陳紅苗，許 鵬，吳中強(qiáng)，井維鑫，王 蘭

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006）

NAC對河南華溪蟹卵巢鎘氧化損傷的緩解作用

陳紅苗，許 鵬，吳中強(qiáng)，井維鑫，王 蘭*

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006）

采用慢性鎘暴露同時(shí)加入不同濃度N-乙酰半胱氨酸（NAC）的方法，以河南華溪蟹卵巢組織鎘含量，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性，脂質(zhì)過氧化水平（MDA含量）和卵巢組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化為指標(biāo)，探究了NAC對河南華溪蟹（Sinopotamon henanense）卵巢鎘氧化損傷的緩解作用。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對照組、鎘（0.725 mg·L-1）單一作用組、鎘（0.725 mg·L-1）和NAC（0.1、0.2、0.4 g·L-1）聯(lián)合作用組，結(jié)果顯示：鎘單一作用下，卵巢組織鎘含量和MDA含量顯著高于對照組；SOD、CAT和GPx活性在不同時(shí)間點(diǎn)顯著升高；組織顯微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度損傷。NAC和鎘聯(lián)合作用下，卵巢組織鎘含量在14 d和28 d顯著降低；SOD活性于14 d顯著降低；CAT、GPx活性和MDA含量均在28 d降低，并逐漸恢復(fù)到正常水平；隨著時(shí)間的延長和NAC濃度的增加，卵巢組織細(xì)胞損傷程度出現(xiàn)改善，核膜逐漸完整，僅有少量染色質(zhì)凝集，細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞核內(nèi)空泡化現(xiàn)象基本消失，卵巢組織結(jié)構(gòu)趨于正?；?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NAC對鎘誘導(dǎo)的河南華溪蟹的生殖毒性具有緩解作用，同時(shí)進(jìn)一步證實(shí)了氧化損傷是鎘生殖毒性的重要機(jī)制之一。

河南華溪蟹；卵巢；N-乙酰半胱氨酸（NAC）；氧化損傷；鎘

重金屬污染已成為全球面臨的主要問題之一，其中鎘作為典型的重金屬污染物廣泛存在于水體環(huán)境中[1-2]，對水生生物的毒害作用引起了廣泛關(guān)注[3-4]。有研究顯示，鎘對雌性生殖系統(tǒng)具有明顯的毒理效應(yīng)，可直接作用于卵巢引起卵巢皮質(zhì)區(qū)變薄，卵母細(xì)胞損害或缺失，生長及成熟卵泡減少或空泡化，甚至產(chǎn)生降低排卵和受精能力等生殖功能障礙[5-6]。

甲殼動(dòng)物具有富集污染物的特點(diǎn)[7-8]，其中河南華溪蟹（Sinopotamon henanense）是我國特有的淡水蟹種，易采易養(yǎng)，營底棲生活，體內(nèi)更易富集底棲環(huán)境中的重金屬等污染物[9-12]。本研究擬在建立鎘誘導(dǎo)河南華溪蟹卵巢氧化損傷模型的基礎(chǔ)上，選用一種相關(guān)的保護(hù)劑探究對生殖毒性的緩解作用。課題組前期就鎘對河南華溪蟹卵巢抗氧化系統(tǒng)的影響研究顯示，0.725 mg·L-1鎘溶液處理28 d對河南華溪蟹卵巢損傷較大[13]。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是機(jī)體合成還原型谷胱甘肽（GSH）的原料，具有還原性巰基（-SH），可通過抑制和清除一些活性氧和自由基直接對抗過氧化性損傷，增加機(jī)體抗氧化能力，保護(hù)細(xì)胞[14]，是一種廣泛應(yīng)用于臨床和實(shí)驗(yàn)的抗氧化劑。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)將NAC和鎘同時(shí)作用于河南華溪蟹，研究了卵巢組織中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPx）活性，丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量以及卵巢組織細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的變化，旨在為水生動(dòng)物重金屬污染防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2015年9 月于太原市五龍口海鮮市場購買河南華溪蟹（以下簡稱“溪蟹”），在實(shí)驗(yàn)室水族缸（130 cm×50 cm×60 cm）中用曝氣48 h以上自來水暫養(yǎng)兩周以上。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

