何靜，龔燕，張萬菊，徐磊，劉祎，錢方興，揭志軍，俞慧菊，李楊，周志統(tǒng)，胡蕓文

1. 上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心病原體檢測與生物安全部，上海 201508； 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，上海 200040; 3. 上海市長寧區(qū)中心醫(yī)院，上海 200051； 4. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院，上海 200092； 5. 同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院，上海 200120

2009年，2009甲型H1N1流行性感冒(簡稱流感)在全世界暴發(fā)[1]。2010年8月，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)宣布2009甲型H1N1流感進入大流行后階段[2]。為調(diào)查在該特定背景下引起上海地區(qū)急性呼吸道感染(acute respiratory tract infection，ARTI)的病毒病原譜特征，本研究于2009年5月～2010年12月，采集2 044例ARTI患者的2 044份標(biāo)本，進行9種呼吸道病毒的核酸檢測，分析上海地區(qū)引起ARTI的病毒病原譜，并探討2009甲型H1N1流感大流行對其構(gòu)成的影響, 為動態(tài)了解上海地區(qū)病毒性ARTI的流行特征和規(guī)律提供重要依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本采集

收集2009年5月～2010年12月于復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院、上海市長寧區(qū)中心醫(yī)院和同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院因ARTI就診的門診或住院患者2 044例(男1 089例、女955例)，其中急性上呼吸道感染(upper respiratory tract infection，URTI)包括上呼吸道感染、扁桃體炎共1 163例；急性下呼吸道感染(lower respiratory tract infection，LRTI)包括支氣管炎、肺炎共881例。在患者發(fā)病的3 d內(nèi)，采集鼻咽拭子標(biāo)本2 005份、肺泡灌洗液39份，放入MEM轉(zhuǎn)運培養(yǎng)液(含1 mg/ml慶大霉素、1 000 u/ml青霉素、2.5 μg/ml兩性霉素B和2%胎牛血清)中，暫存于4 ℃，在48 h內(nèi)冷鏈運送至實驗室。

1.2 核酸抽提和反轉(zhuǎn)錄

以羅氏公司的High Pure Viral Nucleic Acid Kit試劑盒抽提鼻咽拭子和肺泡灌洗液標(biāo)本中的病毒核酸(DNA/RNA)，抽提物用50 μl洗脫液溶解，立即置-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎肨aKaRa公司的PrimeScript?Reverse Transcriptase Kit進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。體系為20 μl，包括4 μl 5×緩沖液、1 μl隨機引物(300 ng /μl) 、1 μl dNTP (10 mmol/L) 、0.5 μl RNA 酶抑制劑(40 u/μl)、0.5 μl RNA反轉(zhuǎn)錄酶(200 u/μl)、5 μl焦炭酸二乙酯(diethypyrocarbonate DEPC)水和8 μl核酸抽提物。反應(yīng)條件按說明書設(shè)置，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置冰浴待用或-20 ℃保存。

1.3 呼吸道病毒核酸檢測

以套式多重反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測。每個樣本同時進行3個套式多重PCR擴增，產(chǎn)物進行電泳分析，共檢測腺病毒(adenovirus，ADV)、副流感病毒(parainfluenza virus，PIV)、甲型流感病毒(influenza virus A，F(xiàn)luA)、乙型流感病毒(influenza virus B，F(xiàn)luB)、微小核糖核酸病毒(picornavirus)和呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)。套式多重PCR參照澳大利亞維多利亞州立傳染病參比實驗室呼吸道病毒檢測的引物和方法[3]。同時，使用上海之江生物科技有限公司的實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒進行冠狀病毒(coronavirus，CoV)、人偏肺病毒(human metapneumovirus，hMPV)和人博卡病毒(human bocavirus，HBoV)檢測，反應(yīng)條件按說明書設(shè)置。

FluA陽性標(biāo)本再進行季節(jié)性流感病毒H1、H3分型。引物為H1HA-F768：5′-ACTACTGGAC-TCTGCTGGAAC-3′；H1HA-R1094：5′-CAA-TGAAACCGGCAATGGCTCC-3′；H3HA-F671：5′-ATCAGGGAGAGTCACAGTCTC-3′；H3HA-R940：5′-ATGCTTCCATTTGGAGTGATGC-3′。采用大連寶生物工程有限公司的One Step RT-PCR Kit進行一步法RT-PCR檢測。25 μl混合反應(yīng)體系包括2×Buffer 12.5 μl，反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl，HSTaq0.5 μl，上、下游引物各0.5 mmol/L， RNA模板2.5 μl。反應(yīng)參數(shù)：42 ℃反轉(zhuǎn)錄20 min；95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。同時，按照WHO (http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/realtimeptpcr/en/index.html)推薦的2009甲型H1N1流感病毒的引物及檢測方法[4]進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

