顏俊文，陳 瀾，王艷英，龔其海，劉 杰，石京山，張 鋒

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，廣東 珠海 519100)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

安宮牛黃丸對大鼠腦缺血再灌注損傷和腦外傷的保護作用

顏俊文1,2，陳 瀾1，王艷英1，龔其海1，劉 杰1，石京山1，張 鋒1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，廣東 珠海 519100)

目的 研究安宮牛黃丸對腦缺血再灌注損傷和腦外傷大鼠的保護作用。方法 成年雄性SD大鼠連續(xù)7 d灌胃給予安宮牛黃丸，灌胃第4天線栓法致腦缺血1 h再灌注72 h后檢測大鼠行為學(xué)、腦梗死百分比及腦組織炎癥因子腫瘤壞死因子α (TNF-α)、白介素-1β (IL-1β)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表達。此外，大鼠連續(xù)7 d灌胃給予安宮牛黃丸后，采用重物打擊法誘導(dǎo)大鼠腦外傷模型，24 h后檢測大鼠行為學(xué)改變并通過real time RT-PCR檢測腦內(nèi)炎癥因子TNF-α、IL-1β和iNOS mRNA的表達。結(jié)果 與腦缺血再灌注損傷模型組比較，安宮牛黃丸 (1.5 g/kg) 能夠改善模型大鼠行為學(xué)改變，減少大鼠腦梗死面積，下調(diào)腦組織內(nèi)TNF-α、IL-1β 和iNOS mRNA的表達；與腦外傷模型組比較，安宮牛黃丸 (1.5 g/kg) 可以改善大鼠行為學(xué)改變，下調(diào)腦組織內(nèi)TNF-α、IL-1β和iNOS mRNA的表達。結(jié)論 安宮牛黃丸對大鼠腦缺血再灌注損傷和腦外傷有保護作用。

安宮牛黃丸；缺血再灌注損傷；腦外傷；炎癥因子表達；SD大鼠

腦外傷和腦缺血屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)急癥,具有死亡率高和致殘率高的特點。研究發(fā)現(xiàn)腦外傷后都有不同程度的顱內(nèi)壓增高,腦灌注壓降低、腦缺血、缺氧,以后的病理過程與腦缺血相似[1]。然而，兩者確切的發(fā)病機制及內(nèi)在聯(lián)系尚未完全闡明清楚。安宮牛黃丸應(yīng)用于治療腦外傷和腦缺血歷史悠久[2]。安宮牛黃丸全方由牛黃、郁金、犀角、麝香、珍珠、梔子、黃連、黃芩、冰片、雄黃和朱砂11味藥組成，是我國傳統(tǒng)藥物中最負盛名的急癥用藥，具有清熱解毒、護肝、抗炎消腫、強心、擴張血管、鎮(zhèn)靜、抗驚厥等作用[3]。由于其含雄黃和朱砂，因此在國際市場被列為禁藥。目前國內(nèi)部分研究主張去除雄黃和朱砂，而我們前期的研究工作表明：雄黃和朱砂的毒性不能與其他常見砷、汞化合物毒性相提并論[4-5]。本研究旨在探討安宮牛黃丸對大鼠腦缺血再灌注損傷和腦外傷是否具有保護作用，為此類中成藥提供藥效學(xué)的理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 安宮牛黃丸購自貴陽德昌祥制藥公司(批號20070915)。

1.2 動物 清潔級雄性SD大鼠72只、2月齡、體重(260±20)g，購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心(合格證號：0004323)。常規(guī)大鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.3 試劑 Trizol、RNA純化試劑盒以及所有引物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；大鼠大腦中動脈閉塞(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)栓線購自北京沙東生物公司。

1.4 儀器 實時熒光定量PCR儀(美國Bio-rad公司，型號：CXF content)；超速冷凍離心機(美國Beckman公司，型號：Microfuge 22R)；Leica圖像分析系統(tǒng)(德國Leica公司，型號：Qwin Pro)。