氯化鎘（CdCl2·5H2O，分析純，天津市博迪化工有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)鎘溶液（1000 mg·L-1，國家環(huán)境保護(hù)總局標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所）；硝酸、高氯酸（優(yōu)級純）；NAC（純度99%，北京索萊寶科技有限公司）；蘇木素、伊紅（Amersco公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、丙二醛（MDA）和蛋白含量測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)課題組前期工作[13]以及馮玉杰等[15]方法，設(shè)置清水組（作為陰性對照組）、0.725 mg·L-1Cd2+單一作用組（作為NAC緩解鎘毒性效應(yīng)的陽性對照組）以及Cd2+（0.725 mg·L-1）與不同濃度的NAC（0.1、0.2、0.4 g·L-1）聯(lián)合作用組共五組。隨機(jī)選取大小基本一致，體重（20.7±1.5）g的性成熟雌蟹置于處理缸，每組30只，加入曝氣48 h的自來水，各處理組加入相應(yīng)的鎘溶液及NAC。染毒期間兩天換一次水并喂食，每天定時(shí)檢查溪蟹的健康狀況并除去死蟹及殘肢。

1.2.2 樣品制備

在暴露7、14、28 d時(shí)從各組隨機(jī)選取5只進(jìn)行活體解剖，快速取出卵巢組織，部分組織用于組織切片，剩余組織迅速稱量后液氮冷凍，-80℃冰箱保存。

卵巢組織經(jīng)硝酸和高氯酸置于電熱板上完全消化，定容后采用原子吸收光譜儀測定[16]。按組織質(zhì)量∶體積1∶4加入磷酸緩沖液（PBS，pH=7.4），勻漿，4℃、2500 r·min-1離心10 min，取上清液。按照試劑盒說明書測定SOD、CAT、GPx活性，MDA和蛋白含量。取出的卵巢組織放入10%的甲醛溶液固定24 h，經(jīng)酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋切片后進(jìn)行HE染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 15.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。*表示與對照組相比，鎘單一處理組存在顯著性差異（P＜0.05）；#表示與鎘單一處理組相比，加NAC處理組存在顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 NAC對鎘在溪蟹卵巢組織中積累量的影響

如圖1所示，在鎘單一作用下，隨著時(shí)間的延長，卵巢中鎘的積累量逐漸增加，14 d和28 d出現(xiàn)顯著性差異。與鎘單一處理組相比，鎘和NAC聯(lián)合作用組卵巢中鎘的積累量呈現(xiàn)下降趨勢，并在7 d 0.725 mg· L-1Cd2++0.4 g·L-1NAC處理組，14 d 0.725 mg·L-1Cd2++（0.1、0.4）g·L-1NAC處理組，28 d 0.725 mg·L-1Cd2++（0.2、0.4）g·L-1NAC處理組顯著下降。

2.2 鎘及NAC對溪蟹卵巢組織抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化水平的影響

2.2.1 對溪蟹卵巢組織SOD的影響

由圖2a可知，與對照組相比，鎘單一作用下，隨著染毒時(shí)間的延長卵巢SOD活力呈現(xiàn)先升后降的趨勢，14 d SOD的活力顯著升高；與鎘單一作用相比，鎘和NAC聯(lián)合作用，14 d時(shí)隨著NAC濃度的增加SOD活性呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，且0.725 mg·L-1Cd2++（0.2、 0.4）g·L-1NAC組顯著性降低。

圖1 NAC對鎘在溪蟹卵巢組織中積累量的影響（n=5）Figure 1 Effect of NAC on the accumulation of cadmium in ovarian tissue of S.henanense（n=5）