病毒檢出率比較采用兩兩比較的χ2檢驗，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 呼吸道病毒總檢出率

2 044份標(biāo)本中，656份標(biāo)本經(jīng)呼吸道病毒檢測為陽性，陽性標(biāo)本檢測率為32.09%(656/2 044)，其中52份標(biāo)本同時檢出2種呼吸道病毒。男性病例病毒檢出率為33.52%(365/1 089)，女性病例病毒檢出率為35.92%(343/955)，男、女性別組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.29，P>0.05)。各種呼吸道病毒中FluA檢出數(shù)最多，占13.36%(273/2 044)；其次為微小核糖核酸病毒，占10.23%(209/2 044)。URTI標(biāo)本的病毒檢出率顯著高于LRTI標(biāo)本的病毒檢出率(47.46%vs17.71%，χ2=196.04，P<0.01)。URTI和LRTI標(biāo)本中FluA、微小核糖核酸病毒和FluB的檢出率均位于前3位(表1)。

表12009～2010年上海地區(qū)ARTI患者中呼吸道病毒檢出率

Tab.1DetectionrateofrespiratoryvirusinARTIpatientsinShanghaiareaduring2009-2010

VirusNumber of virus-positive patients (%)URTILRTITotalFluA222(19.09)51(5.79)273 (13.36)FluB79(6.79)20(2.27)99 (4.84)RSV11(0.95)16 (1.84)27 (1.32)ADV31(2.67)9 (1.02)40 (1.96)Picornavirus165 (14.19)44 (4.99)209 (10.23)PIV29(2.49)7 (0.79)36 (1.76)HBoV2(0.17)2 (0.23)4 (0.20)CoV10(0.86)2 (0.23)12 (0.59)hMPV3(0.26)5 (0.57)8 (0.39)Total552(47.46)156 (17.71)708 (34.64)

2.2 各月份病毒檢出率

2009年5月～2010年12月各月份的病毒檢出率分布不均勻(圖1)。2年病毒檢出率的高峰均出現(xiàn)在當(dāng)年的冬、春季。2009年11月病毒檢出率達53.07%(95/179)，2010年11月病毒檢出率達65.59%(61/93)；每年的病毒檢測率低谷都出現(xiàn)在當(dāng)年的5月。值得注意的是，雖然每年的5～9月為理論上的ARTI低發(fā)期，但2009年5～9月病毒檢出率為32.02%(211/659)，2010年5～9月的病毒檢出率為15.38%(60/390)，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=35.38，P<0.01)。

圖1按月份呼吸道病毒檢出率

Fig.1Detectionrateofrespiratoryvirusindifferentmonths

2.3 各年齡段病毒檢出率

2 044份標(biāo)本中，0～4歲、5～14歲、15～49歲、50～64歲及≥65歲組標(biāo)本數(shù)分別為228、240、1 067、248和261份。由圖2可見，隨著年齡的遞增，病毒檢出率呈遞減趨勢。其中0～4歲組和5～14歲組病毒檢出率最高，分別為61.40%和56.25%。表2數(shù)據(jù)顯示，在0～4歲及≥65歲組中微小核糖核酸病毒檢出率位列第1，而5～14歲組、15～49歲組和50～64歲組中FluA檢出率最高。從病毒來看，F(xiàn)luA和FluB在5～14歲組檢出率高于其他各年齡組，而RSV、ADV、微小核糖核酸病毒和PIV在0～4歲組檢出率高于其他各年齡組。

圖2各年齡段呼吸道病毒檢出率

Fig.2Detectionrateofrespiratoryvirusatdifferentages

表22009～2010年上海地區(qū)不同年齡ARTI患者中呼吸道病毒檢出率

Tab.2DetectionrateofrespiratoryvirusinARTIpatientsatdifferentagesinShanghaiduring2009-2010