1.5 方法

1.5.1 腦缺血再灌注損傷實驗

1.5.1.1 實驗分組及給藥 雄性SD大鼠隨機分成3組(n=8)：空白對照組、模型組、安宮牛黃丸組(1.5 g/kg)。大鼠每天灌胃給藥1次，于第4天灌胃給藥后采用MCAO線栓法造模，造模后繼續(xù)灌胃給藥3 d，給藥結(jié)束的第2天進行行為學(xué)檢測。空白對照組給予與藥物等體積的生理鹽水灌胃，共7 d。

1.5.1.2 腦缺血再灌注動物模型 大鼠用10%水合氯醛麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺上，絡(luò)合碘常規(guī)消毒皮膚，正中偏右切開頸部皮膚，鈍性分離皮下組織至右側(cè)頸總動脈，沿頸總動脈向遠心端分離至頸內(nèi)、頸外動脈分叉，再向前分離少許，在動總動脈、頸外動脈下置絲線，結(jié)扎頸總動脈近心端、頸外動脈，動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，用眼科鑷從頸總動脈插MCAO線至大腦中動脈(以頸內(nèi)、外動脈交叉處為標志，往里插入1.8 cm)，1 h后將栓線拔出約1 cm并剪斷[6]，進行再灌注72 h。

1.5.1.3 行為學(xué)檢測 將大鼠行為學(xué)評分分為6個等級[7]:0=大鼠未見活動異常；1=左前肢不能完全伸直；2=左前肢阻力減小,行走偏左側(cè)；3=左側(cè)旋轉(zhuǎn)行走；4=原地左旋；5=完全性左癱。

1.5.1.4 大腦梗死面積及重量比檢測 評分后將大鼠麻醉處死，斷頭迅速取出大腦，放入-20 ℃冰箱中速凍20 min，用刀片把大腦冠狀平均切成5片，放入盛有1%四氮唑紅(2,3,5-Triphenyltetrazoliumchloride,TTC)溶液的玻璃瓶中，置37 ℃烤箱孵育約30 min(中途翻轉(zhuǎn)2次)，非梗死區(qū)域被染成紅色，梗死區(qū)沒有被染上色而成白色。染色后，棄去TTC溶液，加入10%甲醛溶液，固定24 h后拍照，采用Image-ProPlus 5.0圖像分析軟件分析梗死面積。最后取出腦片，用濾紙吸除表面水分，分離大腦梗死區(qū)與非梗死區(qū)，分別稱重，以大腦梗死部分重量比(梗死部分重量/大腦總重量)進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5.1.5 Real-time RT-PCR檢測腦組織TNF-α、IL-1β和iNOS mRNA水平 大鼠腦缺血1 h 再灌注72 h后取大鼠全腦檢測腦組織內(nèi)腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-1β (IL-1β) 和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 (iNOS) mRNA的表達。采用Trizol一步法從腦組織中提取總RNA，再用RNA純化柱進一步純化。用紫外分光光度儀檢測RNA純度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，采用MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶和OligodT為探針進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為： 25℃，10 min； 48℃，60 min； 95 ℃，5 min；產(chǎn)物cDNA 4 ℃保存。通過Icycler IQ 實時熒光定量PCR儀擴增：95 ℃預(yù)變性10 min； 95 ℃變性10 s；60 ℃退火1 min[8]?；蛐蛄腥绫?1，以β-actin為內(nèi)參。具體計算方法如下：以cycle time (Ct)值為統(tǒng)計參數(shù)依次計算下列數(shù)據(jù)：① Ct average =(Ct1+Ct2+Ct3)/3(重復(fù)管)；② dCt =Ct average-中間值；③ 基因的表達=2^(-dCt)；④ 相對定量=目的基因的表達/內(nèi)參基因的表達。