2.2.2 對溪蟹卵巢組織CAT的影響

圖2b顯示，鎘單一作用下，卵巢CAT的活力隨時(shí)間延長呈現(xiàn)升高趨勢，28 d顯著性升高；與鎘單一作用相比，鎘和NAC聯(lián)合作用下，隨著時(shí)間的延長，同一NAC濃度組CAT活力呈現(xiàn)先升后降的趨勢。其中28 d CAT活力顯著下降，且接近對照組。

圖2 鎘及NAC對溪蟹卵巢組織抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化水平的影響（n=5）Figure 2 Effects of Cd2+and NAC on antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation level in ovary tissue of S.henanense（n=5）

2.2.3 對溪蟹卵巢組織GPx的影響

由圖2c觀察到，與對照組相比，鎘單一作用下，28 d時(shí)GPx的活性顯著升高；與鎘單一作用相比，14 d時(shí)隨著NAC濃度增加，GPx呈現(xiàn)梯度下降的趨勢，28 d時(shí)各NAC組均有所下降，其中0.725 mg·L-1Cd2++（0.2、0.4）g·L-1NAC組GPx活力顯著下降。

2.2.4 對溪蟹卵巢組織MDA含量的影響

由圖2d可知，與對照組相比，鎘單一作用下，卵巢MDA含量隨著時(shí)間的延長逐漸升高，其中，14 d和28 d時(shí)MDA含量顯著升高；與鎘單一作用相比，NAC處理組卵巢組織MDA含量隨著處理時(shí)間的延長呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，14 d 0.2 g·L-1NAC組和28 d各NAC組的MDA含量顯著下降。

2.3 鎘及NAC對溪蟹卵巢組織顯微結(jié)構(gòu)的影響

由圖3對照組可知，正常溪蟹卵細(xì)胞為卵圓形，細(xì)胞內(nèi)大量被染成粉紅色和紅色的顆粒是卵黃顆粒，中心細(xì)胞核染色較淺，核膜完整，形狀規(guī)則，內(nèi)含核仁和染色質(zhì)；細(xì)胞外有一層排列緊密的濾泡細(xì)胞，細(xì)胞核較大且染色較深，呈深紫色。鎘單一作用下，隨著處理時(shí)間的延長，卵巢出現(xiàn)了不同程度的損傷，鎘處理組卵細(xì)胞核發(fā)生染色質(zhì)不規(guī)則凝集和固縮（圖a1、圖b1），部分核膜消失，結(jié)構(gòu)不明顯（圖a1箭頭所示），細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡化（圖a1、圖b1、圖c1白色球形結(jié)構(gòu)），細(xì)胞核出現(xiàn)空泡化腫脹，形狀異常（圖c1細(xì)胞核所示）。NAC處理組，隨著NAC濃度的增加和處理時(shí)間的延長，14 d和28 d時(shí)卵巢細(xì)胞的損傷得到有效緩解，結(jié)構(gòu)趨于正常化，細(xì)胞核膜逐漸完整（圖b3、圖c3），僅有少量染色質(zhì)凝集（圖b2、圖b3、圖c2、圖c3），細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞核內(nèi)空泡化現(xiàn)象基本消失（圖b4、圖c4）。

3 討論

鎘單一脅迫條件下，溪蟹卵巢組織中鎘的富集量隨著染毒時(shí)間的延長逐漸增加，與相關(guān)報(bào)道一致[17-18]，說明鎘在溪蟹卵巢組織中的富集量可以作為檢測水環(huán)境中鎘污染程度的有效指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，NAC處理組卵巢中鎘的積累量相比鎘單一處理組有所降低，28 d效果最顯著，說明NAC能夠有效降低鎘在溪蟹卵巢中鎘的積累量，保護(hù)機(jī)體免受鎘的損傷。NAC富含巰基，與鎘具有高度的親和力[19]，可以直接螯合游離的鎘離子，同時(shí)還是體內(nèi)GSH的前體物質(zhì)，能提高GSH在細(xì)胞內(nèi)的水平，而GSH也能與鎘離子結(jié)合，推測NAC可能通過發(fā)揮這兩個(gè)方面的功能抑制鎘在溪蟹卵巢組織中的積累，從而削弱鎘的毒性作用[20]。

