康 鵬，張 鵬，王 宇

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院 神經(jīng)外科，北京 100050；2.國家神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100050)

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臨床醫(yī)學(xué)研究

Calumenin在成人腦膠質(zhì)母細胞瘤中的表達及對U87細胞增殖與遷移的作用

康 鵬1，2，張 鵬1，2，王 宇1，2

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院 神經(jīng)外科，北京 100050；2.國家神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100050)

目的 檢測Calumenin在成人腦膠質(zhì)母細胞瘤中的表達，并研究其對膠質(zhì)瘤細胞系(U87細胞株)的細胞生物學(xué)作用。方法 收集成人腦膠質(zhì)母細胞瘤手術(shù)切除標(biāo)本(腫瘤組)和非腦部疾病死亡的人腦組織標(biāo)本(對照組)，RT-qPCR檢測CalumeninmRNA水平，免疫組化染色檢測Calumenin表達；利用RNAi技術(shù)在U87細胞中特異性沉默Calumenin，觀察細胞增殖及遷移變化。結(jié)果Calumenin在人腦膠質(zhì)母細胞瘤中mRNA表達量明顯高于對照組，其免疫組化染色顯示Calumenin蛋白陽性；U87細胞敲除Calumenin后，細胞增殖、遷移能力均顯著下降。結(jié)論Calumenin在人腦額葉膠質(zhì)瘤母細胞瘤中確有表達，其對于膠質(zhì)瘤細胞系的惡性細胞生物學(xué)特征發(fā)揮了重要作用，為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供新的分子生物學(xué)靶點。

Calumenin；膠質(zhì)母細胞瘤；U87；增殖；遷移

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起源于神經(jīng)外胚層的一種原發(fā)腫瘤，其致死率與致殘率均高[1]。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)2007年的腦膠質(zhì)瘤的分級系統(tǒng)[2]將其分為低級別(LGC：Low Grade Glioma)和高級別(HGC:High Grade Glioma)兩大類，其中低級別膠質(zhì)瘤包括I級與II級，惡性程度相對較低；高級別包括III級間變星形與IV級膠質(zhì)母細胞瘤等。目前膠質(zhì)瘤的治療主要依賴于手術(shù)切除，術(shù)后輔助放化療，但整體預(yù)后仍不理想[3]。

鈣腔蛋白(Calumenin，CALU)是一種位于哺乳動物體內(nèi)的低親和力鈣結(jié)合蛋白，與其它四個成員RCN1、RCN2、RCN3和SDF4組成CREC家族，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中表達[4-5]。既往研究顯示CALU參與多個細胞生物學(xué)活動，包括鈣循環(huán)、血管鈣化、細胞遷移及凋亡過程。在鼠的大腦中，CALU僅在胚胎發(fā)育時期表達，到成年時其表達量下降甚至消失[6]。前期預(yù)實驗提示CALU在膠質(zhì)瘤標(biāo)本中有表達，本研究擬對CALU在人腦膠質(zhì)母細胞瘤組織與U87膠質(zhì)瘤細胞系做進一步的檢測，以明確其表達性質(zhì)及在腫瘤惡性度中的分子生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料、試劑與儀器 膠質(zhì)瘤細胞系(U87)由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細胞庫提供；Transwell 6孔板(孔徑8um)購自Corning公司；CALU及β-actin引物、siRNA序列的設(shè)計及合成均由吉瑪公司完成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自全式金公司；MTT試劑盒、Trizol、Lipofectamine2000、DMEM、細胞培養(yǎng)試劑，購自Invitrogen公司；兔單抗-Calumenin抗體(ab137019)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(ab137027)購自abcam公司；蘇木素(C6158)，購自Sigma公司。顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)購自Zeiss公司。蛋白電泳系統(tǒng)購自Bio-Rad；熒光定量PCR儀器為Applied Biosystems? QuantStudio? 3實時熒光定量PCR系統(tǒng)；SpectraMax 190光吸收型酶標(biāo)儀來自Molecular Devices公司；細胞培養(yǎng)箱購自Thermo公司。

