ELISA試劑盒雙抗夾心法檢測TNF-α、IFN-γ、IL-12、MCP-1的表達(dá)水平。步驟如下：將已包被相應(yīng)抗人細(xì)胞因子單克隆抗體的ELISA 96孔板平衡至室溫，分別將標(biāo)準(zhǔn)濃度的細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品和細(xì)胞上清液(100 μl/孔)加入相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃孵育90 min，洗板4次，每次3 min。除空白孔外，加入生物素化抗體工作液，37 ℃孵育60 min，洗板4次，每次5 min。除空白孔外，每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液，37 ℃孵育30 min，洗板4次，每次5 min。然后每孔加入顯色劑3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB)100 μl，避光37 ℃孵育15 min后，加入疊氮鈉終止液，混勻后即刻測量A450值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)分析軟件為SAS 6.0, 統(tǒng)計學(xué)分析方法為t檢驗、方差分析，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 THP-1細(xì)胞中TLR2、TLR4、iNOS的表達(dá)改變

鉤體與THP-1細(xì)胞作用后，細(xì)胞中TLR2、TLR4、iNOS基因表達(dá)改變見圖1。結(jié)果顯示，Patoc 1株組THP-1細(xì)胞中TLR2表達(dá)升高，與Lai株和IPAV株組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。3株鉤體組THP-1細(xì)胞中TLR4和iNOS表達(dá)皆升高，但I(xiàn)PAV株組TLR4和iNOS表達(dá)上調(diào)更明顯，與Patoc 1株和Lai株組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

A: TLR2. B: TLR4. C: iNOS.*P<0.05 compared with Lai group,#P<0.05 compared with Patoc 1 group. The data are shown as means±SE of the ratio of cytokine to β-actin.

圖1不同毒力鉤體組THP-1細(xì)胞中TLR2、TLR4、iNOS基因表達(dá)的改變

Fig.1NormalizedrelativequantificationofmRNAexpressionbyreal-timePCRforTLR2,TLR4andiNOS

2.2 THP-1細(xì)胞中TNF-α、 IFN-γ、 IL-12、 MCP-1的表達(dá)改變

應(yīng)用實時 PCR和ELISA分別檢測TNF-α、IFN-γ、IL-12、MCP-1在基因和蛋白水平表達(dá)的改變 (圖2)。 結(jié)果顯示， 3 株鉤體組THP-1細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)和蛋白分泌皆升高，Patoc 1 株和IPAV株組比Lai株組更明顯，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。3株鉤體組THP-1細(xì)胞中MCP-1基因表達(dá)和蛋白分泌增高，雖然在基因水平3株鉤體組MCP-1表達(dá)有一定差異，但在蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

A: mRNA levels of TNF-α. B: Protein levels of TNF-α. C: mRNA levels of MCP-1. D: Protein levels of MCP-1.*P<0.05 compared with Lai group,#P<0.05 compared with Patoc 1 group. The data are shown as means±SE of the ratio of cytokine to β-actin.

圖2不同毒力鉤體組THP-1細(xì)胞中TNF-α、MCP-1表達(dá)的變化

Fig.2DetectionofTNF-αandMCP-1byreal-timePCRandELISA

3 討論

致病性鉤體可通過破損的皮膚或黏膜侵入人體，進(jìn)入血管并隨血流或組織間隙播散至全身。一般細(xì)菌侵入人體后，人體免疫細(xì)胞表面的模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)，如TLR、甘露糖受體、清道夫受體等，通過識別細(xì)菌病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)，其中主要包括脂多糖、磷酸聚糖、脂磷壁酸等，激活免疫細(xì)胞，釋放細(xì)胞因子，直接或間接調(diào)節(jié)機體的天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答[8]。到目前為止，共發(fā)現(xiàn)11種TLR，分布在免疫細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白MyD88等傳遞信號，進(jìn)一步激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路，促使IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等表達(dá)，激活免疫細(xì)胞。其中TLR4主要識別革蘭陰性菌的脂多糖、革蘭陽性菌的脂磷壁酸等；TLR2主要識別革蘭陽性菌的肽聚糖及脂蛋白等。鉤體屬革蘭陰性菌。Yang等發(fā)現(xiàn)鉤體外膜脂蛋白LipL32通過TLR2激活腎小管上皮細(xì)胞NF-κB途徑，進(jìn)而引起其下游基因iNOS、TNF-α、MCP-1表達(dá)增高[9]。Werts等也發(fā)現(xiàn)致病性問號鉤體波摩那型RZ11株脂多糖主要通過TLR2激活THP-1細(xì)胞，釋放炎性介質(zhì)，且致病性鉤體脂多糖引起的細(xì)胞因子表達(dá)水平比非致病性鉤體低。作者認(rèn)為避免TLR4的識別可能是致病性鉤體逃避宿主天然免疫的重要因素[10]。Viriyakosol等發(fā)現(xiàn)，熱滅活鉤體主要通過TLR4激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)TNF-α、IL-6和巨噬細(xì)胞炎性蛋白2(macrophage inflammatory protein 2，MIP-2)，故小鼠體內(nèi)TLR4信號途徑有利于宿主抵抗致病性鉤體的侵入，控制感染[11]。我們應(yīng)用實時PCR檢測致病性鉤體賴型毒力株Lai株、賴型減毒株IPAV株和腐生性鉤體Patoc型Patoc 1株與THP-1細(xì)胞相互作用后對TLR2、TLR4、iNOS表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)Patoc 1株可引起TLR2、TLR4和iNOS基因表達(dá)升高，而Lai株和IPAV株只引起TLR4和iNOS基因表達(dá)升高，且IPAV株引起的TLR4升高水平比Lai株高。未能檢測到Lai株激活TLR2，可能與所用菌株血清型不同有關(guān)。Goris等也認(rèn)為，不同血清型的鉤體脂多糖結(jié)構(gòu)可能有所不同；同時，他們發(fā)現(xiàn)致病性問號鉤體巴達(dá)維亞型Kariadisatu株可通過TLR2、TLR4和TLR5激活人外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)[12]，可見不同血清型以及同一血清型的不同菌株之間，激活巨噬細(xì)胞的通路存在差異。致病性鉤體進(jìn)入體內(nèi)后通過多種受體激活宿主的信號通路，不同信號通路之間相互交叉、相互促進(jìn)或相互抑制，最終以某種信號通路為主導(dǎo)，激活機體的免疫應(yīng)答。

