陳方旭 劉海艷(通訊作者) 劉建偉

121001錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院

CTNNB1基因沉默后卵巢癌細胞生長的研究

陳方旭 劉海艷(通訊作者) 劉建偉

121001錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院

目的：探討CTNNB1沉默對卵巢癌細胞增殖的作用。方法：用人類卵巢癌SKOV3細胞于體外培養(yǎng)，隨機分為空白對照組、陰性對照組和CTN實驗組，然后轉(zhuǎn)染入靶向CTNNB1的shRNA載體質(zhì)粒。通過Westernblot及MMT的方法檢測CTNNB1的蛋白表達及細胞的活力。結(jié)果：以CTNNB1為靶向的shRNA能下調(diào)CTNNB1蛋白質(zhì)在細胞中的表達(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染CTNNB1的shRNA后，CTN組的細胞生長活性與增殖受到了明顯的抑制(P＜0.05)。結(jié)論：CTNNB1基因的表達下調(diào)可抑制卵巢癌SKOV3細胞的增殖。

卵巢癌；CTNNB1；ShRNA

卵巢癌在婦科腫瘤中發(fā)病率占第3位，但其死亡率位居首位，70%以上的患者首次發(fā)現(xiàn)時已屬晚期，預后不良[1]。近年來研究表明，Wnt/β-catenin信號通路的變異可能與腫瘤的發(fā)生有關，并且可誘導腫瘤免疫耐受[2]。CTNNB1是β-catenin的編碼基因，前期研究提示CTNNB1蛋白在卵巢癌組織中異常高表達，并且可能與淋巴轉(zhuǎn)移相關[3]。本研究旨在進一步探討CTNNB1在卵巢癌細胞增殖中的作用。

資料與方法

實驗材料：①ShRNA的設計和質(zhì)粒構(gòu)建：CTNNB1siRNA序列：正義鏈5'-AACAGTCTTACCTGGACTCTG-3'，以人和小鼠的基因無同源性的序列作為陰性對照，并整合到含有RNA聚合酶IIIU6增強子的質(zhì)粒。將含靶向CTNNB1序列的質(zhì)粒命名為p-CTN，對照組的質(zhì)粒則為p-NEG。②細胞及培養(yǎng)：人卵巢上皮漿液性癌細胞系SKOV3置于完全培養(yǎng)基(RPMI1640培養(yǎng)基加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)，于37℃、飽和濕度、5%CO2細胞培養(yǎng)箱無菌培養(yǎng)。觀察細胞生長狀態(tài)，每2～3 d傳1代。選取對數(shù)生長期細胞。③主要試劑：LipofectamineTM2000；cDNA合成試劑盒，CTNNB1抗體，化學發(fā)光試劑盒ECLTestKit，甲基噻唑基四唑MMT，酶聯(lián)免疫吸附檢測儀，PI，流式細胞儀。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：利用Lipofectamine TM2000轉(zhuǎn)染shRNA質(zhì)粒。選取對數(shù)生長細胞隨機分3組：空白對照組、陰性對照組和CTN實驗組。陰性對照組轉(zhuǎn)染p-NEG質(zhì)粒；CTN組轉(zhuǎn)染p-CTN質(zhì)粒；于轉(zhuǎn)染24 h時，更換培養(yǎng)基為正常培養(yǎng)基(含10%FBS和抗生素的)，培養(yǎng)72 h。

蛋白質(zhì)印記法：轉(zhuǎn)染48 h后獲取細胞。超聲裂碎細胞，測定每次裂解的蛋白質(zhì)產(chǎn)物濃度(考馬斯亮藍G-250染色法)。加入緩沖液，煮沸3 min后做電泳。電泳前，以1∶1的比例混合蛋白質(zhì)樣品與2×加樣緩沖液。將印跡轉(zhuǎn)移至硝化纖維膜，先用CTNNB1抗體孵育，然后采用二抗孵育。以β-catenin作為內(nèi)參，檢測蛋白表達量(化學發(fā)光試劑盒)。

MTT：轉(zhuǎn)染后的細胞以1×104/mL接種96孔板，貼壁生長24 h。采用濃度5 mg/mL PBS溶解甲基噻唑基四唑MTT，然后進行過濾。向每孔中加入儲存液10 μL。于37℃孵育4 h，然后加MTT，用100 μL DMSO替換培養(yǎng)基，室溫靜置30 min。采用酶聯(lián)免疫吸附檢測儀(570 nm)檢測結(jié)果。分別在轉(zhuǎn)染后12 h、24 h、48 h、72 h時測定每組結(jié)果。細胞存活率=A1/A2×100%(A1為實驗組吸收率，A2為空白對照組吸收率)?？v坐標為細胞存活率，橫坐標為時間，繪制生長曲線。

統(tǒng)計學方法：采用SPSS 18統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，定量資料的描述采用(±s)表示，組間比較采用t檢驗，檢驗水準為α=0.05。

結(jié) 果

靶向CTNNB1 shRNA抑制目的基因的蛋白表達：通過Westernblot方法檢測發(fā)現(xiàn)，β-catenin蛋白表達分別為：空白對照組(0.87±0.01)、陰性對照組(0.85±0.02)、CTN實驗組(0.53±0.02)。統(tǒng)計結(jié)果顯示：CTN實驗組卵巢癌細胞株的CTNNB1蛋白表達下調(diào)率約為36.86%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖1。