圖3 鎘及NAC對溪蟹卵巢組織顯微結(jié)構(gòu)的影響Figure 3 Effects of Cd2+and NAC on the microstructure in ovary tissue in S.henanense

一系列研究結(jié)果顯示，氧化損傷是鎘毒性作用的主要機(jī)制之一，其具體內(nèi)容包括抗氧化酶活性的改變等[21-23]。SOD、CAT和GPx是生物體內(nèi)主要的抗氧化酶，能夠把對機(jī)體有害的活性氧自由基（ROS）轉(zhuǎn)化成無害的H2O和O2，使機(jī)體免受氧化損傷[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫后SOD、CAT和GPx活性顯著升高，并且它們在不同的時(shí)間點(diǎn)被誘導(dǎo)，可能與它們對活性氧的不同生理功能有關(guān)。鎘造成機(jī)體氧化損傷，產(chǎn)生自由基和超氧陰離子，SOD把高反應(yīng)性和具潛在毒性的超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2，當(dāng)H2O2積累到一定濃度時(shí)，CAT和GPx把H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2[25]，因而SOD活性先于CAT和GPx升高。這與馬京津等研究鉛對溪蟹卵巢抗氧化酶活力的結(jié)果一致[26]，且與我們的前期研究結(jié)果[13]相吻合。

與抗氧化酶SOD、CAT和GPx功能類似，NAC含巰基，可直接抗過氧化，清除體內(nèi)的活性氧自由基[27]。目前已有研究顯示，NAC對鎘所致的動(dòng)物組織器官或細(xì)胞氧化損傷具有一定的緩解作用[28]。本研究顯示，NAC處理組與鎘處理組相比，SOD、CAT和GPx活性均隨著濃度的升高和時(shí)間的延長而逐漸降低并接近對照組的水平?？赡芤?yàn)镹AC與抗氧化酶共同作用清除機(jī)體內(nèi)活性氧，減少了機(jī)體抗氧化酶的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而使SOD、CAT、GPx活性在各不同時(shí)間段得到顯著降低，逐漸恢復(fù)到正常水平。

鎘誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的ROS會(huì)引發(fā)機(jī)體脂質(zhì)過氧化，MDA作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，可導(dǎo)致細(xì)胞膜變性，功能缺失，還可引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性，其含量可以指示機(jī)體氧化損傷的程度[29]。鎘單一作用下，隨著時(shí)間的延長，溪蟹卵巢MDA含量相比對照組顯著升高，說明卵巢產(chǎn)生了嚴(yán)重脂質(zhì)過氧化損傷。鎘與NAC聯(lián)合作用下，處理28 d時(shí)卵巢MDA含量顯著下降，說明NAC處理有效緩解了鎘致溪蟹卵巢產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化損傷。NAC可以通過螯合機(jī)體中的鎘而減少鎘在組織內(nèi)的積累，同時(shí)NAC還可作為抗氧化劑清除鎘誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS，緩解脂質(zhì)過氧化，降低MDA的含量，從而保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷。

鎘對動(dòng)物生殖系統(tǒng)的毒性作用很大，鎘致細(xì)胞產(chǎn)生的自由基積累會(huì)抑制卵巢的發(fā)育，對膜系統(tǒng)及細(xì)胞的正常形態(tài)產(chǎn)生影響[30]。NAC不僅能夠干擾自由基生成，還可以清除已經(jīng)生成的自由基[19]，緩解鎘對機(jī)體造成的氧化損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，鎘單一處理組卵巢組織細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)出現(xiàn)不規(guī)則固縮邊集化、部分核膜結(jié)構(gòu)不明顯甚至消失，細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量空泡化現(xiàn)象。NAC作用組，隨著處理時(shí)間的延長和NAC濃度的增加，卵巢的損傷得到有效的緩解，細(xì)胞核膜逐漸完整，僅有少量染色質(zhì)凝集，細(xì)胞及核內(nèi)空泡化現(xiàn)象基本消失，結(jié)構(gòu)趨于正?；f明NAC對鎘引起的溪蟹卵巢組織細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)損傷的緩解作用效果顯著。