革蘭陰性菌脂多糖可引起小鼠以大量炎癥細(xì)胞因子釋放為特征的全身性炎癥反應(yīng)。鉤體屬革蘭陰性菌，但鉤體脂多糖誘導(dǎo)人PBMC釋放炎癥因子的能力比大腸埃希菌脂多糖誘導(dǎo)能力低[13]。熱滅活鉤體可引起人外周抗凝靜脈血中輔助性T細(xì)胞1型(T helper cell type 1，Th1)中細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-12p40表達(dá)升高[14]。致病性鉤體在引起PBMC釋放Th1細(xì)胞因子的同時，也可引起TCRγδ+T細(xì)胞增殖，并在鉤體病患者血液中檢測到TCRγδ+T細(xì)胞水平升高[15]。TCRγδ+T細(xì)胞可直接識別抗原，殺滅病原體，不受抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)的限制，并分泌Th1和Th2細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。我們應(yīng)用實時PCR和ELISA分別在mRNA水平和蛋白水平檢測鉤體與THP-1細(xì)胞相互作用后THP-1細(xì)胞中TNF-α、IFN-γ、IL-12和MCP-1表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，3株鉤體都能引起THP-1細(xì)胞中TNF-α和MCP-1表達(dá)增加，且Patoc 1株和IPAV株引起的TNF-α表達(dá)水平比Lai株高。由此推測，Patoc 1株和IPAV株引起細(xì)胞因子表達(dá)水平比Lai株高，可能有利于激活宿主的免疫反應(yīng)，清除病原菌，控制感染。Vernel-Pauillac等將致病性鉤體感染豚鼠后，未死亡豚鼠外周血中TNF-α、IL-1α、環(huán)氧合酶2和IL-10表達(dá)水平低于死亡豚鼠[16]。Jongyota等將問號致病性波摩那型鉤體和非致病性雙曲鉤體Patoc 1株與THP-1細(xì)胞相互作用，發(fā)現(xiàn)致病性鉤體誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞中IL-6表達(dá)水平低于非致病性雙曲鉤體[17]。在研究牛結(jié)核分枝桿菌感染中也發(fā)現(xiàn)，病理形態(tài)改變輕微的動物釋放更高水平的IFN-γ、iNOS，從而有利于殺滅細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌，控制感染，降低病理損傷[18]。致病性鉤體與免疫細(xì)胞反應(yīng)時，釋放的細(xì)胞因子表達(dá)水平低，有利于鉤體逃避宿主的免疫反應(yīng)。本實驗中，THP-1細(xì)胞與鉤體作用后，皆未檢測出IFN-γ、IL-12基因表達(dá)和蛋白分泌，可能與所選細(xì)胞的種類及體內(nèi)、外實驗差異有關(guān)。在結(jié)核分枝桿菌Beijing株感染早期，巨噬細(xì)胞被激活，釋放短暫的較高水平TNF-α和iNOS[19]，與體外實驗一致。但體外Beijing株與巨噬細(xì)胞相互作用同時引起IL-12p40和IP-18表達(dá)升高，引起Th1細(xì)胞因子表達(dá)增高，可見在體內(nèi)還有其他細(xì)胞或菌體成分抑制保護(hù)性細(xì)胞免疫，且IL-12作用時間比較短暫[20]。Vernel-Pauillac等在鉤體病金黃地鼠模型中研究細(xì)胞因子表達(dá)的改變，IL-12的表達(dá)也只是一過性升高[21]。

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