1.2 組織標(biāo)本來源 人腦膠質(zhì)母細胞瘤組織(腫瘤組)來源于北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科膠質(zhì)母細胞瘤手術(shù)切除標(biāo)本，入組標(biāo)準(zhǔn)為：①患者年齡18～65歲；②腫瘤位于端腦；③病理類型為膠質(zhì)母細胞瘤(WHO IV級)；④術(shù)前未行放化療。將術(shù)中所取的膠質(zhì)母細胞瘤標(biāo)本用PBS清洗干凈，去除血塊及壞死部分，再次用PBS緩沖液沖洗數(shù)次，保存在液氮中。對照組腦組織來源于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院人腦組織庫中非腦部疾病死亡的患者，其流程均按照國際標(biāo)準(zhǔn)腦組織保存方法進行處理與質(zhì)控[7]。此次研究符合中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院與首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理要求，所有行腫瘤切除患者均知情同意。

1.3 反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測CALUmRNA水平 將部分腦組織標(biāo)本用勻漿器充分研磨混勻后加入TRIzol，按照其說明書提取總RNA，采用紫外分光光度計測定其濃度與純度，電泳檢測其完整性，-80 ℃冰箱保存。通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA進行反轉(zhuǎn)錄制作cDNA，簡述如下。2 ug總RNA加入1 μL Olig(dT)，5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL、dNTP混合物2 μL、RNA酶抑制劑20單位、反轉(zhuǎn)錄酶1μL、RNase-free水至20μL。反應(yīng)條件為42 ℃ 1 h，70 ℃ 10 min，4 ℃保存。

采用SYBR Green PCR kit實時熒光定量PCR，按照說明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60°退火C15 s，72 ℃延伸15 s共40個循環(huán)；以β-actin作為內(nèi)參，采用相對定量法計算CALUmRNA的相對表達量。CALU引物：Forward 5’- CCTCAGCTCAGTGACAAGGT-3’，Reverse 5’-CTGTCGCTCTACATCCTCGT-3’；β-actin引物：Forward 5’-CATTAAGGAG AAGCTGTGCT-3’，Reverse 5’-GTTGAAGGTAGTTTCGT GGA-3’。

1.4 免疫組化染色檢測CALU蛋白表達 兩組腦組織經(jīng)固定、石蠟包埋切成厚10 μm切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。將組織浸入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)，于微波爐內(nèi)微波輻射至沸騰15 min行抗原修復(fù)，再浸泡0.3%過氧化氫10 min。PBS漂洗后用3%血清白蛋白(BSA)封閉1 h，兔抗人CALU抗體(稀釋比1∶500)4 ℃過夜。第2天用HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗孵育，二氨基苯孵育顯色，蘇木素復(fù)染脫水透明，中性樹膠封片。

1.5 U87細胞培養(yǎng) 膠質(zhì)瘤細胞系(U87)使用DMEM培養(yǎng)基，輔助1% L-谷氨酰胺和10%胎牛血清(FBS)，在37 ℃，5% CO2進行培養(yǎng)。細胞傳代時，用0.25%胰蛋白酶進行消化，每4～7天傳代一次。

1.6CALU-siRNA構(gòu)建與篩選 靶向人CALU的加載綠色熒光蛋白的siRNA序列由吉瑪公司設(shè)計并合成，包括三個候選siRNA序列及一個對照siRNA序列。CALU-siRNA-1：5’-GCGCUGGAUUUACGAGGAU-3’，anti-sense 5’-AUCCUCGUAAAUCCA GCGC-3’；CALU-siRNA-2 sense:5’-GCUCAAAGACUGGAUUAAA-3’，anti-sense 5’-UUUAAUCCAGUCUUUGAGC -3’；CALU-siRNA-3 sense 5’- GCAUGACCU CAAUGAGGAC-3’，anti-sense 5’-GUCCUCAUUGAGGUCAUGC-3’。對照序列CALU-scramble sense:5’-GCGUAGGCAUUGAGUCGAU-3’，anti-sense 5’-AUCG ACUCAAUGCCUACGC-3’。