轉(zhuǎn)染靶向CTNNB1 shRNA后卵巢癌細胞增殖被抑制：在MTT實驗中發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染靶向CTNNB1 shRNA后，明顯抑制了細胞的增殖。轉(zhuǎn)染24 h后，陰性對照與空白對照組的細胞存活率分別為96.3%和95.4%，顯著高于CTN組(63.5%)。于轉(zhuǎn)染72 h時檢測CTN組的細胞存活率47.7%，而陰性對照與空白對照組分別為87.2%和86.1%。于轉(zhuǎn)染后的24 h、72 h時CTN組的細胞生長活性與增殖均顯著低于空白對照組(P＜0.05)。

討 論

腫瘤的發(fā)生及進展的過程極其復雜，目前研究表明wnt/CTNNB1信號通路參與該過程。而近幾年對β-catenin與惡性腫瘤的關系的新認識把有關CTNNB1的研究推向新的階段。wnt信號通路在胚胎時期有調(diào)控細胞生長及組織分化的作用，在成體組織中有調(diào)節(jié)干細胞及組織動態(tài)平衡的作用[4]。Wnt信號通路的經(jīng)典調(diào)節(jié)方式之一便是通過CTNNB1蛋白去磷酸化、穩(wěn)態(tài)及轉(zhuǎn)運到胞核內(nèi)發(fā)揮作用[5]。轉(zhuǎn)運入核后的CTNNB1蛋白與T細胞轉(zhuǎn)錄因子(TCF)共同調(diào)節(jié)Wnt信號通路下游靶基因可能引起細胞癌變[6]。研究證明，乳腺癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中CTNNB1蛋白的轉(zhuǎn)位是必不可少的[7]。越來越多的研究提示，CTNNB1編碼蛋白在腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移中可能起著重要的作用[8]。并且近來多項體外、體內(nèi)研究表明，靶向CTNNB1蛋白可在腫瘤早期階段抑制其發(fā)展、轉(zhuǎn)移[9]。

本實驗通過shRNA干擾技術(shù)、Westernblot、MMT方法，進一步證明了在卵巢癌細胞中抑制CTNNB1的表達可有效抑制細胞增殖，提示其可能參與了腫瘤的發(fā)生。

圖1 特異性RNA干擾介導的CTNNB1蛋白表達下降

[1] Chan JK.Patterns and progress in ovarian cancer over 14 years[J].Obstet Gynecol,2006,108(1):521-528.

[2] Rennoll S.Regulation of MYC gene expression by aberrant Wnt/β-catenin signaling in colorectal cancer[J].World J Biol Chem,2015,6(4):290-300.

[3] 劉海艷.CTNNB1基因在卵巢癌組織中的表達及其相關性[J].中國老年學雜志,2016,36(3):99-101.

[4] Deng S.Ginsenoside-Rb1 targets chemotherapy-resistant ovarian cancer stem cells via simultaneous inhibition of Wnt/β-catenin signaling and epithelial-to-mesenchymal transition[J].BMC Cancer,2016,16:863.

[5] Tanabe S.Regulation of CTNNB1 signaling in gastric cancer and stem cells[J].World J Gastrointest Oncol,2016,8(8):592-598.

[6] Clevers H.Wnt/β-catenin signaling and disease[J].Cell,2012,149(6):1192-1205.

[7] Shan S.Wnt/beta-catenin pathway is required for epithelial to mesenchymal transition in CXCL12 over expressed breast cancer cells[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8:12357-12367.

[8] Lee SE.Lumbosacral Plexus Involvement as the First Site of Metastatic Recurrence in a PatientWith CTNNB1-MutantProstate Cancer[J].Oncotarget,2016,19:18632.

[9] Cho YH.KY1022,a small molecule destabilizing Ras via targeting the Wnt/β-catenin pathway,inhibits development of metastatic colorectal cancer[J].Oncotarget,2016,7(10):18632.

Study on the growth of ovarian cancer cells after CTNNB1 gene silencing

Chen Fangxu,Liu Haiyan(Corresponding author),Liu Jianwei
The First Hospital Affiliated to Jinzhou Medical University 121001

Objective:To investigate the effect of CTNNB1 silencing on the proliferation of ovarian cancer cells.Methods:Human ovarian cancer SKOV3 cells were cultured in vitro,and then randomly divided into the blank control group,the negative control group and the CTN experimental group,and then transfected into shRNA vector plasmid targeting CTNNB1.Westernblot and MMT were used to detect the expression of CTNNB1 and cell viability.Results:CTNNB1 targeting shRNA can down regulate the expression of CTNNB1 protein in cells(P＜0.05).After transfection with CTNNB1 shRNA,the cell growth and proliferation of CTN group were significantly inhibited(P＜0.05).Conclusion:Down regulation of CTNNB1 gene can inhibit the proliferation of ovarian cancer SKOV3 cells.

Oophoroma;CTNNB1;ShRNA

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.16.1