表1 引物序列

名稱基因序號上游下游β-actinV01217TCCTCCTGAGCGCAAGTACTCTGCTCAGTAACAGTCCGCCTAGAATNF-αX66539TCGTAGCAAACCACCAAGCACCCTTGAAGAGAACCTGGGAGTAiNOSL12562GTGCTAATGCGGAAGGTCATGCGCTTCCGACTTTCCTGTCTIL-1βNM_031512CACCTCTCAAGCAGAGCACAGAGGGTTCCATGGTGAAGTCAACT

1.5.2 腦外傷實驗

1.5.2.1 實驗分組及給藥 2月齡雄性SD大鼠，體重250～350 g，隨機分為空白對照組、模型組、安宮牛黃丸組(1.5 g/kg)，每組8只大鼠。造模前1周每天灌胃給藥1次，共7 d，給藥結(jié)束的第2天進行行為學(xué)檢測；空白對照組和模型組給予藥物等體積的生理鹽水灌胃。

1.5.2.2 動物模型制備 采用改進后的Feeney自由落體腦損傷裝置，造成中度腦損傷[9]，具體方法和步驟為：7%水合氯醛麻醉，將大鼠固定于立體定位儀上，剪毛后消毒鋪巾，矢狀切開頭皮，顯露左頂骨，于中線左側(cè)旁開約2.5 mm，前囪后約2.5 mm處鉆開顱骨，保護硬膜完整，擴大骨窗至直徑約5 mm。用20 g聚乙烯擊錘從30 cm高處撞擊頭，造成左側(cè)大腦半球中度腦損傷。撞擊后，大鼠出現(xiàn)短暫的四肢抽搐、呼吸暫停數(shù)秒鐘，表明致傷成功，隨后清創(chuàng)、止血，縫合頭皮，動物清醒后分籠喂養(yǎng)。

1.5.2.3 腦外傷后行為學(xué)檢測 通過抓握牽引實驗和平衡木實驗觀察大鼠腦外傷行為學(xué)改變[9]。抓握牽引實驗的評分標準為：0=緊緊抓住繩子并迅速爬上；1=用后爪抓住繩子試圖爬上，時間超過60 s；2=不依靠后爪懸掛在繩子上，時間超過60 s；3=懸掛30～60 s摔落；4=懸掛在30 s之內(nèi)摔落。平衡木實驗的評分標準為：0分=穩(wěn)健地保持平衡；1分=可以保持一個穩(wěn)定的姿勢并維持60 s；2分=抱住平衡木超過60 s；3分=試圖保持平衡，但在30～60 s滑落；4分=試圖保持平衡，但在30 s之內(nèi)滑落。將兩種行為學(xué)檢測的分數(shù)相加即為大鼠的最終得分，分數(shù)范圍為0～8分。

1.5.2.4 Real-time RT-PCR檢測TNF-α、IL-1β 和iNOS mRNA水平 大鼠腦外傷模型建立24 h后取大鼠全腦檢測腦組織TNF-α、IL-1β 和iNOS mRNA的表達水平。方法同1.5.1.5。

2 結(jié)果

2.1 安宮牛黃丸對腦缺血再灌注損傷大鼠行為學(xué)的影響 與空白對照組相比，模型組行為學(xué)分數(shù)明顯增高(P<0.05)；與模型組相比，安宮牛黃丸明顯降低行為學(xué)分數(shù)(P<0.05，見表2)。

組別劑量(g/kg)行為學(xué)評分空白對照00模型04.5±1.2#安宮牛黃丸1.52.8±1.1*

#：與空白對照組比較，P<0.05; *：與模型組比較，P<0.05。

2.2 安宮牛黃丸對腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死面積及重量比的影響 如圖1和表 3所示，與空白對照組比較，模型組腦梗死面積較大；與模型組比較，安宮牛黃丸組腦梗死面積縮小。此外，與空白對照組相比，模型組梗死重量比明顯增高(P<0.05)；與模型組相比，安宮牛黃丸明顯減少腦梗死重量比(P<0.05)。