將U87細胞以5×104個/mL種植在培養(yǎng)皿，按照所需濃度將lipofectamine 2 000分別與100 pmol siRNA進行相應(yīng)配制，室溫下靜置30 min后加入每個培養(yǎng)皿中，24 h后通過觀察綠色熒光細胞數(shù)量占視野內(nèi)光鏡細胞比率直接計算轉(zhuǎn)染效率，每孔均能達到>80%。

轉(zhuǎn)染后的U87細胞內(nèi)加入1 mL TRIzol，按照方法1.3提取總RNA，后進行RT-qPCR檢測，以β-actin為內(nèi)參，計算CALU的mRNA相對表達量。轉(zhuǎn)染后的U87細胞用PBS漂洗后加入蛋白裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑，充分震蕩，將裂解細胞收集至1.5 mL離心管，在4 ℃下12,000 g離心后取上清液。將制備好的蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入CALU抗體(1∶500稀釋)，以β-actin作為內(nèi)參對照，4 ℃下過夜。TBST充分洗膜，羊抗兔二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，TBST充分洗膜，滴入化學(xué)發(fā)光劑ECL，圖像分析系統(tǒng)采集分析Calumenin蛋白表達量。組間比較CALUmRNA和蛋白表達進行siRNA序列篩選，確定沉默最佳的siRNA序列。

1.7 轉(zhuǎn)染CALUsiRNA后U87細胞增殖和Transwell侵襲實驗 細胞增殖用MTT試劑盒檢測，取上述轉(zhuǎn)染CALUsiRNA沉默最佳序列和對照序列的U87細胞(各5×104個/mL)分別接種到96孔板，10%FBS的DMEM培養(yǎng)基100 uL。培養(yǎng)24 h、48 h和72后分別加入50 μL 1倍稀釋的MTT液，在37 ℃孵育4 h，吸出上清液，每孔加150 μL DMSO使甲月贊溶解，用平板搖床搖勻。用酶標(biāo)儀在570 nm波長處檢測每孔的光密度。所有實驗均重復(fù)3次。

取轉(zhuǎn)染CALU-siRNA沉默最佳序列與對照序列的U87細胞懸液各2 mL(5×104個/mL)分別加入Transwell小室，下室加1 mL DMEM培養(yǎng)基，37 ℃孵育24 h。后取出下室基底膜，擦去上室內(nèi)細胞，PBS漂洗，甲醇固定30 min，蘇木素溶液行細胞核染色。遷移的細胞數(shù)量在200倍顯微鏡下觀察，每組3個復(fù)孔，每孔隨機觀察5個視野。計算細胞侵襲率(%)=穿膜細胞數(shù)/上室接種的細胞總數(shù)×100%。以對照組遷移率設(shè)定為100%，計算實驗組相對于對照組的遷移率。

2 結(jié)果

2.1CALU在人腦組織中的表達 如圖1B所示，CALU在正常腦組織中并無表達，而在手術(shù)切除的人腦膠質(zhì)母細胞瘤組織標(biāo)本中，免疫組化染色顯示有陽性表達(圖1C)。通過RT- qPCR檢測兩組不同組織中CALUmRNA，結(jié)果顯示CALU在膠質(zhì)瘤中的mRNA表達是其在正常組織中的(4.971 ± 0.5012)倍(P<0.001)。

A：CALU mRNA在膠質(zhì)母細胞瘤中表達是正常組織的4.97倍(P<0.001)；B：成人正常腦組織CALU免疫組化染色；C：成人腦膠質(zhì)母細胞瘤組織CALU免疫組化染色。圖1 CALU在成人正常腦組織與膠質(zhì)母細胞瘤組織中的表達(×40)

2.2CALU-siRNA序列的篩選 為進一步研究CALU在膠質(zhì)瘤中的作用，本課題設(shè)計了能夠沉默CALU表達的siRNA序列。經(jīng)過篩選，如圖2所示，相對于對照序列，CALU-siRNA-2序列可將CALUmRNA降低75%以上，Western blot也證實CALUsiRNA-2序列能夠顯著降低U87細胞中的CALU蛋白表達，因此，本課題選擇CALU-siRNA-2序列進行后續(xù)實驗。