VirusNumber of patients at different ages (%)0-45-1415-4950-64 ≥65FluA33(14.47)57(23.75)151(14.15)25(10.08)7(2.68)FluB7(3.07)24(10.00)46(4.31)12(4.84)10(3.83)RSV13(5.70)4(1.67)8(0.75)1(0.40)1(0.38)ADV14(6.14)8(3.33)13(1.22)3(1.21)2(0.77)Picornavirus58(25.44)37(15.42)81(7.59)4(1.61)29(11.11)PIV13(5.70)2(0.83)15(1.41)3(1.21)3(1.15)HBoV004(0.37)00CoV02(0.83)4(0.37)4(1.61)2(0.77)hMPV2(0.88)1(0.42)3(0.28)1(0.40)1(0.38)Total140(61.40)135(56.25)325(30.46)53(21.37)55(21.07)

2.4 FluA分型

由圖3可見，2009年6～12月，在FluA陽性標(biāo)本中未檢測到季節(jié)性甲型H1N1流感病毒。2009年10月～2010年1月，所檢出的FluA全部是2009甲型H1N1流感病毒；而2009年6～9月，2009甲型H1N1流感病毒檢出數(shù)占當(dāng)月FluA陽性標(biāo)本的比率依次為90.91%(20/22)、75.00%(15/20)、48.00%(12/25)和56.25%(18/32)，且此期間其余所有FluA陽性標(biāo)本經(jīng)分型均為季節(jié)性甲型H3N2流感病毒。對這2種流感病毒在URTI和LRTI患者中的分布率進行分析，顯示2009年6月～2010年1月2009甲型H1N1流感病毒導(dǎo)致的URTI和LRTI病例數(shù)分別為167例和51例，分布率為76.61%和23.39%，而季節(jié)性甲型H3N2流感病毒導(dǎo)致的URTI 和LRTI病例數(shù)分別為29例和5例，分布率分別為85.29%和14.71%。經(jīng)χ2檢驗，它們導(dǎo)致URTI和LRTI的頻率無顯著性差異(χ2=0.83，P=0.36)(表3)。

圖32009～2010年不同月份FluA分型

Fig.3SubtypeofinfluenzaAindifferentmonthsduring2009-2010

表32009～2010年上海地區(qū)各甲型流感病毒亞型在URTI或LRTI患者中的檢出率

Tab.3DetectionrateofdifferentinfluenzaAvirussubtypesinURTIandLRTIpatientsinShanghaiareaduring2009-2010

MonthH3N2TotalURTILRTI2009 H1N1TotalURTILRTIJun. 200922020164Jul. 200955015132Aug. 20091311212102Sep. 20091411318126Oct. 200900030237Nov. 200900056488Dec. 2009000573720Jan. 20100001082Total (%)3429(85.29)5(14.71)218167(76.61)51(23.39)

2.5 混合感染

在2 044份樣本中，檢出2種呼吸道病毒混合感染52份，檢出率為2.54% (52/2 044)，占陽性檢出樣本的7.93% (52/656)?；旌细腥局?，<15歲的兒童占50% (26/52)，15～49歲占40.38% (21/52)，≥50歲占9.62% (5/52)。其中微小核糖核酸病毒檢出數(shù)最多，為44份，占84.62%(44/52)；最多見的為FluB與微小核糖核酸病毒混合感染，占微小核糖核酸病毒混合感染的34.09%(15/44)。

3 討論

ARTI發(fā)病率高、傳播快、流行廣，嚴重危害人類健康，病毒性病原在ARTI病原體中占有重要的位置[5]。本研究采用的套式多重RT-PCR可在6 h內(nèi)針對6種常見呼吸道病毒核酸進行檢測，同時實時熒光定量RT-PCR保證了在2 h內(nèi)檢測CoV、hMPV和HBoV的病毒核酸。方法學(xué)上的改進大大提高了病毒檢測速度，為ARTI的實驗室快速診斷提供了有力保障。