2.3 安宮牛黃丸對缺血再灌注損傷大鼠腦組織炎癥因子mRNA表達的影響 與空白對照組比較，模型組TNF-α(10倍)、iNOS(20倍)和IL-1β(25倍)mRNA的表達明顯增高；與模型組相比，安宮牛黃丸明顯降低TNF-α、iNOS和IL-1β mRNA的表達(P<0.05)，抑制率分別為33%、48%和43%(見表3)。

圖1 安宮牛黃丸對腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死面積的影響

組別劑量(g/kg)梗死面積百分比(%)梗死部分重量比(%)TNFαiNOSIL-1β空白對照0008.7±0.65.4±0.33.6±0.5模型016.3±3.5#0.13±0.02#100.0±9.8#100.0±11.2#100.0±12.4#安宮牛黃丸 1.5 8.2±2.1*0.08±0.02* 67.2±5.3*52.1±6.8*56.7±4.5*

#：與空白對照組比較，P<0.05;*：與模型組比較，P<0.05。腦組織炎癥因子mRNA表達是以模型組的表達值為100%，其他組與其進行比較。

2.4 安宮牛黃丸對腦外傷大鼠行為學(xué)的影響 與空白組比較，模型組行為學(xué)分數(shù)明顯增高(P<0.05)；與模型組相比，安宮牛黃丸明顯降低行為學(xué)分數(shù)(P<0.05，見表4)。

2.5 安宮牛黃丸對腦外傷大鼠炎癥因子TNF-α、iNOS和IL-1β mRNA表達的影響 與空白對照組比較，模型組TNF-α(5倍)、iNOS(14倍)和IL-1β(25倍)mRNA的表達明顯增高；與模型組相比，安宮牛黃丸明顯降低TNF-α、iNOS和IL-1β mRNA的表達(P<0.05)，抑制率分別為49%、61%和58%(見表4)。

組別劑量(g/kg)行為學(xué)評分TNFαiNOSIL-1β空白對照00.9±0.919.2±3.46.2±0.74.1±0.5模型05.1±0.9#100.0±11.2#100.0±8.2#100.0±6.8#安宮牛黃丸1.52.8±1.4*51.4±7.2*38.5±5.6*42.3±5.1*

#：與空白對照組比較，P<0.05;*：與模型組比較，P<0.05。腦組織炎癥因子mRNA表達是以模型組的表達值為100%，其他組與其進行比較。

3 討論

研究防止腦外傷和腦缺血再灌注后神經(jīng)損傷的藥物，尋找有效的方法促進神經(jīng)元的功能恢復(fù)，一直是相關(guān)生命學(xué)科研究的重要課題。但因腦外傷和腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)修復(fù)機制十分復(fù)雜，然而臨床上一直缺少療效較好的藥物。對于缺血性腦血管疾病，其是一個復(fù)雜的病理過程，缺血造成大腦損傷，再灌注進一步加重大腦損傷。大量證據(jù)顯示自由基損傷、能量衰竭、酸中毒、細胞內(nèi)Ca2+超載、興奮性氨基酸毒性反應(yīng)等與腦缺血/再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]。安宮牛黃丸是中藥中極負盛名的急癥用藥，是中醫(yī)治療高熱癥的“瘟病三寶”之一，臨床上主要用于治療高熱昏迷、腦出血、腦卒中[3]。最近研究發(fā)現(xiàn)安宮牛黃丸能夠降低谷氨酸損傷神經(jīng)元丙二醛(MDA)含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[11]。此外，安宮牛黃丸通過降低腦血腫周圍組織含水量，提高紅細胞變形能力，進而改善大鼠腦出血的神經(jīng)功能障礙[12]。本研究發(fā)現(xiàn)安宮牛黃丸能夠改善大鼠腦缺血再灌注損傷后的行為學(xué)變化，并減少腦梗死面積，表明安宮牛黃丸對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。另外，本研究發(fā)現(xiàn)安宮牛黃丸對大鼠腦外傷模型具有保護作用。腦外傷是一種臨床上常見、死亡率高、后遺癥多的神經(jīng)損傷。目前腦外傷和腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機制尚未闡明。最新的研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)炎癥反應(yīng)在腦外傷后繼發(fā)性腦損傷以及缺血再灌注損傷的病理生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。而膠質(zhì)細胞尤其是小膠質(zhì)細胞被認為是神經(jīng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[14]。腦外傷和腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，小膠質(zhì)細胞激活并釋放大量炎性介質(zhì)，如TNF-α、IL-1β、NO以及各種活性氧自由基等。這些炎癥介質(zhì)的不斷產(chǎn)生和積累從而決定了周圍神經(jīng)元的存亡。然而，受損的神經(jīng)元同時可以釋放多種毒性物質(zhì)，這些毒性物質(zhì)能夠進一步誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞的激活，激活的小膠質(zhì)細胞又可以再次釋放炎癥介質(zhì)。綜上所述，抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)將成為治療腦外傷和腦缺血再灌注損傷的重要靶點之一。本研究顯示安宮牛黃丸能夠改善腦外傷和腦缺血再灌注損傷大鼠的行為學(xué)改變，且抑制腦組織中炎癥因子IL-1β、TNF-α和iNOS mRNA 的表達；推測安宮牛黃丸可能通過減輕炎癥反應(yīng)，從而對腦外傷和腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護作用。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)安宮牛黃丸對大鼠腦缺血再灌注損傷和腦外傷具有保護作用，為安宮牛黃丸的臨床應(yīng)用提供了藥效學(xué)依據(jù)，但其產(chǎn)生的神經(jīng)保護作用機制還有待于進一步的研究。