A：CALU-siRNA序列轉(zhuǎn)染U87細胞后CALU mRNA水平，B：CALU-siRNA序列轉(zhuǎn)染U87細胞后CALU蛋白表達；1：空白對照；2.Scramble siRNA；3.CALU-siRNA-1；4.CALU -siRNA-2；5.CALU-siRNA-3。圖2 CALU-siRNA序列篩選

2.3CALU-siRNA轉(zhuǎn)染U87細胞后增殖顯著下降 將U87細胞種植于96孔培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染最佳CALU-siRNA序列后每24小時測量細胞增殖率變化情況。如圖3所示，在轉(zhuǎn)染后24 h，沉默組的增殖比率已顯著小于對照組，這個現(xiàn)象在轉(zhuǎn)染后的72 h差異達到58%(P<0.001)。

2.4CALU-siRNA轉(zhuǎn)染U87細胞后遷移能力顯著下降 通過transwel檢測CALU-siRNA轉(zhuǎn)染后對U87細胞遷移的影響(見圖4)。轉(zhuǎn)染后24 h可見CALU-siRNA組的遷移能力顯著小于對照組，約為后者的38.5%(P<0.001)。

*P<0.01， #P<0.001。圖3 沉默CALU后U87細胞增殖情況

A:對照組;B:CALU-siRNA組;C:沉默CALU后U87細胞遷移能力， *P<0.001。圖4 沉默CALU后U87細胞遷移情況(×40)

3 討論

膠質(zhì)母細胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種惡性腫瘤，其生存期短、致殘率高的特點一直困擾著醫(yī)學(xué)臨床與科研者。通過大規(guī)?；蚪M學(xué)測序，與膠質(zhì)母細胞瘤惡性程度相關(guān)的基因被不斷發(fā)現(xiàn)，對這種惡性腫瘤發(fā)生機制的認識不斷更新與闡明。基于前期預(yù)實驗，我們通過本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CALU在成人膠質(zhì)母細胞瘤組織中有高表達，并且在U87膠質(zhì)瘤細胞系中的分析顯示其可能直接參與到腫瘤惡性程度的機制中。

CALU是位于哺乳動物體內(nèi)的一種低親和力鈣結(jié)合蛋白。在心臟、胎盤和骨骼肌中表達量最高，其次是在肺、腎和胃，而在大腦和肝臟中表達最少[8]。在Vasiljavic的研究中，CALU在胚胎小鼠的大腦中的表達量可與其富含的心臟相比，但此表達量隨著小鼠發(fā)育的成熟卻逐漸下降，到成年時最低，通過Western blot方法幾乎測不出來[6]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中CALU在腦室周圍的表達量最高，此區(qū)域一直被認為是神經(jīng)干細胞的發(fā)源地[9]。在胚胎期的小鼠腦齒狀回中，陽性表達CALU的細胞集中于NeuN陰性、GFAP陽性細胞中，證實CALU主要還是在膠質(zhì)細胞中表達。值得注意的是，生理情況下CALU可以被分泌至外周血中，通過自分泌與旁分泌方式對細胞骨架起調(diào)控作用[10]，但在神經(jīng)系統(tǒng)中其作用機制仍在研究中。本研究在正常人腦組織中沒有檢測到CALU的表達，與前述動物研究結(jié)果一致，但在人腦膠質(zhì)母細胞瘤組織證實了CALU的陽性表達。Sreekanthreddy等[11]曾提示膠質(zhì)母細胞瘤患者血清中CALU的表達量明顯升高，并且與預(yù)后直接呈正相關(guān)性，這與本研究結(jié)果在一定程度上具有關(guān)聯(lián)性。本研究通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)CALU在成人正常腦組織中無表達，而在膠質(zhì)母細胞瘤中卻呈陽性表達，故而推測CALU的表達升高在膠質(zhì)母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用，同時可能對患者預(yù)后有一定影響，但這個假設(shè)需要臨床隨訪記錄進一步的驗證。