4 結(jié)論

NAC可以有效緩解鎘對溪蟹卵巢造成的氧化損傷，證明了氧化損傷是鎘毒性作用的主要機(jī)制之一，同時(shí)也說明NAC能夠保護(hù)水生動(dòng)物，降低鎘污染對其造成的危害。

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Alleviation of cadmium-induced oxidative stress in Sinopotamon henanense ovarian tissue by N-acetylcysteine

CHEN Hong-miao,XU Peng,WU Zhong-qiang,JING Wei-xin,WANG Lan*
（School of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China）

The aim of this study was to investigate the effects of N-acetylcysteine（NAC）on alleviation of cadmium-induced oxidative stress in Sinopotamon henanense ovarian tissue using the following six indicators：the tissue accumulation of Cd;the activities of antioxidant enzymes superoxide dismutase（SOD）,catalase（CAT）,and glutathione peroxidase（GPx）;the content of malonyldialdehyde（MDA）;and the changes in the microstructure of ovarian tissue.The experiment included three groups：the control group,the Cd2+（0.725 mg·L-1）group,and the group of Cd2+（0.725 mg·L-1）combined with NAC at three different levels of concentration（0.1,0.2,or 0.4 g·L-1）.The results showed that under the action of cadmium alone,with increasing Cd2+concentration the accumulation of Cd and the content of MDA significantly increased as compared to that in the control group.The activities of SOD,CAT,and GPx increased at different time-points.The microstructure of ovarian tissue was damaged at different levels.For the group of Cd2+combined with NAC at three different levels of concentration,the content of Cd in ovarian tissue decreased significantly on the 14th and the 28th days.The activity of SOD decreased significantly onthe 14th day.The activities of CAT,GPx,and the content of MDA had a significant decrease on the 28th day,and returned to normal levels gradually.With the extension of time and the increase in NAC concentration,the damage to ovarian tissues was alleviated.That is,nuclear membranes were gradually repaired,and there was only a small quantity of chromatin agglutinate.The vacuolation in cells and nuclei almost disappeared,with the structure of ovarian cells returning to normal conditions.The results indicated that NAC could alleviate the cadmiuminduced reproductive toxicity in Sinopotamon henanense.The results of our study support the argument that oxidative stress is one of the important underlying mechanisms of reproductive toxicity of cadmium.

Sinopotamon henanense;ovary;N-acetylcysteine（NAC）;oxidative damage;cadmium

X171.5

A

1672-2043（2017）06-1087-06

10.11654/jaes.2016-1545

2016-12-02

陳紅苗（1991—），女，山西晉中人，碩士研究生，從事動(dòng)物生殖毒理學(xué)研究。E-mail：1627182584@qq.com

*通信作者：王 蘭 E-mail：lanwang@sxu.edu.cn

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31672293）；高等學(xué)校博導(dǎo)類基金項(xiàng)目（20111401110010）；山西省特色學(xué)科重點(diǎn)項(xiàng)目（2011-SXDX-SWX-003）；山西省高等學(xué)校科技創(chuàng)新項(xiàng)目（113548901027）

Project supported：The National Natural Science Foundation of China（31672293）；The Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education（20111401110010）；The Special Subject and Key Project of Shanxi Province（2011－SXDX－SWX－003）；The University Technological Innovation Project of Shanxi Province（113548901027）

陳紅苗，許 鵬，吳中強(qiáng)，等.NAC對河南華溪蟹卵巢鎘氧化損傷的緩解作用[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2017,36（6）：1087-1092.

CHEN Hong-miao,XU Peng,WU Zhong-qiang,et al.Alleviation of cadmium-induced oxidative stress in Sinopotamon henanense ovarian tissue by N-acetylcysteine[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（6）:1087-1092.