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[收稿2017-03-23;修回2017-05-12]

(編輯：王靜)

Protective effects of Angongniuhuang Wan on cerebral ischemia-reperfusion injury and traumatic brain injury in rats

YanJunwen1,2,ChenLan1,WangYanying1,GongQihai1,LiuJie1,ShiJingshan1,ZhangFeng1

(1.Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education and Joint International Research Laboratory of Ethnomedicine of Ministry of Education,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Department of Neurology,Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zhuhai Guangdong 519100,China)

Objective To study the effects of Angongniuhuang Wan (AGNHW) on cerebral ischemia-reperfusion and traumatic brain injury in rats.Methods Adult Sprague-Dawley (SD) rats were orally given AGNHW for consecutive 7 d.Brain ischemia was induced by middle cerebral artery occlusion (MCAO) through the suture-occluded method for 1 h followed by reperfusion for 72 h at the 4th day of AGNHW administration.The behavior,brain infarction areas and inflammatory factors mRNA expressions were tested.Moreover,rat traumatic brain injury was induced by dropping a 20 g weight from 20 mm heights after orally administration of AGNHW for consecutive 7 d.Twenty-four h later,the behavior was observed and rat brain inflammatory factors mRNA expressions were examined through real-time RT-PCR.Results In ischemia-reperfusion injury model,AGNHW (1.5 g/kg) was effective in improving the behavioral abnormality and reduced the infarction rate and suppressed the mRNA expressions of tumor necrosis factor (TNF-α),interleukin-1β (IL-1β) and inducible nitric oxide synthase (iNOS).In traumatic brain injury model,AGNHW (1.5 g/kg) attenuated rat behavior abnormality and inhibited TNF-α,IL-1β and iNOS mRNA expressions.Conclusion AGNHW is effective against cerebral ischemia-reperfusion and traumatic brain injury in rats.

Angongniuguang Wan; cerebral ischemia-reperfusion injury; traumatic brain injury; inflammatory factors expression; SD rat

國家自然科學(xué)基金資助項目(NO:81460556)；貴州省教育廳創(chuàng)新群體重大研究項目(NO:黔教合KY字[2016]038)；貴州省高層次創(chuàng)新人才項目(NO:黔科合人才[2016]4027)。

張鋒，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail:zhangf@zmc.edu.cn。

R966

A

1000-2715(2017)03-0249-05