本研究采集了2009年5月～2010年12月上海地區(qū)2 044份ARTI標(biāo)本，病毒陽性標(biāo)本檢出率為32.09%，與Ren等報道的檢出率相似[5]。性別對總病毒檢出率無明顯影響，與季偉等報道一致[6]。不同季節(jié)呼吸道病毒的檢出率不同，冬、春季高于夏、秋季。但由于2009年5月2009甲型H1N1流感暴發(fā)[1]，2009年夏、秋季的呼吸道病毒活動水平遠遠高于2010年同期。2年中，從URTI和LRTI標(biāo)本檢出的病毒居前3位的均為FluA、微小核糖核酸病毒和FluB。這一結(jié)果表明，2009年6月～2010年12月，F(xiàn)luA是導(dǎo)致上海地區(qū)URTI和LRTI的主要病毒。這與Minosse在2008年報道的微小核糖核酸病毒是導(dǎo)致成人LRTI的主要病毒、沈軍在2007年報道的RSV是引起小兒LRTI主要病毒的研究結(jié)果不一致[7,8]。這一差異可能與2009年的2009甲型H1N1流感大流行且FluA在大流行后仍維持著一定的活動水平有關(guān)[9]。

按年齡來分析，發(fā)現(xiàn)不同年齡組的病毒檢出率有一定差異。0～4歲及5～14歲組病毒檢出率較高，兩組檢出的陽性病例數(shù)占總陽性病例數(shù)的37.80%(248/656)，表明小兒對各種病毒易感，與國內(nèi)、外相關(guān)報道一致[10,11]。這可能與嬰幼兒及兒童缺乏對病毒的免疫力有關(guān)[12]。隨著年齡的增長，嬰幼兒及兒童與不同病原體接觸而獲得相應(yīng)免疫力，病毒感染率呈明顯下降趨勢，提示嬰幼兒及兒童是防治呼吸道病毒感染的重點人群。本研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸病毒在0～4歲及≥65歲組位居9種呼吸道病毒檢出率的第1位，且0～4歲組嬰幼兒呼吸道病毒感染的病原譜特征與上海地區(qū)往年的相關(guān)報道不符[8]。RSV并不居于嬰幼兒呼吸道病毒檢出率的首位，取而代之的是微小核糖核酸病毒，其次為FluA。這一變化可能與2009～2010年的2009甲型H1N1流感大流行有一定關(guān)系，但微小核糖核酸病毒高感染率的原因尚不清楚。眾所周知，微小核糖核酸病毒中的鼻病毒(human rhinovirus，HRV)是引起呼吸道感染最常見的病毒，另外柯薩奇病毒、腸道病毒、?？刹《镜纫部梢餉RTI[13]。國外多個研究小組報道，近年有HRV新型別HRV-C[14]、HRV-D[15]的流行，且認為HRV具有高變異遺傳性[16]。本研究發(fā)現(xiàn)微小核糖核酸病毒的高感染率，提示在對其測序、確認的基礎(chǔ)上，應(yīng)進一步對上海地區(qū)HRV流行株亞型的分布情況進行深入調(diào)查。

2009～2010年的2009甲型H1N1流感疫情暴發(fā)不僅使相應(yīng)月份ARTI的病毒病原譜發(fā)生了變化，而且導(dǎo)致FluA的亞型分布發(fā)生了顯著改變。本研究結(jié)果顯示，在上海地區(qū)2009甲型H1N1流感流行初期，2009甲型H1N1流感病毒與季節(jié)性甲型H3N2流感病毒共流行；但在2009甲型H1N1流感的兩次疫情期間，2009甲型H1N1流感病毒取代了季節(jié)性流感病毒，成為絕對優(yōu)勢亞型株[17]。同時，本研究發(fā)現(xiàn)2009甲型H1N1流感病毒與季節(jié)性甲型H3N2流感病毒導(dǎo)致URTI和LRTI的頻率無顯著性差異，均以URTI為主，提示它們在致病特征方面有相似性。

本研究中發(fā)現(xiàn)了52份呼吸道病毒混合感染，有44例為微小核糖核酸病毒分別與FluA、FluB、RSV、ADV、PIV和hMPV病毒發(fā)生混合感染，且以FluB與微小核糖核酸病毒的混合感染最多見。微小核糖核酸病毒在呼吸道病毒混合感染中的高檢出率[18]，提示需要對其進一步分型并探討與其他呼吸道病毒混合感染的臨床意義和相關(guān)發(fā)病機制。

總之，本研究一年半的監(jiān)測結(jié)果不僅為研究2009甲型H1N1流感暴發(fā)背景下上海地區(qū)ARTI的病毒病原譜特征提供了有意義的數(shù)據(jù)，而且為呼吸道感染的臨床診斷、防止抗生素濫用等提供了實驗室依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，病毒分子流行病學(xué)和免疫學(xué)研究工作將進一步深入開展。

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