通過RT-qPCR檢測方法我們發(fā)現(xiàn)CALU在人腦膠質(zhì)母細胞瘤中mRNA表達量是其正常腦組織的近5倍。有意思的是，通過文獻回顧我們發(fā)現(xiàn)，CALU在不同類型腫瘤中的表達也存在差異性，如在頭頸部的鱗狀細胞癌[12]、子宮內(nèi)膜癌[13]、肝細胞癌和胰腺癌[14]中其表達呈遞減趨勢，而在結(jié)腸癌中卻呈高表達狀態(tài)[15]。我們推測這種差異可能與CALU在不同腫瘤組織中的作用不同有關(guān)。另外，已有研究發(fā)現(xiàn)CALU具有15個不同的mRNA剪切體[16]，其在不同腫瘤組織中的差異性表達也許還與不同的剪切體變化量有關(guān)。為研究CALU缺失可能對腫瘤細胞增殖與遷移的影響，我們設(shè)計CALU-siRNA序列并轉(zhuǎn)染U87細胞，檢測其對U87細胞增殖和遷移的作用，為下一步治療靶點選擇實驗打下基礎(chǔ)。同時，本實驗也直接證實了U87膠質(zhì)瘤細胞系中確實有CALU基因表達。

作為腫瘤的兩大特征，增殖與遷移能力在各項腫瘤研究中被廣泛評估。通過沉默CALU表達后發(fā)現(xiàn)，U87細胞的增殖與遷移能力均顯著降低，這一結(jié)果提示CALU可直接影響膠質(zhì)瘤細胞的惡性程度，但是其機制目前不清。有研究提示在肝細胞癌中CALU與Fabulin-1協(xié)同作用于細胞遷移[14]；另外的研究結(jié)果也提示CALU在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表達并影響細胞遷移，在心肌肌漿網(wǎng)中，CALU可通過SERCA2來調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流，進而可能影響細胞增殖[17]。但考慮到不同腫瘤組織CALU的表達量也不同，有可能其機制不能通過前述研究來解釋。尤其是膠質(zhì)母細胞瘤為不均一腫瘤，其瘤內(nèi)異質(zhì)性極大，所以CALU的作用也有可能不盡相同，這些都需要進一步的后續(xù)研究進行闡明。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CALU在成人腦膠質(zhì)母細胞瘤中高表達，且細胞生物學(xué)研究顯示其對腫瘤細胞增殖及遷移產(chǎn)生影響，隨著對CALU的研究深入，可能為將來的基因治療或生物藥物研發(fā)提供了一個潛在靶點。

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[收稿2017-04-15;修回2017-05-10]

(編輯：王福軍)

Expression ofCalumeninin human glioblastoma and functional study in cellular activities in U87 cells

KangPeng1,2，ZhangPeng1,2，WangYu1,2

(1.Department of Neurosurgery,Beijing Tiantan Hospital,Capital Medical University， Beijing 100050 ，China; 2.China National Clinical Research Center for Neurological Diseases，Beijing 100050，China)

Objective To examine the expression of Calumenin in adult human glioblastoma tissues and further investigate the cytobiological function in U87 cellsinvitro.Methods Human tissues were collected from surgically resected glioblastoma (tumor group) located or non brain diseases (control group).Quantitative real-time PCR and immunohistochemical staining were carried out to detect the expression of Calumenin in human glioblastoma (GBM) samples resected from adult frontal lobe.The phenotypic changes of U87 cells like proliferation and migration were investigated in the absence of Calumenin mediated by RNAi.Results The results showed that Calumenin mRNA level in human GBM was significantly higher by approximately 5 fold (P<0.001) than normal brain post-mortem tissue samples.The protein level was verified by immunohistochemistry in GBM tissues.After Calumenin was knocked down by RNAi,U87 MG cells manifested a significant decrease in proliferation and migration ratesinvitro.Conclusion Our data indicated that Calumenin was involved in the regulation of glioblastomainvitroand it may serve as an important potential therapeutic target for treatment.

Calumenin; glioblastoma; U87; proliferation; migration

北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)資助(青年骨干)項目(NO:2015000021469G221)。

王宇，男，博士，研究方向：大腦膠質(zhì)瘤的臨床治療與分子生物學(xué)機制， E-mail:zlzxwy@sina.com。

R739.41

A

1000-2715(2017)03-0292-05